龙苷受体 n 端域的晶体结构

摘要

本文介绍了小菜蛾赖诺酮受体 n 端域的蛋白表达、纯化、结晶和结构测定的方案.

摘要

开发针对昆虫赖诺丁受体 (ryr) 的有效和高效杀虫剂在农业虫害防治领域引起了极大的兴趣。迄今为止, 几种针对害虫 ryr 的二胺类杀虫剂已经商业化, 年收入达20亿美元。但由于缺乏有关昆虫 ryr 的结构信息, 对 ryr 靶向杀虫剂作用方式的理解受到限制。这反过来又限制了对害虫中杀虫剂抗药性发展的理解。钻石返回蛾 (dbm) 是一种破坏世界各地十字花科作物的破坏性害虫, 据报道, 这种害虫对菱形杀虫剂也表现出抗药性。因此, 开发针对 dbm ryr 的新型杀虫剂, 特别是针对不同于传统二胺结合位点的地区, 具有十分重要的现实意义。在这里, 我们提出了一个协议, 从结构上描述 n 终端域的 ryr 从 dbm。x 射线晶体结构是通过分子置换求解的 2.84, 该分辨率呈β-树花药折叠图案和侧翼α螺旋。该协议可用于其他领域或一般蛋白质的表达、纯化和结构表征。

引言

ryanodine 受体 (ryr) 是特定的离子通道, 它介导^{ca 2 +}离子在肌肉细胞中的肉瘤-质网膜 (sr) 的渗透。因此, 它们在激励收缩耦合过程中发挥着重要作用。在其功能形式中, ryr 组装成一个同型四聚体, 其分子质量为 gt;2 mda, 每个亚基由 ~ 5000个氨基酸残基组成。在哺乳动物中, 有三种等形式: ryr1-骨骼肌类型, ryr2-心肌类型和 ryr3-在不同的组织¹中普遍表达。

在昆虫中只有一种类型的 ryr, 它表现在肌肉和神经组织²中。昆虫 ryr 更类似于哺乳动物 ryr2, 序列特征约为 47%³。拜耳 (氟苯二胺)、杜邦 (氯硝酸) 和先正达 (氰基吡鱼) 等主要公司开发并销售了针对舌再产的二铵杀虫剂。自最近推出以来, 二胺类杀虫剂已成为增长最快的杀虫剂类别之一。目前, 这三种杀虫剂的年销售额已超过20亿美元, 增长率自2009年以来超过 50% (阿特拉诺娃)。

最近的研究报告了在使用这些杀虫剂^{4、5、6、7、8几代之后}昆虫抗药性的发展。来自钻石蛾 (dbm)、 plutella xylostella ( g4946e, i4790m) 的 ryr 跨膜域的抗性突变以及番茄叶矿工tuta aicuruta的相应位置表明该地区可能与二胺杀虫剂结合, 因为该地区是众所周知的关键是门^{控通道 4,8,9}。尽管在这一领域进行了广泛的研究, 但二胺类杀虫剂的确切分子机制仍然难以捉摸。此外, 目前尚不清楚耐药突变是直接影响与二胺的相互作用还是同种异体的相互作用。

早期的研究报告了哺乳动物种的几个 ryr 域的结构, 以及 x 射线晶体学和低温电子显微镜分别^{为 10、11}、 ^{12、13、14、15、16}、^{17、18、19、20、21}.但到目前为止, 还没有报道昆虫 ryr 的结构, 这使得我们无法了解受体功能的分子复杂性, 以及杀虫剂作用和杀虫剂抗药性的发展的分子机制。

在这篇手稿中, 我们提出了一个广义的协议的结构表征 n 端β-树箔域的 ryanodine 受体从钻石蛾, 一种破坏性的害虫感染世界各地^的十字花科作物22。该结构是根据出版的兔子 ryr1 ntd 晶体结构^23,24和低温 em 结构模型^16,17,^{18, 19设计}的。^20,21. 这是为昆虫 ryr 报告的第一个高分辨率结构, 它揭示了通道门控的机制, 并为利用结构药物设计开发物种专用杀虫剂提供了一个重要模板。在结构阐明方面, 我们采用了 x 射线晶体学, 它被认为是在近原子分辨率下测定蛋白质结构的 "金标准"。虽然结晶过程是不可预测的和劳动密集型的, 这一步一步的协议将帮助研究人员表达, 纯化和表征昆虫 ryr 或任何其他蛋白质的其他领域或一般。

研究方案

1. 基因克隆、蛋白质表达和纯化

1. pcr 扩增与感兴趣的蛋白质相对应的 dna (dbm ryr 的残留量 1-205, genbank acc. no。afw97408) 和克隆到 pet-28a-hmt 矢量由连接独立克隆 (lic)²⁵。该载体包含一个组氨酸标记、mbp 标记和 n-终点15处的 tev 蛋白酶裂解位点.
   1. 设计用于扩增目标基因的 lic 引物, 其与 lic 兼容的 5 ' 扩展:
      正向 lic 底漆:
      5 ' tactcacccatcatggggggggggg 3 '
      反向 lic 底漆:
      5 "ttaccccctcttatttgcgcgcgggggggc 3"
   2. 将反应组分 (50μl) 组合在使用: 1μl 的 dna 模板 (100ngμμl), 1μl 的正向底漆 (10μm), 1μl 的反向底漆 (10μm), 0.5μl 的 dna 聚合酶 (neb), 5μl 的10x 反应缓冲液, 1μl 的 dntp (25mm), 40.5μl 的 rnase 游离 ddh2o_.
      1. 将反应混合物放入 pcr 机器中, 并运行以下程序。
      2. 在95°c 下孵化 3分钟, 然后运行30个周期 (95°c 30秒, 58°c 15秒, 72°c 1分钟)。在72°c 下孵化 5分钟, 然后在4°c 下保持。
      3. 在2% 琼脂糖凝胶上运行整个反应混合物 (50μl), 并用凝胶提取试剂盒提取。遵循制造商的协议。
   3. 与连接无关的克隆 (lic)
      1. 执行 spi 消化 (60μl): 20μl 的载体 dna (50ngμl)、10x 反应缓冲液的6μl、sspi 的4μl 和30μl 的 ddh 2o 在37°c 时培养 3小时, 在1% 琼脂糖凝胶上运行整个反应混合在1% 琼脂糖凝胶凝胶凝胶中, 并与凝胶提取试剂盒提取.遵循制造商的协议。
      2. 对载体进行 t4 dna 聚合酶处理并插入 dna。结合以下方法: 5μl 的载体或插入 dna (50 ng/μl), 10xl t4 dna 聚合酶缓冲液、1μl 的 dgtp (25 mm) 为载体, 1μl 的 dctp (25 mm) 用于插入 dna, 1μl 的 dGTP (100 mm), 0.4 微米的 t4 dna 聚合酶 (lic 合格)在室温下培养反应 40分钟, 在75°c 时热失活酶20分钟。
         注: lic 载体和插入 dna 必须在不同的反应中进行处理。
      3. 执行 lic 退火反应。结合以下方法: t4 处理插入 dna 2μl, t4 处理的 lic 载体 dna 2μl。在室温下孵化反应10分钟。
2. 利用该重组质粒转化 bl21 (de3)大肠杆菌细胞。
   1. 在冰上解冻有能力的细胞 (微离心管中的 50μl)。
   2. 在试管中加入约 1μl (50 纳克) 的质粒。轻轻闪烁 2-3次管, 将细胞和 dna 混合。将管子放在冰上20分钟。
   3. 在42°c 时热冲击 40度. 将管再次放在冰上 2分钟. 将室温 lb 介质加入1毫升的室温 lb 介质。
   4. 将混合物管放在37°c 的250转/分振动台中, 时间为 45分钟. 将混合物的150–200μl 扩散到选择板上。反转板, 在37°c 下孵育过夜。
3. 选择单个菌落, 在37°c 过夜时培养含有50μgml 卡那霉素的 100 ml 2yt 培养基中的细胞。第二天早上, 接种含有50μgml 卡那霉素的1升2yt 培养基, 其中含有10毫升的隔夜培养物, 并在37°c 的振动筛孵化器中孵育 250 rpm, 直到 od₆₀₀达到 ~ 0.6。此后诱导与 iptg 的培养到 0.4 mm 的最终浓度, 并在30°c 下再生长5小时。
4. 在4°c 条件下, 以 8, 000 x 克离心10分钟的速度收集细胞, 收集细胞并在 40 ml 裂解缓冲液中重新悬浮每10克细胞 (10 mm hepes ph 7.4, 250 mm kcl, 10mm β-硫醇, 25μml 溶菌酶, 25μgml dnase, 1 mm 永磁同步电机)。
   1. 以65% 的振幅用声纳破坏它, 8分钟, 1秒开, 1分钟关闭。在4°c 下, 以 40, 000 x克离心 30分钟, 取出细胞碎片。通过0.22μm 过滤器对上清液进行过滤, 并将其加载到样品回路中。
5. 纯化融合蛋白, 裂开标签, 重新纯化目标蛋白。
   1. 使用 ni-nta 柱纯化融合蛋白 (结合缓冲液:10 mm hepes ph 7.4, 250 mm kcl; 洗脱缓冲液:10 mm hepes ph 7.4, 250 mm kcl, 500 mm 咪唑), 并通过净化系统进行纯化, 线性梯度为 20–250 mm 咪唑。
   2. 在4°c 下, 用 tev 蛋白酶 (1:50 比) 在夜间清除洗脱的目标蛋白。
   3. 使用直链淀粉树脂柱 (结合缓冲液:10 mm hepes ph 7.4、250 mm kcl; 洗脱缓冲液:10 mm hepes ph 7.4、250 mm kcl、10 mm maltose) 和 ni-nta 色谱去除标签和 tev 蛋白酶, 纯化裂解反应混合物。目标蛋白将在这两列的流经部分。
   4. 将样品透析为透析缓冲液 (10 mm tris-hcl ph 8.8, 50 mm kcl, 10 mm β-硫醇, 以降低盐浓度)。在阴离子交换柱上纯化样品 (绑定缓冲区:10 mm tris-hcl ph 值 8.8, 10 mm β-硫醇; 洗液缓冲液:10 mm tris-hcl ph 值 8.8, 1 m kcl, 10 mm β-硫醇) 在洗脱缓冲液中的线性梯度为 20-500 mm kcl。
   5. 作为纯化过程中的最后一步, 使用离心式浓缩器 (10kda mwco) 浓缩蛋白质, 并注入 superdex 200 26/600 凝胶过滤柱, 以检查均匀性。
6. 通过在 15% sds page 上运行该蛋白来检查其纯度。
   请注意:所有色谱柱都在蛋白质净化系统上运行, 结合流量为 2 mL/min, 洗脱流量为 4 mL/min, 但在 1 ml/min 时过滤。

2. 蛋白质制备与结晶

1. 使用离心式选矿厂 (10kda mwco) 将纯化后的蛋白质样品浓缩到 10mgml, 并在储存在-80°c 之前将缓冲液交换到结晶缓冲液。
2. 采用295-k 的坐滴蒸汽扩散方法, 使用96井格式的自动液体处理机器人系统, 采用多个结晶试剂盒, 进行结晶筛选 (12:1 比、200升蛋白质和200升储层缓冲液)。
   请注意:我们使用了分子尺寸和汉普顿研究的试剂盒以及鹰头狮自动液体处理系统。
3. 密封96孔结晶板, 防止蒸发, 并使蛋白质下降与储层缓冲液的平衡。然后将板材保存在晶体孵化器中的18°c。
4. 使用光学显微镜定期检查96孔板, 以监测晶体的形成和生长。
5. 要区分蛋白质晶体和盐晶体, 请使用蛋白质染料。在目标滴中加入1μl 染料。等待约 1小时, 并在显微镜下观察。蛋白质晶体会变成蓝色。
6. 使用正结晶条件 (1.5 m 硫酸铵, 0.1 m tris ph 8.0) 在24孔板中使用悬挂滴蒸汽扩散法进一步优化晶体。
   1. 将 ph 值从7.0 优化为 8.5, 每步 0.5 ph 单位间隔。每步 0.1 m 的时间间隔, 优化硫酸铵浓度从 1.2 m 到 1.7 m。(在我们的例子中, 生产大型板状晶体的最佳条件是 0.1 m hepes ph 7.0 和 1.6 m 硫酸铵)

3. 晶体安装、x 射线数据采集和结构测定

1. 用含有20% 甘油的储液作为低温保护剂, 将晶体安装在低温中, 在液氮中冷却闪冷。将水晶放入 unipuck 存放和运输。
2. 使用 rigaku 内部 x 射线衍射仪的预屏幕蛋白质晶体。选择具有最高分辨率的同步加速器设施数据收集最佳数据 (我们的数据集是从上海同步辐射设施的 bl17u1 收集的)。
   1. 使用波束线控制软件 bluice²⁶安装和中心的晶体通过自动或手动居中功能。执行测试曝光以确定数据收集策略, 包括起始角度、曝光时间、探测器距离、帧宽度和数字。
   2. 相应地收集数据集 (我们收集了180帧, 曝光时间为 1秒, 帧宽度为 1°, 探测器距离为 350 mm)。
3. 使用 hkl2000 第27套索引、集成和扩展数据集^.首先实现峰值搜索功能, 找到衍射点, 然后对衍射点进行索引, 选择合适的空间群。在峰值集成之后, 使用适当的错误模型缩放数据集并保存输出. sca 文件。
4. 通过在 phenix²⁹中使用 phaser²⁸进行分子置换来解决相位问题。
   1. 通过 xtriage³⁰计算不对称单位中蛋白质分子的可能拷贝数。
   2. 利用文献中的已知结构或结构预测服务器 (如 phyre231) 生成的模型 (我们使用兔子 ryr1^ntd)寻找具有高序列标识和结构相似性的适当结构模板作为目标蛋白。一个搜索模型, pdb id 2xoa)。
   3. 运行 phaser 使用衍射数据文件, 模板结构文件和蛋白质序列文件, 找到解决方案。
5. 在 phenix²⁹中执行自动生成³² , 使用 phaser 的输出文件和目标蛋白中的序列文件生成初始模型。
6. 使用整理³³将结构构建到修改后的实验电子密度中, 并在迭代周期中使用 phenex. 细化34进行细化.
7. 使用 phenix¹⁸中的验证工具验证最终模型。

结果

净化

dbm ryr 的 n 端域被表示为具有六角蛋白标记、mbp 标记和 tev 蛋白酶裂解位点的融合蛋白。我们遵循五步纯化策略, 以获得一种高度纯的蛋白质, 适合结晶目的。首先, 用 ni-nta 柱 (histrap hp) 从细胞裂解液的可溶性组分中纯化了融合蛋白。其次, 对融合蛋白进行 tev 蛋白酶裂解, 用直链淀粉树脂柱去除六角蛋白 mbp-多重症, 然后采用?...

讨论

本文描述了 dbm ryr ntd 的重组表达、纯化、结晶和结构的确定过程。对于结晶, 一个关键的要求是获得高溶解度、纯度和均匀性的蛋白质。在我们的协议中, 我们选择使用 pet-28a-hmt 矢量, 因为它包含一个六氨酸标记和 mbp 标记, 这两个标记都可用于纯化, 以获得更高的折叠纯度。此外, mbp 标记有助于目标蛋白的溶解度。我们通过连续五个步骤纯化蛋白质, 得到了高度纯净、适合结晶的蛋白质。采用自动...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
pET-28a-HMT vector			This modified pET vector contains a hexahistidine tag, an MBP fusion protein and a TEV protease cleavage site at the N-terminus (Lobo and Van Petegem, 2009)
E. coli BL21 (DE3) strain	Novagen	69450-3CN
HisTrapHP column (5 mL)	GE Healthcare	45-000-325
Amylose resin column	New England Biolabs	E8021S
Q Sepharose high-performance column	GE Healthcare	17-1154-01
Amicon concentrators (10 kDa MWCO)	Millipore	UFC901008
Superdex 200 26/600 gel-filtration column	GE Healthcare	28-9893-36
Automated liquid handling robotic system	Art Robbins Instruments	Gryphon
96 Well CrystalQuick	Greiner bio-one	82050-494
Uni-Puck	Molecular Dimensions	MD7-601
Mounted CryoLoop - 20 micron	Hampton Research	HR4-955
CryoWand	Molecular Dimensions	MD7-411
Puck dewar loading tool	Molecular Dimensions	MD7-607
Nano drop	Thermo Scientific	NanoDrop One
Crystal incubator	Molecular Dimensions	MD5-605
X-Ray diffractor	Rigaku	FRX
PCR machine	Eppendorf	Nexus GX2
Plasmid mini-prep kit	Qiagen	27104
Gel extraction kit	Qiagen	28704
SspI restriction endonuclease	NEB	R0132S
T4 DNA polymerase	Novagen	2868713
Kanamycin	Scientific Chemical	25389940
IPTG	Genview	367931
HEPES	Genview	7365459
β-mercaptoethanol	Genview	60242
Centrifuge	Thermo Scientific	Sorvall LYNX 6000
Sonnicator	Scientz	II-D
Protein purification system	GE Healthcare	Akta Pure
Light microscope	Nikon	SMZ745
IzIt crystal dye	Hampton Research	HR4-710
Electrophoresis unit	Bio-Rad	1658005EDU
Shaker Incubator	Zhicheng	ZWYR-D2401
Index crystal screen	Hampton Research	HR2-144
Structure crystal screen	Molecular Dimensions	MD1-01
ProPlex crystal screen	Molecular Dimensions	MD1-38
PACT premier crystal screen	Molecular Dimensions	MD1-29
JCSG-plus crystal screen	Molecular Dimensions	MD1-37