نموذج التحكم ماوس لأنه الانتان الوليدي

Byron Brook; Nelly Amenyogbe; Rym Ben-Othman; Bing Cai; Danny Harbeson; Freddy Francis; Aaron  C. Liu; Natallia Varankovich; James Wynn; Tobias  R. Kollmann

doi:10.3791/58574

Summary

يوفر هذا البروتوكول الخطوات اللازمة لإنشاء وتقييم الانتان الوليدي في الفئران عمره 7 أيام.

Abstract

ويظل الانتان الوليدي عبء عالمي. هناك حاجة إلى نموذج الإكلينيكية للتدخلات الوقائية أو العلاجية الفعالة الشاشة. يمكن الناجم عن الانتان الوليدي الماوس أنه بحقن الملاط سيكل إينترابيريتونيلي في اليوم من الحياة 7 الفئران ورصدها للأسبوع التالي. المقدمة هنا هي الخطوات التفصيلية اللازمة لتنفيذ هذا النموذج الانتان الوليدي. وهذا يشمل جعل أسهم ملاط سيكل متجانسة، إذابته لجرعة ضبط الوزن والقمامة، ومخططا لجدول الرصد، وتعريفاً لصحة الملاحظة الفئات المستخدمة لتحديد نقاط النهاية إنسانية. الجيل من مخزون الملاط سيكل متجانسة من المانحين المجمعة يسمح للإدارة في كثير من ليتر مع مرور الوقت، الحد من التفاوت بين الجهات المانحة، ومنع استخدام والغليسيرول سمية. استراتيجية الرصد المستخدمة تسمح لتوقع نتائج البقاء على قيد الحياة، وتحديد الفئران التي سوف تقدم لاحقاً حتى الموت، مما يسمح لتحديد نقطة النهاية إنسانية سابقة. اثنين من الميزات السلوكية الرئيسية تستخدم لتعريف عشرات الصحة، إلا وهي قدرة الفئران حديثي الولادة حق أنفسهم عند وضعه على ظهورهم، ومستوى الحراك. يمكن أن يحتمل أن تطبق هذه المعايير على عنوان النهاية إنسانية في الدراسات الأخرى المتعلقة بأمراض الأطفال حديثي الولادة في الفئران، طالما يتم إجراء دراسة تجريبية للتأكد من دقتها. وفي الختام، يقدم هذا النهج أسلوب موحد لنموذج الانتان الوليد في الفئران، مع توفير الموارد اللازمة لرعاية الحيوانات المستخدمة لتحديد نقاط النهاية إنسانية مبكرة للحيوانات تحدي تقييم.

Introduction

الانتان أسباب الرئيسية للوفيات البشرية المعدية حديثي الولادة¹. لأن الانتان حديثي الولادة هو غير مفهومة، وقد أحرز تقدم ضئيل في تحديد المواليد المعرضين للخطر مبكرا أثناء المرض وتطوير علاجات فعالة أو الحقنات. وهذا يتطلب استخدام نماذج حيوانية للانتان فهم أفضل للعملية واختبار التدخلات الممكنة. وعلاوة على ذلك، القوارض الكبار تستجيب بشكل مختلف للانتان، مع فروق معتد بها إحصائيا في العدد من البكتيريا إدارة للحصول على نفس الجرعة القاتلة (LD) والاختلافات في الاستجابة المضيف الناتج مقارنة بالأطفال حديثي الولادة². وهكذا، قد الانتان الوليدي دراستها في حديثي الولادة. وقد استخدمت العديد من النماذج الانتان الكبار في البحوث الانتان. وتشمل هذه المعايير تحدي عن طريق الحقن الوريدي الكائنات محددة متورطة في الانتان البشرية الكبار أو ربط سيكل وثقب (قوانين وسياسات المنافسة). قوانين وسياسات المنافسة هو نموذج تحدي ذاتية حيث الأعور هو جراحيا معزولة ومتصلة وثقب للسماح بتسرب محتويات الأمعاء في الصفاق، مما يؤدي في النهاية إلى منهجية نشر الميكروبات وهذه المنتجات³. ومع ذلك، العملية الجراحية اللازمة لوضع قوانين وسياسات المنافسة القاتلة للحيوانات حديثي الولادة؛ ولذلك، أسلوب بديل ضروري لتقليد أنه التحدي المتمثل في قوانين وسياسات المنافسة للحث على الانتان الوليدي. تم تطوير نموذج الملاط سيكل للانتان الوليدي أنه تلبية لهذه الحاجة، حيث تحصد سيكل محتويات الحيوانات وعلقت في سكر العنب العقيمة 5% في الماء (D5W) وإينترابيريتونيلي حقن الفئران حديثي الولادة². وهذا أصبح، منذ ذلك الحين، نموذج شعبية متزايدة لدراسة الانتان في الحيوانات حديثي الولادة والكبار على حد سواء وتقدماً جوهريا رؤى الميكانيكية في هذا المرض عملية⁴^،^،من⁵⁶^،⁷ ^،^،من⁸⁹^،¹⁰^،¹¹^،¹²^،¹³^،^،من¹⁴¹⁵.

ونظرا لتزايد استخدام هذا النموذج ورغبة الباحثين في مقارنة النتائج مباشرة عبر المنشورات، هناك حاجة للجوانب التقنية يكون وصف جيد وموحدة عبر الدراسات. توحيد ينطبق على ثلاثة جوانب لهذا النموذج، إلا وهي ط) إعداد المخزون الملاط سيكل، ثانيا) إعداد مختبرين التحدي للحقن في الحيوانات التجريبية، وثالثاً) تعريف نقطة النهاية إنسانية حيث الحيوانات وتعتبر نونسورفيفورس في تجارب التحدي. على وجه التحديد، أساليب إعداد المخزون الملاط سيكل غالباً المشار إليها المادة الأصلية الأخذ بنموذج². ملخص موجز لهذا النموذج هو أن محتويات سيكل من الفئران الكبار كان حصادها، علقت في D5W العقيمة إلى تركيز 80 ملغ/مل، وتستخدم ضمن ح 2 لحقن الحيوانات التجريبية. يستخدم هذا النموذج الأصلي الفئران من نفس الفئة العمرية، من نفس الموقع البائع، الذي كانوا يسكنون في مرافقها البحثية الخاصة بكل منها لأقل من 2 أسابيع قبل الحصاد محتويات سيكل. أيضا بشكل كبير زيادة استخدام الفئران المولدة داخليا، على الرغم من تخفيض التكلفة من تسليم البائع العادية، ويسمح باستخدام فئران الزائدة من طائفة أوسع من الجنس والعمر، مانح إلى التغير. وهذا الدافع وراء تطوير أسلوب بديل، حيث تم تجميع محتويات سيكل من الفئران متعددة معا لإعداد مخزون كبير، الذي كان آنذاك الكوتيد والمخزنة في-80 درجة مئوية¹³. تم تكييف هذا الأسلوب البديل من عدة مجموعات¹⁴^،¹⁵. بيد أن التكيف مع أسفرت عن بعض الاختلافات التقنية، سواء في وسائط التخزين المستخدمة (والغليسيرول 10% أو 15% أو D5W وحدها)، وفي استراتيجية للترشيح لإزالة الجسيمات (الترشيح متعدد المراحل عن طريق مكم 860، ومن ثم، مكم 190 التصفية، أو الفرد تصفيات من خلال 100 ميكرومتر أو 70 ميكرون المرشحات)¹³^،^،من¹⁴¹⁵. حقن والغليسيرول وحدها يمكن أن يسبب الضرر، نظراً لأن الحقن والغليسيرول 25-50% وقد استخدمت كنموذج القوارض من الإصابة الكلوية¹⁶^،¹⁷^،^،من¹⁸¹⁹^، ²⁰. لتجنب الآثار الجانبية غير المقصودة الجلسرين، يتم تجميد إعداد المخزون الملاط سيكل للفئران في هذه الدراسة في D5W دون والغليسيرول، ويتم إجراء الاختبارات لبقاء البكتيرية من مخزن في-80 درجة مئوية. أن استراتيجية الترشيح المستخدمة في هذه الدراسة هي مرور واحد من خلال عامل تصفية ميكرومتر 70، الذي لا يقارن مباشرة باستراتيجيات الترشيح الأخرى المذكورة.

قد تختلف من منشأة إلى منشأة الجرعات المميتة المعدلة حسب الوزن من الملاط سيكال حقن وينبغي أن يكون تيتيريد بها للفتك المرجوة لمجموعات الأفراد. بجرعات مختلفة من التحدي، تغيير حجم التحدي المصاحبة لها بالضرورة. ومع ذلك، أبلغ هذا التفصيل المنهجي لا قبل. وعلاوة على ذلك، استراتيجيات للإجراءات القياسية، مثل حقن داخل، نادراً ما توضع في حدود الأدب، ولكن التقنيات الفردية قد تؤثر على ما إذا كان التسرب عند حقن الفئران حديثي الولادة وتؤثر نتائجها النهائية.

الرفق بالحيوان، بما في ذلك تعريف نقطة النهاية إنسانية، جانبا أساسيا من هذا النموذج، وفي أي نموذج للعدوى والتهاب في القوارض²¹. في عام 1998، نشر "المجلس الكندي" على الحيوان الرعاية (ككاك) مبادئ توجيهية واسعة النطاق لتحديد نقطة النهاية إنسانية، تحديد نقطة النهاية إنسانية كما "أي ألم الفعلية أو المحتملة أو الشدة أو عدم الراحة ينبغي التقليل إلى أدنى حد أو التخفيف منها عن طريق اختيار أقرب وقت نقطة النهاية التي متوافقة مع أهداف البحوث العلمية "²². آخرون أيضا الحذر أن النهاية إنسانية يجب أن ينشأ على أساس المبررات العلمية ليس على تفسير ذاتي للحيوان الدولة وحدها²¹. بينما هناك ثروة موارد السريرية، والسلوكية، والمعايير المستندة إلى علامة على حالة الجسم لنقطة النهاية إنسانية، حتى في سياق العدوى والتهاب تحديداً²¹^،^،من²³²⁴، أيا من هذه ، بما في ذلك المبادئ التوجيهية ككاك لنقطة النهاية إنسانية²²، أذكر الفئران حديثي الولادة. وهكذا، نقاط النهاية إنسانية لها ما يبررها موضوعيا وعلميا أصعب بكثير إقامة الحيوانات الوليدة، نظراً لقدراتها المحدودة على السلوكية وعدم وجود أدلة من المعايير مثل فقدان الوزن، الذي يستخدم عادة للكبار الفئران. في الوقت الراهن، المعايير لنقطة النهاية إنسانية المستخدمة للفئران حديثي الولادة 5 إلى 12 يوم-عمرها في الأدب الملاط سيكل كل الإشارة مرة أخرى إلى المخطوطة الأصلية التي أدخلت على نموذج². في هذه الورقة الأصلية، يستند إلى تعريف نقطة النهاية إنسانية للحيوانات الوليدة معيارين؛ إلا وهي موقع الماوس خارج العش (نثر) وعدم وجود بقع الحليب شوهدوا لتؤدي إلى الوفاة في غضون ساعة. مسألة تعقيد في تعيين نقطة نهاية إنسانية ما أن بقع الحليب يصبح من الصعب أن نرى في سلالات الماوس مع الفراء المظلمة، مثل سلالة C57BL/6J العاملين عموما، بعد الأسبوع الأول من الحياة، بينما تراقب الحيوانات المريضة حتى اليوم الرابع عشر من الحياة (DOL). الحيوانات ميتة أخرى، ويمكن الاطلاع على بوستشالينجي عند تطبيق هذه المعايير (تملك المراقبة غير منشورة)؛ وهكذا، تعريف أكثر دقة لنقطة النهاية إنسانية اللازمة للتخفيف من معاناة الحيوانات التجريبية وتجنب وفيات في حالات حيث النتائج يمكن أن تكون دقة تلمس في وقت سابق.

تعرض جميع الجوانب المنهجية الثلاث من طراز الملاط سيكل في إجراءات تشغيل موحدة تفاصيل إعداد مخزون الملاط سيكل، طريقة لحقن الحيوانات التجريبية التي تحافظ على حقن حجم ثابت بين الجرعات و يقلل من خطر تسرب، وتعريفاً لنقطة النهاية إنسانية للفئران 7 إلى 12 يوم-عاماً استناداً إلى نظام النمذجة السلوكية. وكان جمع المعلومات السلوكية الماوس الصحة عشرات من أكثر من 240 الحيوانات التجريبية ومجمعة حسب نتائج النهائي البقاء على قيد الحياة، مما يدل على تعريف تستند إلى الأدلة لنقطة النهاية إنسانية. يتم تقليل معاناة الحيوانات التجريبية بتحديد مرحلة سبات الفئران حديثي الولادة في أقرب وقت ممكن النقطة، بينما يمكن استنتاج نتائج هامة بيولوجيا البقاء على قيد الحياة عن طريق مراقبة المتغيرات الرئيسية. التمثيل المرئي لإعداد الملاط سيكال وسلوك الماوس الولدان ستكون بمثابة مصدر ممتاز لأي مجموعة دراسة الانتان أو الحيوانات نموذج التحدي حديثي الولادة.

Protocol

جميع التجارب في هذا البروتوكول أقرتها لجنة الرعاية الحيوانية جامعة كولومبيا البريطانية تحت رقم البروتوكول جرينتس A17.

1-أداة التعقيم

سلامة بيولوجية مجلس الوزراء (BSC)، تشغيل ويسخن معقم حبة حار إلى 250 درجة مئوية، على الأقل 30 دقيقة قبل الاستخدام.
تراجع الأدوات الموجودة في الإيثانول 70%.
غمر الأدوات في التعقيم حبة حار مسخن لمدة 1 دقيقة.
ملاحظة: سوف تحصل على الساخن مقابض الأدوات وقد حرق إذا تركت في التعقيم حبة الساخنة لأكثر من 1.5 دقيقة.
رش حصيرة من المناشف الورقية مع الإيثانول 70% لتعقيم عليه.
إزالة الأدوات من التعقيم حبة الساخنة دون لمس الجزء معقمة من أداة المقابض نونستيريلي من الأدوات الأخرى المغمورة ووضعها على مناشف الورق رش الإيثانول.
انتظر لمدة 30 ثانية إلى 2 دقيقة لأدوات لتبرد قبل استخدامها للتشريح.

2. إعداد ملاط سيكال

بريويغ 15 مل أنابيب الطرد المركزي (أنبوب واحد لكل خمسة فئران يجري euthanized).
Euthanize ملاط سيكل الجهات المانحة وفقا للمبادئ التوجيهية لرعاية الحيوانات المحلية أو استخدام بروتوكول أدناه.
ملاحظة: ما يصل إلى 40 من الفئران C57BL/6J بين 6 و 12 أسبوعا القديمة استخدمت لإعداد الملاط سيكال، مع خمسة فئران يجري euthanized في وقت.
1. نقل الفئران إلى دائرة القتل الرحيم وتعيين الجهاز التخدير إيسوفلوراني إلى 5% مع الأكسجين التروية.
2. مراقبة الفئران الاحتفال بفقدان القدرة على التحرك وأن نراهم على دخول الطائرة الجراحية التخدير، وأخيراً، توقف التنفس.
3. إزالة ماوس من دائرة القتل الرحيم وقرصة مخلب لها ومراقبة أي سحب الساق أو الاستنشاق. إذا كان موجوداً، أما العودة الماوس إلى دائرة القتل الرحيم؛ خلاف ذلك، يستمر.
4. الميؤوس من شفائهم euthanize الفئران بخلع عنق الرحم الحاد.
إجراء تشريح الأعور، استخدام أدوات بريستيريليزيد وتبريد (انظر الفرع 1) في بكالوريوس.
1. دبوس الساقين الماوس لمجلس مقذوف البوليستيرين الرغوي استخدام الإبر ز 23 حيث يحتوي الماوس على البطن. تأمين وثم رش البطن مع الإيثانول 70%.
2. استخدام ملقط معقم، ومقص، قص عن طريق الجلد، وترخي الجلد من بطانة البريتوني مع مقص، وقطع فتح منطقة مستطيلة من الفخذ للقص، والجانب الأيسر إلى الجانب الأيمن. قم بإزالة أي الفراء من الصفاق.
3. قم بالتبديل إلى زوج جديد من أدوات معقمة لقطع طريق الصفاق، مما يجعل من فتح مستطيلة كما حدث للجلد، والتبديل بين أدوات إذا استخدمت تلك الاتصال الجلد.
4. تحديد الأعور، الذي ينبغي أن يعمل اليسار إلى اليمين عبر الجسم. تعطيل النسيج الضام لتحديد فروع الأعور من الأمعاء وقطع الأعور بعيداً عن الأمعاء. مكان الأعور على ورقة معقمة من وزن الورق.
  ملاحظة: وزن الورق يمكن تعقيم أما برش عليه مع الإيثانول 70% في كلا الجانبين وتركها لتجف، أو باشعاع الأشعة فوق البنفسجية. وبدلاً من ذلك، يمكن تشريح الأعور على طبق بتري معقم.
سيكال البثق المحتوى
1. في BSC، استخدام أدوات معقمة لقطع طريق طرفي الأعور.
2. عقد منتصف الأعور مع ملقط معقم واستخدام ملعقة معدنية مسطحة عقيمة للدفع بلطف محتويات سيكال من القطع ينتهي، استخدام المتداول الحركة وتجنب اقتراح إلغاء يمكن المسيل للدموع الظهارة. جمع المحتويات ووضعها في أنبوب الطرد مركزي بريويغيد 15 مل.
3. تجميع محتويات سيكل من حد أقصى خمسة فئران في الأنبوب نفسه. وزن الأنبوبة مرة أخرى حالما تتم إضافة كافة المحتويات.
  ملاحظة: نتوقع في متوسط 300 ملغ، وما يصل إلى 390 ملغ ملاط سيكال للماوس، تتطلب 1.8 إلى 2.4 مل D5W لاستثارة كل الماوس; ولذلك، يمكن أن يؤدي استخدام الفئران أكثر من خمسة خلال هذه الخطوة يفعم أنبوب الطرد المركزي 15 مل.
4. مسح الأدوات نظيفة مع منشفة ورقية رش الإيثانول وريستيريليزي لهم بتكرار الخطوات 1.2-1.6.
ترشيح ملاط سيكال
1. وزن أنبوب الطرد المركزي مليئة بمحتويات سيكل وحساب كمية D5W إضافة إلى محتويات سيكل بقسمة وزن محتويات سيكل تركيز المخزون المطلوب في ملليغرام في المليلتر، كما هو الحال في المعادلة أدناه.
2. في بكالوريوس، إضافة الكمية المطلوبة من D5W المثلج إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل تحتوي على محتويات سيكل.
3. دوامة 15 مل الطرد المركزي الأنبوب عمودياً وأفقيا للاختيار س. 30 للجسيمات لأكثر من 1-3 مم في القطر، وإذا كانت موجودة، يستمر فورتيكسينج واضح وقد اختفى جميع الجسيمات الكبيرة.
4. وضع مصفاة خلية 70 ميكرومتر عقيمة في أنبوب 50 مل أجهزة الطرد مركزي التي يتم وضعها على الجليد. "الماصة؛" 4 مل ملاط سيكل حراكه إلى مصفاة الخلية، ومن ثم إلى أنبوب جمع. ريسوسبيند الجسيمات واسطة بيبيتينج صعودا وهبوطاً 2 x-3 x. قذف الفقاعات لزيادة سرعة التصفية أثناء إثارة المحتويات مع طرف الماصة حتى هناك لا قطرات أكثر يجري تصفيتها بلطف.
  ملاحظة: عند خلط، قد يكون هناك جسيمات كبيرة بما يكفي لسد ماصة 5 مل. في هذه الحالة، كرر فورتيكسينج من الخطوة 2.5.3، وإذا كان الحل لا يزال عدم التفكك، استخدام ماصة الضغط على الجسيمات ضد جدار أنبوب الطرد المركزي.
5. كرر الخطوة 2.5.4، تغيير مصافي الخلية بين كل أنبوبة من الملاط سيكل، وتجمع كافة المحتويات في أنبوب جمع أجهزة الطرد المركزي 50 مل نفس أبقى على الجليد، أو في أنبوب الطرد مركزي 50 مل ثاني إذا تجاوز حجم فيلتراتي مستوى الجليد في مربع الجليد.
قاسمة الملاط سيكل.
1. إذا كان ذلك ممكناً، ضم 50 مل متعددة الملاط سيكل filtrate أنابيب من الخطوة 2.5.5 في حاوية معقمة أكبر (مثل زجاجة تخزين مل 1,000). ثم، من دوامة 15 ثانية ومكان 20 مل في أنبوب 50 مل أجهزة الطرد مركزي جديدة.
2. دوامة الأسهم الملاط سيكل في أنبوب 50 مل الطرد المركزي s 5-10، وميليلتر 500 الكوة إلى ثلاث قنينات المبردة 2 مل وقد ختم مطاط، لمنع تبخر مع مرور الوقت. فورا وضع المخزون الرئيسي والقنينة المبردة اليكووتيد على الجليد.
3. كرر الخطوتين 2.6.1 و 2.6.2 حتى كان كل من الملاط سيكل الكوتيد، فورتيكسينج الأسهم الرئيسية بعد كل قنينة المبردة ثلاثة لمنع تسوية أي الجسيمات والحفاظ على خليط متجانس.
4. تجميد مختبرين الملاط سيكال في-80 درجة مئوية.
  ملاحظة: توقع بين ثلاثة أو أربعة قنينات الأسهم في 500 ميليلتر من كل الماوس الكبار. يجب أن يكون كل قنينة الأسهم تقريبا ما يكفي القمامة تحدي واحد من ثمانية الفئران في 7 دول.

3-الانتان التحدي المتمثل في الفئران حديثي الولادة عمره 7 أيام

فصل وتحديد وزن الفئران حديثي الولادة.
1. في BSC، نقل الفئران حديثي الولادة إلى قفص جديد للحفاظ على الفئران بعيداً عن السد، وتقليل الضغط على السد.
2. إزالة وفرك جزء من المواد تداخل مع قفازات لنقل رائحة القفص للقفازات. ثم العفن مواد التعشيش إلى عش أصغر ووضعه داخل قفص جديدة دون السد.
3. نقل الفئران حديثي الولادة إلى مواد التعشيش في القفص الجديد.
4. نقل المزيد من المواد التعشيش جعل عش فارغ، والثانية في القفص الجديد.
5. قم بإغلاق وإزالة القفص السد من غطاء محرك السيارة حيث أكد السد هو ليس من سماع أي من الشدة في الفئران حديثي الولادة.
6. تتبع الفئران حديثي الولادة الفردية داخل القمامة على مر الزمن، استخدم علامة واقية من الإيثانول بمناسبة واحدة وخمس نقاط على الجبهة أو عكس الذيل، إعادة تطبيق كل ح 12-24 حسب الحاجة.
7. تزن كل الماوس التي سيتم الطعن، ووضع كل منهما إلى الثانوية العش بعد وزنها، وكرر هذه العملية لجميع الفئران.
8. العودة القمامة كاملة إلى السد قبل إعداد التحدي الملاط سيكل الكوة.
حساب الجرعات الفردية المعدلة حسب الوزن من الملاط سيكال وتمييع المطلوبة مع D5W بإكمال هذه الخطوة للقمامة كل على حدة، واستخدام الحسابات أدناه أو استخدام ورقة العمل المقدمة (انظر الملف التكميلي).
1. حساب ملليغرام الملاط سيكل () يدار بكل الماوس بضرب وزن الماوس في غرام (ب) بجرعة التحدي المطلوب في ملليغرام من الملاط سيكل جرام من الماوس (ج).
2. حساب حجم الفردية من الملاط سيكل غير مخفف الأوراق المالية المطلوبة للماوس في ميكروليتيرس (د) بتقسيم ملليغرام الملاط سيكل حاجة كل الماوس من الخطوة 3.2.1 () بتركيز الملاط سيكل الأسهم، 160 ملليغرام ملاط سيكل في المليلتر D5W (e)، وضرب 1,000 ميليلتر في المليلتر للتحويل من مليمتر إلى ميكروليتيرس.
3. متوسط حجم المخزون من الملاط سيكل المطلوبة للماوس (ز) بجمع حجم المخزون الملاط سيكل (د) كل الماوس في القمامة من الفئران n ، مقسوماً على عدد الفئران (n).
4. حساب عامل إضعاف متوسط للأسهم الملاط سيكل (ح) بقسمة حجم متوسط الحقن (100 ميليلتر) بمتوسط حجم المخزون من الملاط سيكل المطلوبة للماوس (ز).
5. حساب حجم حقن محددة كل الماوس في ميكروليتيرس (ي) بضرب حجم كل الماوس من الملاط سيكل الأسهم المطلوبة (د) عامل إضعاف متوسط (ح) ومن ثم جولة قبالة إلى العشر الأقرب (تطابق 10 زيادات ميليلتر من المحاقن الحقن).
6. حساب متوسط حجم المطلوب D5W تمييع الأسهم الملاط سيكل (k) عن طريق طرح الأسهم متوسط الملاط سيكل (ز) من حجم متوسط الحقن (100 ميليلتر).
7. حساب المبلغ الإجمالي للأسهم الملاط سيكل في ميكروليتيرس (l) بضرب الملاط سيكل الأسهم متوسط كل الماوس في ميكروليتيرس (ز) عدد من الفئران في هذه القمامة (n) وضرب 1.4 لإنشاء إضافية.
8. حساب المبلغ الإجمالي ل D5W في ميكروليتيرس (m) المطلوبة لتمييع الأسهم الملاط سيكل بضرب متوسط حجم المطلوب D5W (k) على عدد من الفئران (n) وضرب 1.4 لإنشاء إضافية.
إعداد قاسمة التحدي بعد احتساب مبلغ الملاط سيكل الأسهم المطلوبة (l من الخطوة 3.2.7). في BSC، ذوبان الجليد على العدد المطلوب من الملاط سيكل قنينات الأسهم في درجة حرارة الغرفة، بيبيتينج محتوياته إلى مزيج.
1. عندما توجد بلورات الثلج لا أكثر وضوحاً في الطين سيكال المذابة، نقل المبلغ المحسوب للأسهم الملاط سيكال (l من الخطوة 3.2.7) إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.8 مل عقيمة.
2. تمييع للتركيز المطلوب عن طريق إضافة D5W المثلج المحسوبة في الخطوة 3.2.8 (m). تخزين قاسمة التحدي على الجليد.
3. قبل تحميل المحاقن، مزج أنبوب ميكروسينتريفوجي بالتحريك من 20 x، تليها x 3 لرسم وطرد 300-500 ميليلتر من الملاط سيكال مع 500 cc ز 28 نصف بوصة حقنه الأنسولين.
4. وضع ما يقرب من 150 ميليلتر من الملاط سيكل المخفف في نفس المحاقن.
5. نفض الغبار المحاقن طرد الفقاعات من المكبس، والتراجع قليلاً في المحاقن، وثم طرد الفقاعات.
6. الاستغناء عن الملاط سيكل الزائدة إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي حتى المبلغ الصحيح من الملاط سيكل للماوس واحدة، كما تم حسابه للفئران الفردية في خطوة 3.2.5 (j)، يتم تحميل في المحاقن.
إينترابيريتونيلي ضخ ملاط سيكل، وفقا للمبادئ التوجيهية لمؤسسة الرعاية الحيوانية المحلية ذات الصلة، أو استخدام الخطوات المذكورة أدناه.
1. في BSC، فصل الفئران حديثي الولادة من السد كما هو موضح في الخطوة 3، 1.
2. القفا الماوس بالجزء الخلفي الرقبة، باستخدام الإبهام والسبابة.
3. آمنة ذيل الماوس عبر الجزء الخلفي الأوسط وخاتم الأصابع، أو على الجزء الأمامي من الأصابع الخنصر وخاتم.
4. وللحد من تسرب، إمالة الماوس الأطفال حديثي الولادة حيث أن تواجهها النزولي وإدراج الشطب إبرة الإبرة مواجهة بين فريق الخبراء والأعضاء التناسلية، إبقاء الإبرة الضحلة وتحت الجلد.
5. عندما يتم إدخال الإبرة عن 1 سم، اضغط إلى الأسفل وإلى الأمام لتشعر بإبرة ثقب الصفاق. خفض المكبس، حفظ غيض الإبرة المطرد قدر الإمكان، كما الحركات الجانبية يمكن أن تضر أجهزة الماوس ببطء.
6. سحب الإبرة بعناية على مدى 5-10 ق، اتباع نفس مسار الخروج كما هو الحال، الاسترخاء الإصبع الأوسط خلال عملية إزالة لخفض حدة التوتر في الجسم الماوس.
7. للتحقق من وجود تسرب، عقد الماوس لبضع ثوان بعد إزالة الإبرة، لإتاحة الوقت للحقن لإغلاق، ومراقبة أي تسرب أو انتفاخ في مكان الحقن، عند هذه النقطة ينبغي أن لا تستخدم الماوس في التحليل.
  ملاحظة: انتفاخ الجلد في موقع الحقن يشير إلى حقنه داخل فاشلة، مع إينجيكتانت يجري تحت الجلد.
8. ضع الماوس على منشفة ورقية، والسماح بالماوس لاتخاذ خطوة. إذا كان الماوس غير متحرك ل 5 s، ثم اضغط الذيل طفيفة.
9. التقاط الماوس والتحقق من وجود أي تسرب من الملاط سيكل في موقع الحقن. إذا كان هناك تسرب، استبعاد الماوس من التحليل و euthanize الماوس.

4-رصد الماوس

مراقبة الفئران بانتظام للتحقق منها للتوصل إلى نقطة نهاية إنسانية.
1. مراقبة بوستشالينجي ح 2 لأي مضاعفات متصلة بحقن الفئران.
2. رصد بوستشالينجي ح 12 الفئران للاعتلال المتصلة الانتان وتحديد من الفئران في نقطة نهاية إنسانية (انظر الخطوات 4.2-4.3 للمعايير).
3. وفي وقت لاحق رصد كل ح 4-6 لأول يومين، باستثناء 8 ح بين عشية وضحاها، عندما تكون الفئران حديثي الولادة غير المراقب.
4. بعد أيام 2 بوستشالينجي، رصد 1 x x-2 يوميا. إذا كان المرضى الفئران أو الفئران يقلل من درجة الصحة التي لوحظت، ثم زيادة تواتر الرصد لكل ح 4-6.
رصد الفئران حديثي الولادة
1. لأي إجراء ينطوي الفئران حديثي الولادة، نقل الفراش المادية إلى قفص جديد كما هو موضح في الخطوة 3، 1 (ولنفس الأسباب كما ذكر هناك). فحص دقيق الولدان أي التي يتم سحبها من العش بينما التمريض. لا تعتبر أي من الفئران التي تم سحبها من القمامة بينما التمريض يجب أن تكون منتشرة في الفئران.
2. عند إزالة الجزء العلوي من تحديد أي نثر من الفئران حديثي الولادة أما بعيداً عن العش العش، أو عالقة في مواد التعشيش ولكن بعيداً عن هذه ليتيرماتيس، باستثناء الفئران سحبها بعيداً عن القمامة بينما التمريض. الرجوع إلى نقطة النهاية إنسانية المعايير في الخطوة 4، 5 إذا تم العثور على ماوس متناثرة.
قياس ردود الفعل والحراك رايتينج في الفئران.
1. على منشفة ورقية، ضع ماوس على ظهرها ورصد لقدرته على الحق نفسه في فترة أقصاها 4 s. عند وضعه على ظهره، ستسقط الماوس إلى اليسار أو الجانب الأيمن، وعندما يبدأ العد s 4.
  ملاحظة: تصنف في فئة "الحقوق"، الماوس يجب أن تكون قادرة على الحصول على مالا يقل عن ثلاثة من أربعة مخلب منصات على منشفة ورقية ل 1 s. هو لا يزال مجمعة كالتمكن من الحق نفسه إذا كان يقع.
  1. إذا كان الماوس يمكن أن الحق نفسه، ثم انتظر 8 s لتحديد مستوى قدرته على التنقل.
  2. تصنيف الماوس كحقوق "موبايل" إذا كان الحق نفسه واستكشاف البيئة عن طريق اتخاذ خطوات متعددة في صف واحد.
  3. تصنيف الماوس ك "حقوق-السبات العميق" إذا كان الحق نفسه واتخاذ بعض الخطوات لاستكشاف بيئتها. الفئران في هذه المجموعة قد تقع حين أخذ خطوة تبدو هشة على أقدامهم ووقفه بين الخطوات.
  4. تصنيف الماوس ك "حقوق-نونموبيلي" إذا كان يمكن أن الحق نفسه، لكن عدم التحرك الكثير. قد لا يزال تقع أكثر، وأنها لم تتخذ أي خطوات داخل 8 إذا s، فإنه يتم تجميعها كحقوق نونموبيلي.
2. إذا كان الماوس يمكن أن لم الحق نفسه، ثم تصنيف التنقل به استناداً إلى حركة الورك ملاحظتها.
  ملاحظة: تجنب تكرار رصد أو زيادة طول الوقت الماوس وتنفق على ظهورهم لأن هذا يمكن أن يؤثر على سجل النظام ونقطة النهاية إنسانية، كماوس يفشل في الحق نفسه داخل 4 s يمكن في بعض الأحيان القيام بذلك إذا كان منح المزيد من الوقت.
  1. تصنيف الماوس ك "فشل إلى اليمين (المعاملات)-موبايل" إذا كان غير قادر على الحق نفسه ويعرض حركة الورك يتجاوز زاوية 90 درجة من الأفقي. بعض أجهزة الماوس يمكن الحق أنفسهم إذا أعطيت أكثر من 4 s ولكن ينبغي تصنيفها على أنها تقارير المعاملات المالية، لا تزال مع عشرات التنقل استناداً إلى حركة الورك.
  2. تصنيف الماوس ك "تقارير المعاملات المالية-السبات العميق" إذا كان غير قادر على الحق نفسه ويعرض حركة الورك أسفل زاوية 90 درجة من الأفقي.
  3. تصنيف الماوس ك "تقارير المعاملات المالية-نونموبيلي" إذا كان غير قادر على الحق نفسه وقد الساقين أن يهز أو يهتز ولكن لا توجد حركة الورك. أطرافه قد يمدد أو سحب ولكن هل لا يستطيعون التنقل الأفقي. الماوس مريض واضح، وقد وصلت إلى نقطة النهاية بإنسانية.
كرر الخطوة 4، 3 على الجانب الآخر من الماوس، وتسجيل كلا الجانبين.
ملاحظة: انظر الملف التكميلي لتسجيل الملاحظات.
تحديد ما إذا كان الماوس في نقطة نهاية إنسانية ويتطلب القتل الرحيم كما هو مبين في الجدول 1، وأدناه.
1. تصنيف الفئران في تصحيح مختلفة ومستويات التنقل استناداً إلى الملاحظات الرصد الواردة في الخطوات 4، 3 و 4-4. يتم قياس التنقل الماوس لكل جانب، وسلوك متحركة تستخدم لتحديد ما إذا كان الماوس يتطلب القتل الرحيم.
2. تعيين أي الفئران مع الاستقامة المنعكس من تقارير المعاملات المالية--نونموبيلي (أ) أو (ب) تقارير المعاملات المالية-السبات العميق والعثور على فصلها عن العش في نقطة نهاية إنسانية.
3. في رصد نقاط زمنية تتجاوز 20 ح بوستشالينجي، تصنيف أي الماوس مع منعكس رايتينج من "فشل إلى اليمين" على كلا الجانبين كما يجري في نقطة نهاية إنسانية، لأن البيانات المقدمة التنبؤ بدرجة عالية من الدقة أن هذه الفئران في نهاية المطاف فريسة للمرض، ولا استرداد.
منفصلة من الفئران التي تكون euthanized، كما هو محدد في الخطوة 4، 5. إذا كان الماوس المراقبة لا ينظر في نقطة نهاية إنسانية، وضعه في العش الفارغ الثاني في القفص الجديد دون السد، وتواصل مع الفئران حديثي الولادة الأخرى.
مرة واحدة وقد تم رصد القمامة كامل، نقل نصف مواد التعشيش في القفص مع السد، إصلاح عش مع الغرفة في الوسط للفئران حديثي الولادة.
ملاحظة: يمكن أن تسبب شكل غير صحيح عش الفئران مبعثر وتقليل مقدار الرعاية المتاحة التي يمكن أن تقدم السد.
نقل الفئران حديثي الولادة مرة أخرى إلى القفص مع السد.
ضع القمامة في العش بوضع مواد التعشيش بقايا أكثر القمامة ومعسر فإنه بلطف حول غطاء لتأمين مواد التعشيش في المكان.
Euthanize الفئران حديثي الولادة فصل في الخطوة 4، 6 وفقا لمتطلبات المؤسسات المحلية.

5-معايرة الملاط سيكل

التحدي الفئران جرعة التحدي المطلوب (المادة 3)، ورصد النتائج (المادة 4).
مراقبة ما إذا كانت النتيجة النهائية تنتج LD المرجوة، وإذا لم يكن كذلك، كرر المقاطع 3 و 4 مع القمامة جديدة بجرعة تحدي أعلى أو أدنى، تعديله من 5%-10%.
ملاحظة: قد تكون مشابهة الشكل 1B جرعات التحدي لكن بحاجة إلى أن تكون تيتيريد في كل مرفق وسلالة من الفئران.
أيضا، ملاحظة ما إذا كانت الفئران تحقيق نقطة إنسانية أسرع أو أبطأ من حركية المتوقعة في الشكل 1B، وتكرار المقاطع 3 و 4 مع القمامة جديدة بجرعة تحدي أعلى أو أدنى، تعديله من 5%-10%.

النتائج

يمكن اختبار صلاحية الملاط سيكل المخزنة في-80 درجة مئوية مع مرور الوقت متسلسل تمييع وتصفيح مختبرين الملاط سيكل المخزون في الدم الصويا تريبتيك أجار 5% الأغنام تليها ح 24 الهوائية الحضانة عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك عد لمحتوى وحدة (زيمبابوي) تشكيل مستعمرة كولتورابل لتحضير الملاط سيكل وجد ليس لتغيير خلال فترة 6 أشهر، ولم تتأثر صلاحية التخزين المطول في-80 درجة مئوية (الشكل 2). في المتوسط، كل الماوس المانحة أدى ما يكفي الملاط سيكال للطعن في ثلاثة أو أربعة ليتر (البيانات لا تظهر).

بدأت الفئران الطعن في 7 دول مع ملاط سيكل للحث على الانتان أنه للوصول إلى نقطة النهاية إنساني ضمن ح 12 من التحدي، والإنتان أنه تم حل معظمها بواسطة بوستشالينجي ح 48، كما لوحظ في منحنى كابلان-ميير بقاء جنبا إلى جنب من بيانات من أكثر من 200 من الفئران المطعون فيه (الشكل 1A). الفتك كان يعتمد على جرعة التحدي التي تديرها، مع تغيير 5% بجرعة التحدي مما أدى إلى حوالي 15% في الفرق في معدل البقاء على قيد الحياة (الشكل 1B). وتم قياس وزن الجسم الماوس في كل زيارة الرصد. واعتبر فقدان الوزن في جميع الحيوانات المطعون فيها، ويجري غير تمييزية بين الفئران التي انتهت إلى الباقين على قيد الحياة، وتلك التي لا خلال 24 ساعة الأولى بوستشالينجي (الشكل 1). بعد 24 ساعة، بدأت الحيوانات معظم الباقين على قيد الحياة لاستعادة وزنهم، بينما نونسورفيفورس كل تابع لإنقاص وزنه وانتقلت إلى تلك النهاية إنسانية. غير أن نسبة صغيرة من الباقين على قيد الحياة الحيوانات التي احتفظ بها منعكس رايتينج تابع أيضا لإنقاص الوزن أو فشل في كسب الوزن، حتى نهاية التجربة، حتى فقدان قدر 20% وزن الجسم الأولية ضمن ح 40 من التحدي. كما كان هناك تداخل الوزن بين الفئران التي انتهت إلى الباقين على قيد الحياة، وتلك التي لم التغير في الوزن أو الحد الأدنى للوزن لا يمكن كمعيار لنقطة النهاية إنسانية مع الحفاظ على الهدف بدقة تقسيم الباقين على قيد الحياة من نونسورفيفورس.

وتم رصد سلوك الفئران كما ورد في البروتوكول وفي الجدول 2. عرض لقطات صحة الفئات (الشكل 3 ألف-ج). وتظهر هذه الصور الفئات الصحية المختلفة من الفئران الذي فشل في حق أنفسهم بعد وضعها على ظهورهم، وبيان الفرق بين موبايل تقارير المعاملات المالية وعدم المبالاة تقارير المعاملات المالية، وتمييز مهم. لا يتم عرض الفئران صحية دون منازع هذا العصر نشاط السبات العميق تقارير المعاملات المالية؛ ولذلك، هذه الفئة الصحية علامة على المرض واستجابة للتحدي. المرضى الفئران عرض أعراض عدم المبالاة تقارير المعاملات المالية (الشكل 3B) ويمكن التراجع نحو تقارير المعاملات المالية--نونموبيلي (الشكل 3)، حيث لا يزال ساقه بالتوازي مع الساق السفلي، مع قليل من الصفر الورك هزاز الحركة، واحد معايير نقطة النهاية إنسانية. أيضا قد استرداد الفئران، الحصول على زيادة حركة الورك وأصبحت تقارير المعاملات المالية-الجوال (الشكل 3A). منعكس الاستقامة، وتنقل عشرات حددت لكل من اليسار والجانب الأيمن من الماوس كل، وأعلى درجة واستخدمت لتحديد ما إذا كان الماوس قد بلغ نقطة إنسانية. وجمعت المعلومات السلوكية أكثر من 240 الحيوانات وتحدي مع جرعة قاتلة 60 (LD₆₀) من الملاط سيكل، ولوحظت النهاية إنسانية 144 (الشكل 3D-واو و الجدول 1). واستخدمت هذا النهج القائم على الأدلة لتحديد وصقل نقطة النهاية إنسانية عبر أربع مراحل المرض، تصنيف المجربون على أساس كل الاختلافات السلوكية بين الباقين على قيد الحياة ونونسورفيفورس، وجزء صغير من إنسانية النقاط النهائية التي تم التوصل إليها وخلال كل إطار زمني. خلال التجارب المبكرة، عثر الفئران نونموبيلي تقارير المعاملات المالية التي قد لا توجد حركة الورك دائماً الميت ضمن ح 4-6 من هذا السلوك ويحتفل. في جمع المعلومات المقدمة، استخدمت درجة صحة تقارير المعاملات المالية--نونموبيلي كمعيار لنقطة نهاية إنسانية. من بوستشالينجي ح 12-21، بينما كانت euthanized الفئران نونموبيلي تقارير المعاملات المالية، الحيوانات على قيد الحياة ونونسورفيفينج على حد سواء عرض أنماط سلوكية مشابهة جداً ولا يمكن أن تكون متميزة بأي طريقة أخرى (الشكل 3D). من بوستشالينجي ح 21-48، استعادت معظم الباقين على قيد الحياة الفئران على منعكس رايتينج، بينما كانت أقل من 1% السلوكيات تقارير المعاملات المالية لوحظ في الحيوانات التي ستذهب إلى البقاء على قيد الحياة هذه التجربة (الرقم 3E). وهكذا، أصبحت الفئران التي أخفقت في حق أنفسهم من كلا الجانبين معيار إضافي لنقطة النهاية إنسانية خلال هذا الوقت. بين 12 و 20 بوستشالينجي ح، لوحظت 12.5 في المائة العدد الإجمالي لنقاط النهاية إنسانية، مقابل 80.5 في المائة بين 20 و 48 ساعة، و 7% بعد 48 ساعة (الجدول 1). من سمات مميزة بين الفئران التي انتهى الباقين على قيد الحياة والتي ازدادت سوءا في نهاية المطاف إلى نقطة نهاية إنسانية كان فقدان رايتينج المعاكسة، مستقلة عن حركة الورك (3F الشكل). وفي الواقع، بين 20 و 48 ح بعد التحدي، لم ما مجموعة 121 الفئران الحق أنفسهم من كلا الجانبين، مع 116 من هذه الفئران التي تتقدم في نهاية المطاف إلى نقطة إنسانية (والذي يمثل دقة 96% في تحديد الفئران التي سوف لا استرداد). ولوحظت الفئران 11 تتجاوز 48 ساعة بعد التحدي، إلى فشل في حق أنفسهم من كلا الجانبين، و 10 من هذه تقدم إلى نقطة إنسانية (دقة نسبة 91 في المائة). تتجاوز 20 ح بعد التحدي، يتوقع عدد الفئران التي فقدت رايتينج المعاكسة لكلا الجانبين النتيجة النهائية بدقة أكثر من 90 في المائة؛ ولذلك، هذا قد أضيفت إلى معايير إنسانية نقطة النهاية، لتحديد نونريكوفيرينج الفئران في وقت سابق وتقليل الماوس المعاناة (الجدول 1).

تردد أن الفئران بحاجة إلى رصد التغييرات على مر الزمن، بسبب اختلاف معدلات الوفاة بوستشالينجي، ويرد في الجدول 1. ماوس واعتبرت أن تكون في نقطة النهاية الخاصة به إنسانية في أي لحظة إذا أخفقت في الحق نفسه وعرض حركة الورك نونموبيلي على كلا الجانبين، أو إذا كان الماوس عثر متناثرة من العش، كان غير قادر على الحق نفسه، وكانت حركة الورك السبات العميق. الفئران مع أي من هذه الشروط لا يتوقع أن تكون قادرة على الانضمام إلى القمامة، وقد لوحظ أن تكون تقارير المعاملات المالية-نونموبيلي في غضون 4-6 حاء حاء ابتداء من 20 بعد التحدي، تمت إضافة نقطة نهاية إنسانية جديدة نظراً لأن المعلومات المقدمة تبين أن واسعة أغلبية فئران التي تقارير المعاملات المالية من كلا الجانبين وينتهي الخضوع للمرض.

أشرطة الفيديو، والجداول، والموارد المقدمة في هذه المخطوطة أحد موارد تدريس فعال للتعيين السلوكية الصحيحة للفئران المطعون فيه. وسئل المجربون سبعة مشاهدة الفيديو التدريب وقراءة كل من البروتوكول والجداول قبل تعيين سلوك الحيوانات تحدي 60. وكان تحديد نقطة النهاية إنسانية مهمة دقيقة سواء بالنسبة للفئران تقارير المعاملات المالية-نونموبيلي المميزة من الفئران التي عرضها السلوكيات الأخرى (الشكل 4A) والفئران تقارير المعاملات المالية من الفئران التي كانت قادرة على الحق أنفسهم داخل (الإطار الزمني المسموح به الشكل 4).

figure-results-6879
الشكل 1 : منحنى البقاء على قيد الحياة ومعايرة الجرعة الملاط سيكل تغيير الوزن عقب التحدي الملاط سيكل كابلان-ماير- (أ) نتائج بقاء الولدان C57BL/6J الفئران تحدي مع حقن داخل ملاط سيكل في 7 دول. تم الجمع بين البيانات الخاصة بهذا الشكل من تجارب مستقلة باستخدام التحدي متعددة تدار بجرعات تتراوح من 0.7 إلى 1.3 مغ ملاط سيكل كل غرام من وزن الجسم لهذه الفئران. عرض الفئران حديثي الولادة (ب) تحدي مع 0.80 إلى 0.95 مغ ملاط سيكل كل جرام من وزن الجسم من إعداد الملاط سيكل واحد الجرعة تعتمد على علاقة بين مقدار الملاط سيكل نظراً والنسبة المئوية للبقاء على قيد الحياة. (C) النسبة المئوية للتغير في الوزن مقارنة بوزن التحدي، مع خط منقط تدل على فقدان 20% من وزنه من وقت التحدي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

figure-results-7940
الشكل 2 : لا تغيير تركيز زيمبابوي في الأسهم الملاط سيكل المخزنة في-80 درجة مئوية على مدى فترة 6 أشهر. تم اختبار تأثير عمر ملاط سيكل على تركيز زيمبابوي استخدام الانحدار الخطي. ويمثل كل نقطة واحدة قاسمة نفس إعداد الملاط سيكل، متسلسل المخفف ومطلي على مدى فترة 6 أشهر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

figure-results-8538
الشكل 3 : الورك فئات التنقل من الفئران التي تفشل في حق أنفسهم والسلوكيات الحيوانية في مختلف الأوقات بوستشالينجي. الفئران التي تحدت مع الانتان، عند وضعه على ظهورهم، سيتم عرض علامات الإصابة بالأمراض التي يمكن أن يقاس بمدى حركة مفصل الورك. فشل (A) A إلى اليمين (المعاملات)--ماوس متحركة تظهر حركة الورك هزاز على ساقه تتجاوز زاوية 90 درجة من الأفقي. (ب) تقارير المعاملات المالية-عدم المبالاة الماوس يظهر الورك هزاز الحركة ولكن لا تتجاوز زاوية 90 درجة من الأفقي عند أي نقطة أثناء 4 s للرصد. (ج) بعض تقارير المعاملات المالية-نونموبيلي الفئران سوف تمتد الساق، منحنية في الركبة، ولكن سوف تظهر القليل جداً (أقل من 10 ° زوايا) إلى الصفر الورك هزاز الحركة، والساقين ستظل موازية لبعضها البعض. (د) سلوك الحيوان ح 12-21 بوستشالينجي تبين أن فصل فقط تقارير المعاملات المالية-نونموبيلي السلوكيات الناجين من نونسورفيفورس. (ﻫ) من 21 إلى بوستشالينجي ح 48, 4 فقط من أصل 592 السلوكيات تقارير المعاملات المالية المرصودة (0.67%) تنتمي إلى الباقين على قيد الحياة، مما يسمح تصحيح العاكسة التنبؤ بالنتيجة النهائية واستخدامها كالمعيار جديد لنقطة النهاية إنسانية. بوستينفيكشن (و) ح يتجاوز 48، 6 من أصل 131 الفئران (4.55 في المائة) التي كان منعكس رايتينج ذهب على أن تصبح جزءا من مجموعة تقارير المعاملات المالية وضحى بنهاية التجربة، تبرر الرصد المستمر طوال فترة الاسترداد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

figure-results-10214
الشكل 4 : الموارد التعليمية ينتج دقيقة التصنيف السلوكي المجربون المستقلة. تصنيف المجربون تدريبهم من قبل مشاهدة الفيديو المصاحبة لهذا البروتوكول أشرطة فيديو فئران حديثي الولادة 60 في مجموعات صحية مختلفة. (أ) القدرة على التمييز بين نقطة إنسانية مصممة ومتوسط 97% من السلوكيات دقة صنفت كتقارير المعاملات المالية-نونموبيلي أم لا، في حين كانت ضريبي 1% فقط من الفئران نونموبيلي تقارير المعاملات المالية. واعتبرت اثنين بالمئة الفئران زورا نونموبيلي تقارير المعاملات المالية. (ب) تحديد نقطة النهاية الثانية إنسانية المعيار للتمييز بشكل صحيح بين الفئران تقارير المعاملات المالية أو تلك التي لديها القدرة على الحق أنفسهم داخل 4 s لوضعها على ظهورهم تم تعيينها بشكل صحيح في 97 في المائة تحززات، بينما فقط 0.96 في المائة الفئران تم تعيينها بشكل غير صحيح كتصحيح أنفسهم ونسبة 2% فئران تم تعيينها بشكل غير صحيح كتقارير المعاملات المالية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

مرحلة المرض	ج: ارتفاع معدلات الاعتلال، لا وفيات	ب: ارتفاع المراضة، انخفاض معدل الوفيات	C: ارتفاع الإصابة بالأمراض، وارتفاع معدل الوفيات	دال: انخفاض معدلات الاعتلال، وانخفاض معدل الوفيات
ساعات بعد التحدي	0−12	12−20	20−48	> 48
رصد التردد	التحدي وظيفة ح 2	كل ح 4−6	كل ح 4−6، ح 8، بين عشية وضحاها غير المراقب	1−2 مرات يوميا، أكثر إذا لزم الأمر
نسبة مجموع نقاط النهاية إنسانية ولاحظ	0/144	18/144	116/144	10/144
النسبة المئوية لنقاط النهاية إنسانية ولاحظ	0%	12.5 في المائة	80.5 في المائة	7 في المائة
معايير إنسانية نقطة النهاية	1-FTR−Nonmobile على كلا الجانبين		1-FTR−Nonmobile على كلا الجانبين
	2-متناثرة من العش وهو FTR−Lethargic		2-متناثرة من العش وهو FTR−Lethargic
			3-تقارير المعاملات المالية على اليسار أو الجانب الأيمن (مع أي نقاط التنقل)

الجدول 1: تردد لمعايير الرصد وإنسانية نقطة النهاية في مراحل مختلفة من المرض. رصد التردد، نقاط النهاية إنسانية لاحظ، النسبة المئوية لنقاط النهاية إنسانية، ومعايير إنسانية نقطة النهاية خلال المراحل المختلفة للمرض.

تصحيح منعكس	التنقل	الوقت المحدد إلى اليمين بعد وضعها في الخلف	المهلة الزمنية لقياس مقدار الحركة (المحمول/السبات العميق/نونموبيلي)	معايير سجل التنقل
حقوق	موبايل	4 s	8 إضافية s	الماوس يأخذ خطوات متعددة في صف واحد، والحفاظ على قوة الدفع إلى الأمام، ويستكشف بيئته. ألجرو ستسقط لا.
	السبات العميق			الماوس يمكن اتخاذ خطوة ولكن سيتم وقف ووقفه قبل اتخاذ آخر. وقد تنخفض ألجرو.
	نونموبيلي			الماوس لا أية خطوات بعد تصحيح نفسها. وقد تنخفض ألجرو.
فشل إلى اليمين	الوركين المتنقلة		4 نفس s المستخدمة لقياس الاستقامة منعكس	قد حركة الورك نشيطة مع ساقه تناوب تتجاوز 90 درجة من الأفقي مرة واحدة على الأقل خلال 4 s.
	الوركين السبات العميق			حركة الورك يصل إلى إلا تتجاوز 90 درجة من الأفقي.
	الوركين نونموبيلي			قد تحريك أطرافه بتوسيع والتراجع ولكن سوف يتم استدارة الوركين. ألجرو يبدو مريضا جداً.

الجدول 2: رصد جدول والمعايير في تحديد درجة الصحة من الفئران. واستخدمت المعايير المقدمة لتحديد مجموعات الفئات الصحية للفئران، وتقليل الفرق الفردية في تعيين عشرات الصحة.

Discussion

لقد الفئران حديثي الولادة بعد الولادة جداً محدودة التنقل وتفشل في حق أنفسهم بعد وضعها على ظهورهم، حتى عندما النمسوية. من 7 دول، سن الفئران الطعن في هذا النموذج، مجموعة من حركة تمتد من حقوق موبايل موبايل تقارير المعاملات المالية وقد لوحظ في الفئران دون منازع، مع فارق هام، إلا وهي أن ماوس دون منازع في هذا العمر لم يتم عرض السلوك السبات العميق تقارير المعاملات المالية. إلا الفئران وتحدي مع الانتان أنه لوحظ أن تصبح السبات العميق تقارير المعاملات المالية؛ ولذلك، يمكن أن تكون هذه الاستجابة علامة على شدة المرض. يجري منتبهة لقطع من زاوية 90 درجة من الأفقي لحركة الورك يسمح للتعيين متسقة ودقيقة من حركة الورك عدم المبالاة أو المتنقلة في الفئران. الإطار الزمني ل 4 s لترى إذا كان ماوس يمكن الحق نفسه اختير للفئران دون منازع كانت قادرة على الدوام حق أنفسهم داخل هذا الإطار الزمني. المتكررة تجنب القياس الماوس نفسها، بينما الوقت حق أنفسهم وقياس حركة الورك واقتصر على 4 s، لتجنب تعب مفرطة الماوس، وخلاف ذلك يمكن أن يؤثر على قدرتها على الحصول على الغذاء والدفء ويمكن أن تؤثر به التشخيص للحصول على أفضل. تصحيح نفسها من اليسار واليمين ولوحظت، وأعلى درجات واستخدمت لتحديد ما إذا كان الماوس على نقطة نهاية إنسانية، لأنه تم العثور على بعض أجهزة الماوس لعرض تقارير المعاملات المالية--نونموبيلي على جانب واحد حتى الآن تنقل أعلى على الجانب الأخرى وب (ه) قادراً على استرداد في نهاية المطاف.

سجل النظام المستخدمة لتقييم صحة الماوس تعتمد على تطبيق قطع القاطع لما هو مجموعة حركة، وعليه، يمكن أن تكون عرضه للتحيز الفردية. وكان تدريب الموظفين معا لضمان كل شخص سجل الفئران نفسها؛ ومع ذلك، ستبقى هناك يرجح أن مستوى الذاتية مما يؤدي إلى تباين. وتم تقييم اتساق التهديف بوجود سبعة الباحثين الذين لم يجر سابقا رصد الماوس الولدان تعلم الشروط المبينة في هذا البروتوكول، والفيديو، ثم، بشكل مستقل تعيين السلوكيات وتحديد إنسانية نقطة النهاية. ولوحظ دقة 97% مع التهديف أجريت على الفئران تحدي 60، مما يوحي بأن التحيز الفردية لا تلعب دوراً كبيرا في التعيينات السلوكية من هذا الطراز. بروتوكول الرصد السلوكي قدم يستند إلى الملاحظات للحيوانات التي طعنت في 7 دول، ولكن الفئران الذين تقل أعمارهم عن 6 أيام في حالة صحية دون منازع لا يمكن استمرار الحق أنفسهم. وبالتالي، تعذر تطبيق معايير وصف نقطة النهاية إنسانية مباشرة للفئران الأصغر سنا. إذا استخدمت فئران أصغر سنا في هذا النموذج التجريبي أو إذا تم تطبيق نموذج تحدي مختلفة مع حركية مختلف الأمراض، ثم نقطة النهاية إنسانية مناسبة يجب أن تكون معايير وضعت وتجريبها لتجنب القتل الرحيم للفئران التي بخلاف ذلك، وفي نهاية المطاف، استرداد. يعرض سجل النظام وسيلة قوية لتحسين تصنيف إنسانية نقطة النهاية، باختبار وتأكيد، يمكن أن يحتمل أن تطبق على نماذج أخرى.

إعداد كل من الملاط سيكال أو استخدام سلالة جديدة من الماوس المطلوبة ريتيتراتيون الجرعة الملاط سيكال لإدارة تحقيق جرعة مميتة مماثلة. توحيد كل إعداد بقراءات الاهتمام، إلا وهي البقاء على قيد الحياة، بدلاً من إعطاء نفس العد الجرثومي. ترك تركيز كل إعداد الملاط سيكال البكتيرية قابلة للحياة تختلف قليلاً، ويحتمل أن تكون بسبب الاختلافات في البكتيريا commensal الجهة المانحة أو بسبب الفروق في الوزن في مصفاة خلية من بوستفيلتريشن الأسهم الملاط سيكال. أثناء معايرة الملاط سيكل، ليتر الأول والثاني تم تقسيمها إلى مجموعتين وطعن كل نصف من القمامة مع أحد جرعتين حيث أن كل من الجرعات سيتم اختبارها في اثنين ليتر. إذا لم يتطابق مع معدل البقاء على قيد الحياة الناتجة عن المستوى المطلوب، ثم جرعة التحدي كان أما تزيد أو تنقص بنسبة 5%-10% وتكرار هذه التجربة. واستخدمت ليتر متعددة لمراعاة الاختلافات القمامة للقمامة التي يمكن أن تسبب المقاومة أو زيادة القابلية للانتان عبر القمامة. من المهم لدقة عيار الأسهم الملاط سيكال مع كل إعداد جديدة لضمان أن المعايرة الجديدة من الملاط سيكال مماثلة للسابقة الملاط سيكال الاستعدادات. ولوحظت فترات الزائدة الضوضاء والاهتزاز، وعلى وجه التحديد أثناء ضغط الأسفلت، وتشييد مبنى مجاور والطريق، زيادة التوتر في السدود. وهذا يرتبط بزيادة معدلات الإبدال، وتتأثر وفيات التجارب البقاء على قيد الحياة، حتى تؤثر على الفئران دون منازع، مما يشير إلى أن يمكن أن يكون هناك تأثيرات دخيلة على بقاء المواليد التي تحتاج أيضا إلى مراقبة ل.

وشملت الأساليب السابقة لإعداد المخزون الملاط سيكل استخدام ملاط سيكل جديدة أو إعداد الملاط سيكل المجمدة، باستخدام مجموعة متنوعة من الطرق، بما في ذلك التخزين في الجلسرين التي ستحول لا محالة خلال التحدي. بينما يوفر استخدام ملاط سيكل جديدة ميزة وجود تركيبة بكتيرية أقرب إلى محتويات سيكل الأصلي، هناك الخطر الفرق بين الفئران فرادى المانحين بسبب اختلاف البكتيريا كومينسال. بينما تم تصغير هذا باستخدام الجهات المانحة سيكال من نفس البائع مع الحد الأدنى من الوقت بين وصول وتطور التجربة، هذا يمكن أن تصبح خياراً تكلفة باهظة لبعض المختبرات وتوقيت النقل والإمداد تحديا آخر في وجود تجربة الفئران مطابقة سن متاح عند ابتداء من ملاط سيكل في الفئران حديثي الولادة التي كانت 7 أيام. واستخدمت طريقة بديلة لاستخدام ملاط سيكال جديدة، حيث تم تجميع محتويات متعددة المانحين الكبار سيكال وحراكه في D5W، المجمدة في-80 درجة مئوية دون والغليسيرول، وإذابة قاسمة واحد في وقت واحد للتجارب. يمكن تحويل استخدام ملاط سيكل المانحين الكبار لدراسة الانتان الوليدي يحتمل أن تكون نوعا من البكتيريا الموجودة في الطين سيكل أن الماوس الولدان لم يتعرض ل، إلا أنها استراتيجية تسمح لدراسة الانتان الوليدي الفئران و وقد استخدمت لدراسة البيولوجيا الماوس الولدان في¹⁴^،^،من¹³¹⁵الماضية. وقد تضعف الملاط سيكل في D5W لتوفير التغذية للبكتيريا، مما سمح بإنشاء العدوى النشطة بمجرد تم حقن البكتيريا، وأنجز لتقليد توافر المغذيات في التجويف الصفاقى أثناء التهاب الأمعاء والقولون النّاخر. والغليسيرول لم يدرج كعامل استقرار في تجميد البكتيريا بسبب الآثار الجانبية السلبية المحتملة التي يمكن أن تنشأ من حقن والغليسيرول وحدها. إذا كان قد أدرج والغليسيرول في إعداد الملاط سيكل، ثم الضرر المحتمل أن والغليسيرول وحدها يمكن حمل سوف تحتاج لفحصها لجانب بما في ذلك الجلسرين فقط (تفتقر سيكل ملاط) حقنه في الفئران، مما سيزيد من الماوس الاستخدام. صلاحية البكتيريا مخزون الملاط سيكال تم اختباره بعد تجميد الأسهم الملاط سيكال دون والغليسيرول ووجد أن تكون ثابتة، بدون أي تغيير في تركيز البكتيريا في مختبرين منفصلة من نفس إعداد الملاط سيكال المخزنة في-80 درجة مئوية أكثر 6 فترة شهر. هذا يوحي بأن التخزين دون والغليسيرول عمليا في تقديم نتيجة البيولوجي متسقة. كما يسمح باستخدام الجزء الأكبر--أعد تجميد الأسهم الملاط سيكل لاستخدام الفئران التي ولدت داخل المنظمة، خفض التكلفة، والاستفادة من الفئران الذكور التي يمكن أن الفائض من تربية، وبالتالي تقليل الهدر الماوس.

من المهم تحديد التحديات الفاشلة في الفئران تجنب إضافة الضوضاء الإضافية للنظام. بعد أن خضع لحقنه داخل من الملاط سيكال، لوحظت الفئران لوجود انتفاخ تحت الجلد، مما يدل حقن فاشلة التي تمت فعلا تحت الجلد. لوحظت الفئران لتسرب في موقع الحقن، سواء مباشرة بعد إزالة الإبرة وبعد السماح لهم باتخاذ خطوة بعد الحقن، نظراً لأن الفئران في بعض الأحيان تسرب (نادراً) إلا بعد تحريك الطرف المصاب موقع الحقن باتخاذ خطوة. وجود انتفاخ أو تسرب عقب الحقن أدى إلى إزالة الماوس من التحليل. بعد كل شيء، أما هذه يمكن أن يؤدي إلى نتائج مختلفة نظراً لكمية غير صحيحة من الملاط سيكال حقن بفارق 5% بجرعة التحدي وقد لوحظ أن تؤثر على بقاء اللاحقة.

التحدي الملاط سيكل تجارب غالباً ما يلزم متفاوتة الهدف جرعات مميتة مع اختلاف جرعات معدلة حسب الوزن. ونتيجة لهذا، يمكن أن تتراوح أحجام حقن من قدر ضئيل من 20 ميليلتر وتصل إلى 100 ميليلتر. متناسباً مع الخطأ التجريبية المرتبطة بإبرة الميت يتغير حجم أيضا جنبا إلى جنب مع حجم الحقن وزيادة صعوبة مباشرة مقارنة جرعات مختلفة. مع تعديل بسيط لتوحيد حجم الحقن، يتم إزالة مصدر هذا الفرق من التجربة.

نظام الرصد السلوكي للماوس الولدان المستخدمة في هذا البروتوكول هو أول نوعه. القصد الباحثين على إجراء البحوث الأخلاقية مع الفئران حديثي الولادة غالباً ما يواجهون تحديات نقص الموارد لتقييم رفاه الحيوان في هذا العصر. ويبدأ نظام الرصد المقدمة بديهية ومتسقة لمعالجة هذه الفجوة في المعرفة. الأهم من ذلك، هذا النهج القائم على الأدلة ليس فقط يزيد من جودة البيانات التجريبية التي تم الحصول عليها ولكن، في الوقت نفسه، كما يقلل من معاناة الحيوانات التجريبية.

Disclosures

الدكتور جيمس ين يتلقى الدعم من المعاهد الوطنية للصحة (NIH)/الوطني معهد العلوم الطبية العامة (R01GM128452) وفي المعاهد الوطنية للصحة/الوطنيةيونيس كينيدي شرايفر معهد صحة الطفل والتنمية البشرية (NICHD) ( R01HD089939).

Acknowledgements

خاص بفضل هاريسون كلير والحيوان رعاية مرفق في مستشفى بحوث المعهد (بكتشر كولومبيا البريطانية للأطفال) لدعمهم في أعمال الحيوان، وكذلك للدكتور بو-يان تشنغ على توجيهاتهم ومدخلات بشأن رصد الحيوان ورفاه.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 - 20 μL pipette tips	VWR	732-0799
1.8 mL Microcentrifuge tube	Costar	3621
100 - 1000 μL pipette tips	VWR	732-0801
1 - 200 μL pipette tips	VWR	732-0800
15 mL Centrifuge tube	FroggaBio	TB15-25
23G1 needles	Becton Dickinson	305145	only the needle, not the syringe, used for pinning mouse to styrofoam
28G 0.5 mL Insulin syringe	BD	329461
2 mL Cryogenic vial	Corning	430488
50 mL Centrifuge tube	Fisher scientific	14-432-22
5 mL pipette	Costar	4487
6 - 10 week old C57BL/6J adult mice	Jackson Laboratories	664
7 + day old C57BL/6J neonatal mice	Bred in house	n.a
70 μm Cell strainer	Falcon	352350
Defibrinated Sheep's Blood	Dalynn	HS30-500
Dextrose 5% Water (D5W)	Baxter	JB0080
Dissecting forceps	VWR	82027-386
Dissecting Scissors, Sharp Tip	VWR	82027-592
Dissecting Scissors, Sharp/Blunt Tip	VWR	82027-594
Ethanol (HistoPrep 95% Denatured Ethyl Alcohol)	Fisherbrand	HC11001GL	diluted to 70% with double distilled water
Ethanol-proof marker; Lab marker	VWR	52877-310
EZ Anesthesia Vaporizer	EZ Anesthesia	EZ-155
Germinator 500, Dry sterilize surgicial instrument (Hot bead sterilizer)	Braintree Scientific	GER 5287-120V
Isoflurane	Fresenius Kabi	CP0406V2
Micro Spatula	Chemglass	CG-1983-12
Pipette-Aid	Drummond	4-000-100
Rainin Classic Pipette PR-1000	Rainin	17008653
Rainin Classic Pipette PR-20	Rainin	17008650
Rainin Classic Pipette PR-200	Rainin	17008652
Scale	Sartorius	BL 150 S
Specimen forceps	VWR	82027-440 / 82027-442
Square 1000 mL Storage Bottle	Corning	431433
Styrofoam board	Any	n.a
Sure-Seal Mouse/Rat euthanasia chamber	Euthanex	EZ-178
Tryptic Soy Agar	Sigma-Aldrich	22091-2.5KG
VX-200 Lab Vortex Mixer	Labnet International	S0200
weigh paper	Fisherbrand	09-898-12B

References

Liu, L., et al. Global, regional, and national causes of child mortality in 2000-13, with projections to inform post-2015 priorities: an updated systematic analysis. The Lancet. 385 (9966), 430-440 (2015).
Wynn, J. L., et al. Increased mortality and altered immunity in neonatal sepsis produced by generalized peritonitis. Shock. 28 (6), 675-683 (2007).
Fink, M. P. Animal models of sepsis. Virulence. 5 (1), 143-153 (2014).
Wynn, J. L., et al. Defective innate immunity predisposes murine neonates to poor sepsis outcome but is reversed by TLR agonists. Blood. 112 (5), 1750-1758 (2008).
Cuenca, A. G., et al. Critical role for CXC ligand 10/CXC receptor 3 signaling in the murine neonatal response to sepsis. Infection and Immunity. 79 (7), 2746-2754 (2011).
Gentile, L. F., et al. Protective immunity and defects in the neonatal and elderly immune response to sepsis. Journal of Immunology. 192 (7), 3156-3165 (2014).
Cuenca, A. G., et al. Delayed emergency myelopoiesis following polymicrobial sepsis in neonates. Innate Immunity. 21 (4), 386-391 (2015).
Gentile, L. F., et al. Improved emergency myelopoiesis and survival in neonatal sepsis by caspase-1/11 ablation. Immunology. 145 (2), 300-311 (2015).
Wynn, J. L., et al. Targeting IL-17A attenuates neonatal sepsis mortality induced by IL-18. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), E2627-E2635 (2016).
Fallon, E. A., et al. Program Cell Death Receptor-1-Mediated Invariant Natural Killer T-Cell Control of Peritoneal Macrophage Modulates Survival in Neonatal Sepsis. Frontiers in Immunology. 8, 1469 (2017).
Young, W. A., et al. Improved survival after induction of sepsis by cecal slurry in PD-1 knockout murine neonates. Surgery. 161 (5), 1387-1393 (2017).
Rincon, J. C., et al. Adjuvant pretreatment with alum protects neonatal mice in sepsis through myeloid cell activation. Clinical & Experimental Immunology. 191 (3), 268-278 (2018).
Starr, M. E., et al. A new cecal slurry preparation protocol with improved long-term reproducibility for animal models of sepsis. PLoS ONE. 9 (12), e115705 (2014).
Hansen, L. W., et al. Deficiency in milk fat globule-epidermal growth factor-factor 8 exacerbates organ injury and mortality in neonatal sepsis. Journal of Pediatric Surgery. 52 (9), 1520-1527 (2017).
Fujioka, K., et al. Induction of heme oxygenase-1 attenuates the severity of sepsis in a non-surgical preterm mouse model. SHOCK. 47 (2), 242-250 (2017).
Al Asmari, K. A., et al. Protective effect of quinacrine against glycerol-induced acute kidney injury in rats. BMC Nephrology. 18, PMC5273840 (2017).
Geng, X., et al. Differences in gene expression profiles and signaling pathways in rhabdomyolysis-induced acute kidney injury. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 8 (11), 14087-14098 (2015).
Kim, J. H., et al. Macrophage depletion ameliorates glycerol-induced acute kidney injury in mice. Nephron Experimental Nephrology. 128 (1-2), 21-29 (2014).
Nara, A., et al. Evaluations of lipid peroxidation and inflammation in short-term glycerol-induced acute kidney injury in rats. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 43 (11), 1080-1086 (2016).
Zager, R. A., Johnson, A. C. M., Lund, S., Hanson, S. Acute renal failure: determinants and characteristics of the injury-induced hyperinflammatory response. American Journal of Physiology Renal Physiology. 291 (3), F546-F556 (2006).
Olfert, E. D., Godson, D. L. Humane Endpoints for Infectious Disease Animal Models. Institute for Laboratory Animal Research Journal. 41 (2), 99-104 (2000).
Canadian Council on Animal Care. . Guidelines on: choosing an appropriate endpoint in experiments using animals for research, teaching and testing. , (1998).
Nemzek, J. A., Xiao, H. Y., Minard, A. E., Bolgos, G. L., Remick, D. G. Humane endpoints in shock research. SHOCK. 21 (1), 17-25 (2004).
Morton, D. B. A systematic approach for establishing humane endpoints. Institute for Laboratory Animal Research Journal. 41 (2), 80-86 (2000).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

143

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: