מבנה גבישי של N-מסוף תחום של Ryanodine הקולטן של Plutella xylostella

Summary

במאמר זה, אנו מתארים את הפרוטוקולים של נחישות ביטוי, טיהור, התגבשות ומבנה חלבון של התחום N-מסוף של קולטן ryanodine מ- diamondback עש (Plutella xylostella).

Abstract

פיתוח חומרי הדברה חזק ויעיל מיקוד קולטנים ryanodine חרקים (RyRs) היה עניין רב בתחום הדברה חקלאיים. נכון להיום, מספר קוטלי חרקים diamide מיקוד המזיק שחייב להיות ממוסחר RyRs, אשר מפיקים הכנסות שנתיות של 2 מיליארד דולר. אבל הבנה של מצב הפעולה של פילוח RyR קוטלי חרקים הוא מוגבל על ידי חוסר של מבני מידע לגבי חרקים RyR. זה בתורו מגבילה את ההבנה של ההתפתחות של עמידות חרקים מזיקים. העש diamondback (DBM) הוא נודניק הרסנית השמדת יבולים המצליבים ברחבי העולם, אשר דווחה גם להראות התנגדות הדברה diamide. לכן חשיבות מעשית רבה לפתח הדברה חדשניים מיקוד RyR DBM, במיוחד לעבר אזור שונים מתוך אתר איגוד diamide המסורתי. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לאפיין מבחינה מבנית המחשבים N-מסוף של RyR מ DBM. המבנה נפתרה על-ידי החלפת מולקולרית ברזולוציה של 2.84, אשר מציגה את מוטיב מתקפלים בטא-trefoil, סליל אלפא איגוף. פרוטוקול זה ניתן להתאים את הביטוי, טיהור, אפיון מבניים של קבוצות מחשבים או חלבונים אחרים באופן כללי.

Introduction

קולטנים Ryanodine (RyRs) הם תעלות יונים וברצפטורים ספציפיים, אשר לתווך על הסתננות של Ca^{2 +} יונים על-פני הממברנות sarcoplasmic רשת (SR) בתאי השריר. לכן, הם לשחק תפקיד חשוב להתכווצות עירור צימוד תהליך. בצורתו פונקציונלי, RyR מרכיב כמו הומו-tetramer עם מסה מולקולרית של > מד א 2, עם כל יחידה משנית הכוללת של שאריות חומצה אמינית ~ 5000. ביונקים, ישנם שלושה איזופורמים: RyR1 מסוג שרירי השלד, שריר הלב סוג RyR2 - ו RyR3-ubiquitously לידי ביטוי ברקמות שונות¹.

חרקים יש רק סוג אחד של RyR, הבאה לידי ביטוי רקמות שרירים, עצבים². RyR חרקים הוא דומה יותר RyR2 בתרבית של זהות רצף כ- 47%³. הדברה Diamide מיקוד RyR של פרפראים הזבוביים וקשיי יש כבר פותחו ומשווקים על ידי חברות גדולות כמו באייר (flubendiamide), דופונט (chlorantraniliprole) והפריבט (cyantraniliprole). מאז השקתה יחסית לאחרונה, הדברה diamide הפכו להיות אחד של המעמד הצמיחה המהירה של קוטלי חרקים. נכון לעכשיו, המכירות של אלה של שלושה קוטלי חרקים מדי שנה חצו 2 מיליארד דולר ארה עם קצב גידול של למעלה מ-50% מאז 2009 (Agranova).

מחקרים שנעשו לאחרונה דיווחו על ההתפתחות של עמידות חרקים לאחר כמה דורות של השימוש האלה קוטלי חרקים^4,5,-^6,-^7,-⁸. ההתנגדות מוטציות בתחום transmembrane של RyRs העש diamondback (DBM), Plutella xylostella (G4946E, I4790M), את עמדות המקביל האילוח עגבניות, Tuta absoluta (G4903E, I4746M) מראים כי האזור יכול להיות מעורב diamide קוטל חרקים מחייב כמו אזור זה ידוע להיות קריטי עבור gating של ערוץ^4,8,9. למרות מחקר מקיף בתחום זה, המנגנונים המולקולריים המדויק של קוטלי חרקים diamide נשארים חמקמקים. יתר על כן, לא ברור מוטציות עמידות להשפיע את האינטראקציות עם diamides ישירות או allosterically.

מחקרים מוקדמים יותר דיווחו על המבנה של מספר תחומים RyR של יונקים ואת המבנה של RyR1 יונקים באורך מלא, RyR2 על ידי קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן ואלקטרון הקפאה-, בהתאמה^{10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21} . אבל עד כה, אין מבנה של חרק RyR דווחה, אשר אוסרת עלינו. הבנת המורכבות מולקולרית של הפונקציה קולטן וכן את המנגנונים המולקולריים של פעולה בקוטלי חרקים, התפתחות של עמידות חרקים.

כתב יד זה, אנו מציגים עבור אפיון מבניים N-מסוף תחום β-trefoil של קולטן ryanodine מ- diamondback העש, נודניק הרסני מדביק המצליבים יבולים ברחבי העולם²²פרוטוקול מוכללת. הבונה עוצבה בהתאם את הארנב שפורסם RyR1 NTD קריסטל מבנים^23,24ו של הקפאה-EM מודלים מבניים^{16,17,18,19, 20 , 21}. זה המבנה ברזולוציה גבוהה הראשון שדווחו עבור חרקים RyR, אשר חושף את המנגנון עבור ערוץ gating מספק תבנית חשוב לפיתוח חומרי הדברה תלויי מין באמצעות עיצוב מבוסס על מבנה סמים. עבור מבנה הבהרה, אנחנו מועסקים קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן, אשר נחשב "תקן הזהב' לקביעת מבנה החלבון-ליד ברזולוציה אטומית. למרות תהליך התגבשות הוא צפוי ועבודה אינטנסיבית, פרוטוקול שלב אחר שלב זה תסייע לחוקרים אקספרס, לטהר ולאפיין תחומים אחרים של חרק RyR או כל לחלבונים אחרים באופן כללי.

Protocol

1. ג'ין שיבוט, ביטוי חלבונים וטיהור

1. PCR להגביר את הדנ א המתאים חלבון עניין (1-205 שאריות DBM RyR, Genbank בדיקת. לא. AFW97408) ולשכפל לתוך pET-28a-HMT וקטורי מצדו שאינו תלוי שיבוט בעצימות²⁵. וקטור זה מכיל תג היסטידין, תג MBP, אתר המחשוף פרוטאז אס-אמיני¹⁵-
   1. עיצוב תחל LIC עבור הגברה של היעד גנים עם LIC תואמי 5' הרחבות:
      LIC פריימר לפנים:
      5' TACTTCCAATCCAATGCAATGGCGGAAGCGGAAGGGG 3'
      הפוך LIC פריימר:
      5' TTATCCACTTCCAATGTTATTATATGCCGGTCCCGTACGGC 3'
   2. שילוב הרכיבים התגובה (50 μL): μL 1 של ה-DNA תבניות (100 ng/μL), μL 1 של פריימר לפנים (10 μM), μL 1 של פריימר הפוכה (10 μM), 0.5 μL של ה-DNA פולימראז (נב), 5 μL של תגובה 10 x מאגר, μL 1 של dNTP (25 מ מ) , 40.5 μL של RNase חינם ddH₂O.
      1. מניחים את תערובת התגובה במכונת ה-PCR ולהפעיל את התוכנית הבאה.
      2. דגירה ב 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות ולאחר מכן הפעל 30 מחזורי (95 ° C ל 30 s, 58 ° C 15 s, 72 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה). דגירה ב-72 מעלות למשך 5 דקות ולאחר מכן החזק ב 4 º C.
      3. להפעיל את תערובת התגובה כולה (50 μL) על 2% agarose ג'ל ולחלץ בעזרת ערכת חילוץ ג'ל. פעלתי לפי הנהלים של היצרן
   3. מצדו תלויית שיבוט (LIC)
      1. לבצע SspI עיכול (60 μL): 20 μL של וקטור דנ א (50 ng/μL), μL 6 של 10 x תגובת מאגר, μL 4 של SspI ו 30 μL של ddH₂O. Incubate ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 ח' להפעיל את התגובה כולה לערבב על 1% agarose ג'ל, לחלץ עם ערכת חילוץ ג'ל. פעלתי לפי הנהלים של היצרן
      2. לבצע טיפול T4 DNA פולימראז של וקטור והכנס את הדנ א. לשלב הבא: 5 μL של ה-DNA וקטוריים או הוספה (50 ng/μL), μL 2 10 מאגר ה-DNA פולימראז x T4, 1 μL של dGTP (25 מ מ) עבור וקטור או 1 μL של dCTP (25 מ מ) הוספת ה-dna μL 1 של DTT (100 מ מ), 0.4 μL של T4 DNA פולימראז (מוסמך LIC) , ו- 9.6 μL של ddH₂O. Incubate תגובות בטמפרטורת החדר במשך 40 דקות חום-בטל אנזים ב 75 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
         הערה: וקטור LIC והוספה DNA יש לטפל בתגובות נפרדים.
      3. לבצע את LIC חישול התגובה. לשלב הבא: 2 μL של הוספה שטופלו T4 DNA, 2 μL של T4 שטופלו LIC וקטור הדנ א. דגירה התגובה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
2. להפוך את BL21 (DE3) e. coli תאים עם זה פלסמיד רקומביננטי.
   1. הפשרת המוסמכת תאים (50 μL בצינור מיקרו-צנטריפוגה) על קרח.
   2. להוסיף כ- 1 μL (50 ng) של פלסמיד לתוך הצינור. מערבבים את התאים ואת ה-DNA על ידי מצליף בעדינות את הצינור 2 – 3 פעמים. מניחים את הצינורית על קרח למשך 20 דקות.
   3. מחממים את ההלם 42 ° C למקום ס' 40 את הצינורית על הקרח שוב על 2 דק להוסיף 1 מ"ל של מדיה בטמפרטורת החדר LB הצינור.
   4. המקום הצינור תערובת שייקר 250 סל"ד ב 37 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות מורחים µL 150-200 של התערובת על הלוחות הבחירה. הפוך את הצלחת, דגירה בין לילה ב 37 º C.
3. לבחור שמושבה בודדת ותרבות התאים במדיום 2YT 100 מ ל, המכיל 50 µg/mL kanamycin ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת בבוקר, לחסן בינוני 2YT 1 ליטר המכיל 50 kanamycin µg/mL עם 10 מ"ל של תרבות לילה, דגירה של 37 ° C שייקר אינקובטור ב 250 סל"ד, עד ה OD₆₀₀ מגיע ~ 0.6. לאחר מכן זירוז התרבות עם IPTG כדי ריכוז סופי של 0.4 מ מ ולגדול על עוד 5 שעות ב- 30 ° C.
4. לקצור את התאים על ידי צנטריפוגה ב x 8000 g 10 דקות ב 4 ° C, לאסוף את התאים, resuspend כל התאים 10 גרם במאגר פירוק 40 מ ל (10 מ מ HEPES pH 7.4, 250 מ מ אשלגן כלורי, β-mercaptoethanol 10 מ מ, 25 μg/mL ליזוזים, 25 μg/mL DNase 1 מ PMSF).
   1. לפרק. את זה על ידי sonication-משרעת 65% למשך 8 דקות עם 1 s s על ו- 1 הנחה. להסיר את שאריות תאים על ידי צנטריפוגה ב x 40,000 g למשך 30 דקות ב 4 º C. לסנן את תגובת שיקוע על ידי עובר דרך מסנן μm 0.22, לטעון אותה לתוך הלולאה הדגימה.
5. לטהר את חלבון כימרי, קליב את התג, מחדש לטהר את חלבון המטרה.
   1. לטהר את חלבון כימרי באמצעות העמודה Ni-נ (איגוד מאגר: 10 מ מ HEPES pH 7.4, 250 מ מ אשלגן כלורי; • תנאי מאגר: 10 מ מ HEPES pH 7.4, 250 מ מ אשלגן כלורי, 500 מ מ imidazole) ולטהר על-ידי מערכת טיהור, עם שיפוע ליניארי של 20 – 250 מ מ imidazole.
   2. קליב את חלבון המטרה eluted עם אס פרוטאז (1:50 יחס) לילה ב 4 º C.
   3. לטהר את תערובת התגובה המחשוף באמצעות עמילוז שרף עמודה (איגוד מאגר: 10 מ מ HEPES pH 7.4, 250 מ מ אשלגן כלורי; • תנאי מאגר: 10 מ מ HEPES pH 7.4, 250 מ מ אשלגן כלורי, מלטוז 10 מ מ) ועמודה Ni-נ להסיר את התג ואת אס פרוטאז. החלבון היעד יהיה השבר זרימה דרך של שתי העמודות.
   4. Dialyze את הדגימות מאגר דיאליזה (10 מ מ טריס-HCl pH 8.8, 50 מ מ אשלגן כלורי, 10 מ מ β-mercaptoethanol כדי להפחית את ריכוז המלחים. לטהר את הדגימה על עמודה exchange אניון (איגוד מאגר: 10 מ מ טריס-HCl pH 8.8, 10 מ מ β-mercaptoethanol; • תנאי מאגר: 10 מ מ טריס-HCl pH 8.8, 1 מ' אשלגן כלורי, 10 מ מ β-mercaptoethanol) על ידי מעבר צבע ליניארי של 20 – 500 מ מ אשלגן כלורי במאגר • תנאי.
   5. כשלב האחרון בתהליך טיהור, להתרכז החלבון באמצעות רכז צנטריפוגליות (10 kDa MWCO) ולהזריק לתוך עמודה ג'ל-סינון Superdex 200 26/600 כדי לבדוק את אחידות.
6. לבחון את הטוהר של החלבון על ידי פועל זה מרחביות 15% דף.
   הערה: כל העמודות פועלים על מערכת טיהור חלבון עם קצב זרימה איגוד של 2 mL/min, שיעור זרימת • תנאי של 4 mL/min. חוץ ג'ל-סינון-1 mL/min.

2. חלבון הכנה וגיבוש

1. לרכז את הדגימה חלבון מטוהרים כדי 10 מ"ג/מ"ל באמצעות רכז צנטריפוגליות (10 kDa MWCO) ומאגר exchange למאגר התגבשות לפני אחסון ב- 80 ° c
2. לבצע סינון התגבשות (יחס 1:1, 200 nL של חלבונים, 200 nL מאגר המאגר) על ידי הישיבה ירידה אדי דיפוזיה שיטה ב K 295 עם מספר ערכות התגבשות באמצעות נוזל אוטומטיות של טיפול במערכת רובוטית בתבנית 96-ובכן.
   הערה: השתמשנו ערכות ממדים מולקולרית ומחקר המפטון, Gryphon אוטומטי מערכת טיפול בנוזלים.
3. חותם את הצלחת 96-ובכן התגבשות כדי למנוע אידוי ולאפשר את equilibration הירידה חלבון עם המאגר המאגר. אז שמור את הצלחות בחממה קריסטל-18 מעלות צלזיוס.
4. בדוק את הצלחות 96-ובכן מעת לעת באמצעות מיקרוסקופ אור כדי לפקח קריסטל היווצרות וצמיחה.
5. כדי להבדיל חלבון קריסטלים גבישי מלח, השתמש צבע חלבון. להוסיף 1 µL של צבע הירידה היעד. המתן כ 1 h ולאחר להתבונן במיקרוסקופ. הקריסטלים חלבון יהפוך כחול.
6. להשתמש בתנאי התגבשות חיובי (1.5 M אמוניום סולפט, 0.1 M טריס pH 8.0) נוספת לייעל את הקריסטלים באמצעות תלוי לקפוץ שיטת אדי דיפוזיה. ובכן 24 צלחות.
   1. מיטוב pH מ- 7.0 ל 8.5 עם 0.5 מרווח יחידת ה-pH בכל שלב. מיטוב ריכוז של אמוניום סולפט מ- 1.2 מ' עד 1.7 מ' עם מרווח 0.1 M בכל שלב. (במקרה שלנו המצב הטוב ביותר לייצר גבישים גדולים בצורת צלחת היה 0.1 M HEPES pH 7.0 ו- 1.6 מ' אמוניום סולפט)

3. קריסטל הרכבה, איסוף נתונים רנטגן ונחישות מבנה

1. הר גבישים cryoloop ו- flash-cool בבאמצעות פתרון מאגר המכיל 20% גליצרול כמו הקפאה-תרכובת חנקן נוזלי. הניחו את הקריסטלים ב- unipuck עבור אחסון והובלה.
2. מראש מסך קריסטלים חלבון באמצעות diffractor רנטגן שבאתר של Rigaku. לבחור את הטובים ביותר עם הרזולוציות הגבוה ביותר עבור אוסף נתוני במתקני סינכרוטרון (dataset שלנו נאסף מן BL17U1 במתקן קרינה סינכרוטרון שנגחאי).
   1. השתמש בתוכנת שליטה של הפרעות לקרן החלקיקים BluIce²⁶ כדי לעלות על מרכז את הקריסטלים על-ידי פונקציית מרכוז אוטומטי או ידני. לבצע חשיפות מבחן כדי לקבוע את האסטרטגיה אוסף נתונים, כולל החל זווית, זמן החשיפה, גלאי מרחק, מסגרת רוחב ומספרים.
   2. איסוף הנתונים (dataset) בהתאם (שאספנו מסגרות 180 עם זמן החשיפה ' s 1 ', רוחב מסגרת 1°, המרחק גלאי של 350 מ"מ).
3. אינדקס, לשלב ולשנות את קנה המידה של הנתונים (dataset) באמצעות סוויטת HKL2000²⁷. לבצע קודם את פונקציית החיפוש שיא כדי למצוא את הנקודות עקיפה, ולאחר מכן ליצור אינדקס המקומות ובחר הקבוצה המרחב הנכון. לאחר שיא אינטגרציה, קנה מידה את ערכת הנתונים עם המודל הנכון שגיאה ולשמור קובץ .sca הפלט.
4. לפתור את הבעיה שלב על ידי החלפת מולקולרית באמצעות הפייזר²⁸ ב- PHENIX²⁹.
   1. לחשב את עותק ניתן מספר מולקולות חלבון ביחידה אסימטרי מאת Xtriage³⁰.
   2. לחפש את התבניות מבנה תקין עם דמיון זהות מבניים רצף גבוה כמו החלבון היעד באמצעות מבנים ידועים בספרות או הדגמים שנוצרו על-ידי שרת חיזוי מבנה Phyre2³¹ (השתמשנו ארנב RyR1 NTD כמו חיפוש מודל, 2XOA מזהה PDB).
   3. הפעל את הפייזר באמצעות קובץ הנתונים עקיפה, קובץ מבנה תבנית הקובץ רצף חלבונים כדי למצוא הפתרון.
5. ביצוע AutoBuild³² PHENIX²⁹ כדי לייצר את הדגם הראשוני בעזרת קובץ הפלט מ הפייזר והקובץ רצף של החלבון היעד.
6. באופן ידני את המבנה לתוך צפיפות אלקטרונים ניסיוני ששונתה באמצעות הנרגן³³ ושיפורו באמצעות phenix.refine³⁴ מחזורים איטרטיביים.
7. לאמת את הדגם הסופי באמצעות כלי אימות ב- PHENIX¹⁸.

תוצאות

טיהור

N-מסוף בתחום DBM RyR בא לידי ביטוי כמו חלבון פיוז'ן עם תג hexahistidine, תג MBP אתר אס פרוטאז המחשוף. עקבנו אסטרטגיה טיהור חמישה צעדים כדי להשיג חלבון טהור מאוד, מתאים למטרה התגבשות. בהתחלה חלבון כימרי היה טהור מן השבר מסיסים של תא lysate לפי עמודה Ni-נ ...

Discussion

בנייר זה, אנו מתארים את ההליך כדי recombinantly express, לטהר, מתגבשים, לקבוע את המבנה של DBM RyR NTD. על התגבשות, דרישה חיונית הוא לקבל חלבונים עם מסיסות גבוהה, טוהר, הומוגניות. בפרוטוקול שלנו, בחרנו להשתמש וקטור pET-28a-HMT כפי שהוא מכיל hexahistidine תג ותג MBP, אשר שניהם יכול להיות מנוצל עבור טיהור להשיג טוהר קיפול גב...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
pET-28a-HMT vector			This modified pET vector contains a hexahistidine tag, an MBP fusion protein and a TEV protease cleavage site at the N-terminus (Lobo and Van Petegem, 2009)
E. coli BL21 (DE3) strain	Novagen	69450-3CN
HisTrapHP column (5 mL)	GE Healthcare	45-000-325
Amylose resin column	New England Biolabs	E8021S
Q Sepharose high-performance column	GE Healthcare	17-1154-01
Amicon concentrators (10 kDa MWCO)	Millipore	UFC901008
Superdex 200 26/600 gel-filtration column	GE Healthcare	28-9893-36
Automated liquid handling robotic system	Art Robbins Instruments	Gryphon
96 Well CrystalQuick	Greiner bio-one	82050-494
Uni-Puck	Molecular Dimensions	MD7-601
Mounted CryoLoop - 20 micron	Hampton Research	HR4-955
CryoWand	Molecular Dimensions	MD7-411
Puck dewar loading tool	Molecular Dimensions	MD7-607
Nano drop	Thermo Scientific	NanoDrop One
Crystal incubator	Molecular Dimensions	MD5-605
X-Ray diffractor	Rigaku	FRX
PCR machine	Eppendorf	Nexus GX2
Plasmid mini-prep kit	Qiagen	27104
Gel extraction kit	Qiagen	28704
SspI restriction endonuclease	NEB	R0132S
T4 DNA polymerase	Novagen	2868713
Kanamycin	Scientific Chemical	25389940
IPTG	Genview	367931
HEPES	Genview	7365459
β-mercaptoethanol	Genview	60242
Centrifuge	Thermo Scientific	Sorvall LYNX 6000
Sonnicator	Scientz	II-D
Protein purification system	GE Healthcare	Akta Pure
Light microscope	Nikon	SMZ745
IzIt crystal dye	Hampton Research	HR4-710
Electrophoresis unit	Bio-Rad	1658005EDU
Shaker Incubator	Zhicheng	ZWYR-D2401
Index crystal screen	Hampton Research	HR2-144
Structure crystal screen	Molecular Dimensions	MD1-01
ProPlex crystal screen	Molecular Dimensions	MD1-38
PACT premier crystal screen	Molecular Dimensions	MD1-29
JCSG-plus crystal screen	Molecular Dimensions	MD1-37