Un modelo de ratón controlado para la Sepsis Neonatal polimicrobiana

Resumen

Este protocolo proporciona los pasos necesarios para establecer y evaluar sepsis neonatal en ratones de 7 días de edad.

Resumen

La sepsis neonatal sigue siendo una carga global. Se necesita un modelo preclínico de intervenciones profilácticas o terapéuticas eficaces a la pantalla. Sepsia polimicrobial de ratón neonatal puede ser inducida por inyección mezcla cecal por vía intraperitoneal en el día de la vida 7 ratones y monitoreo para la semana siguiente. Se presentan aquí los pasos detallados necesarios para la implementación de este modelo de sepsis neonatal. Esto incluye hacer un stock homogéneo de la mezcla cecal, diluir a una dosis ajustada por peso y basura, un esbozo de la agenda de seguimiento y la definición de categorías de salud observados utilizan para definir criterios de valoración humanas. La generación de un stock homogéneo de la mezcla cecal de los donantes permite la administración en muchas camadas con el tiempo, reduciendo la variación entre los donantes y evitar el uso de glicerol potencialmente tóxico. La estrategia de control utilizada permite la anticipación de resultados de supervivencia y la identificación de los ratones que progresaría más adelante a la muerte, lo que permite una identificación anterior del extremo humano. Dos principales características de comportamiento son utilizados para definir los resultados de salud, es decir, la capacidad de los ratones neonatales a sí mismos cuando se coloca en su espalda y su nivel de movilidad. Estos criterios potencialmente podrían aplicarse a extremos humana dirección en otros estudios de enfermedad neonatal en ratones, como se realiza un estudio piloto para confirmar la exactitud. En conclusión, este enfoque proporciona un método estandardizado para sepsis neonatal modelo en ratones, mientras que proporciona recursos para evaluar el bienestar de los animales utilizado para definir principios extremos humanos para los animales desafiados.

Introducción

La sepsis es la principal causa de muertes infecciosas recién nacido humano¹. Porque recién nacida sepsis es mal entendida, poco progresos en ambos la identificación de recién nacidos en riesgo temprano durante la enfermedad y el desarrollo de tratamientos eficaces o profilaxis. Esto requiere el uso de modelos animales de sepsis para entender mejor el proceso y prueba de posibles intervenciones. Además, los roedores adultos responden de diferente manera a sepsis, con diferencias estadísticamente significativas en el número de bacterias a administrar para obtener la misma dosis letal (LD) y las diferencias en la respuesta del huésped resultante en comparación con los recién nacidos². Así, sepsis neonatal tiene que estudiarse en los recién nacidos. Varios modelos de sepsis adultos se han utilizado en la investigación de la sepsis. Se trata de un desafío intravenoso con organismos específicos implicados en la sepsis humana adulta o ligadura cecal y de la puntura (CLP). CLP es un modelo endógeno desafío donde el ciego es quirúrgico aislado, ligado y perforado para permitir la salida del contenido intestinal al peritoneo, llevando eventualmente a la diseminación sistémica de los microbios y sus productos³. Sin embargo, el procedimiento quirúrgico para establecer CLP es letal para animales recién nacidos; por lo tanto, un método alternativo es necesario imitar el reto polimicrobial de CLP para inducir sepsis neonatal. El modelo de mezcla cecal para sepsis neonatal polimicrobiana fue desarrollado para hacer frente a esta necesidad, por el que el contenido cecal de animales es cosechado, suspendido en estéril dextrosa 5% en agua (D5W) e inyectado por vía intraperitoneal en ratones recién nacidos². Esto se ha, convertido en un modelo cada vez más popular para el estudio de sepsis en animales recién nacidos y adultos y ha avanzado sustancialmente la visión mecanicista de la enfermedad proceso en^{4,5,6,7 ,8,9,10,11,12,13,14,15}.

Dada la creciente utilización de este modelo y el deseo de los investigadores para comparar directamente los resultados a través de publicaciones, hay una necesidad de los aspectos técnicos a ser bien descritos y estandarizados a través de estudios. Estandarización aplica a tres aspectos del modelo, es decir, i) la preparación de la acción de mezcla cecal, ii) la preparación de las alícuotas de desafío para la inyección en animales de experimentación y iii) la definición del extremo humano por el que los animales se consideran a los que no sobreviven en los experimentos de desafío. Específicamente, métodos para preparar el caldo mezcla cecal a menudo se hace referencia al artículo original introducción el modelo². Un breve resumen de este modelo es que contenido cecal de ratones adultos era cosechado, suspendido en D5W estéril a una concentración de 80 mg/mL y dentro de 2 h inyectar los animales experimentales. Este modelo original utilizado ratones de la misma edad, de la misma ubicación del vendedor, que se encuentra en sus instalaciones de investigación respectivos para menos de 2 semanas antes de la cosecha el contenido cecal. El uso de ratones criados internos, aunque reduciendo el coste de entrega proveedor regular y permitiendo el uso de ratones exceso de una gama más amplia de sexo y edad, también sustancialmente aumentado variabilidad de donante a donante. Esto motivó el desarrollo de una técnica alternativa, por el contenido cecal de varios ratones se agruparon para preparar una acción grande, que era entonces alícuotas y almacenados a-80 ° C¹³. Este método alternativo fue adaptado por múltiples grupos^14,15. Sin embargo, esa adaptación resultó en algunas variaciones técnicas, tanto en los medios de almacenamiento utilizados (10% o 15% de glicerol o D5W solo) como en la estrategia de filtración para eliminar partículas (filtración gradual a través de un 860 μm y, entonces, un 190 filtro o individuo filtraciones a través de 100 μm o 70 μm filtro)^13,14,15. La inyección de glicerol sólo podría causar daños, dado que las inyecciones de glicerol 25% - 50% se han utilizado como un modelo de roedor de lesión renal^{16,17,18,19, 20}. Para evitar los efectos secundarios no deseados de glicerol, la preparación de stock la mezcla ciego para los ratones en este estudio se congela en D5W sin glicerol, y se realizan pruebas de viabilidad bacteriana de almacenamiento a-80 ° C. La estrategia de filtración utilizada en este estudio es un paso a través de un filtro μm 70, que no se ha comparado directamente a las otras estrategias de filtración enumeradas.

Dosis letales ajustado por el peso de la mezcla inyectada de cecal pueden variar de planta a planta y deben ser dosificados hacia fuera a la letalidad deseada para los grupos individuales. Con dosis de desafío diferente, los volúmenes de desafío que cambian por necesidad. Sin embargo, este detalle metodológico no se ha divulgado antes. Además, estrategias para los procedimientos estándar, como la inyección intraperitoneal, se elaboran raramente en dentro de la literatura, sino técnicas individuales pueden afectar ya sea ratones recién nacidos tener fugas cuando se inyecta y el impactan de sus resultados finales.

Bienestar de los animales, incluyendo una definición del criterio de valoración humana, es un aspecto central de este modelo y en cualquier modelo de infección e inflamación en roedores²¹. En 1998, el Consejo Canadiense sobre el cuidado Animal (CCAC) publicó directrices extensas para la selección de extremo humano, definir el punto final humanitario como "cualquier actual o potencial de dolor, angustia o malestar debe ser minimizado o paliar eligiendo los primeros extremo que es compatible con los objetivos científicos de la investigación"²². Otros también precaución que deben establecerse criterios de valoración humanas basada en la justificación científica y no en una interpretación subjetiva de estado solo^{21 del animal}. Mientras que hay una gran cantidad de recursos para clínicas, conductuales y condición corporal muestra-criterios para extremo humano, incluso en el contexto de la infección y la inflamación específicamente^21,23,24, ninguno de estos , incluidas las directrices de la CCAC para punto final humanitario²², mención a ratones recién nacidos. Por lo tanto, objetivamente y científicamente justificadas extremos humanos son mucho más difíciles de establecer para los animales recién nacidos, dada su limitada capacidad de comportamiento y la falta de evidencia de criterios como la pérdida de peso, que se utiliza comúnmente para el adulto ratones. Actualmente, los criterios para el extremo humano utilizado para ratones neonatales de 5 a 12 días de edad en la literatura de cecal mezcla toda referencia al manuscrito original que introdujo el modelo². En este trabajo original, la definición de extremo humano para animales recién nacidos se basó en dos criterios; es decir, la ubicación del ratón fuera del nido (dispersión) y la falta de manchas de leche habían sido vistos a causar la muerte dentro de horas. Un asunto que complica en asignar un extremo humano es que manchas de leche llegan a ser difíciles de ver en cepas de ratón con pelaje oscuro, como la cepa C57BL/6J comúnmente empleada, después de la primera semana de vida, mientras que los animales enfermos son monitoreados hasta el día 14 de vida (DOL). Más animales muertos pueden encontrarse postchallenge cuando al aplicar estos criterios (propia observación inédita); así, una definición más rigurosa de extremo humano es necesaria para aliviar el sufrimiento a animales de experimentación y evitar mortalidad en situaciones donde el resultado podría ser exactamente discernir antes.

Todos tres aspectos metodológicos del modelo de mezcla cecal son presentados en un procedimiento de funcionamiento de estándar que detalla la preparación de material cecal de la mezcla, un método para inyectar en animales de experimentación que mantiene la constante de volumen de inyección entre las dosis y reduce el riesgo de fugas y la definición de extremo humano para ratones de 7 a 12 días de edad basado en un sistema de modelado de comportamiento. Comportamiento información de cuentas de salud de ratón más de 240 animales recogido y agrupado por resultados de supervivencia final, demostrando una definición basada en pruebas de extremo humano. El sufrimiento de los animales de experimentación se reduce mediante la identificación de ratones neonatales moribundos en el punto posible más temprano, mientras que los resultados de supervivencia biológicamente significativas se pueden inferir mediante la observación de las variables clave. La representación visual de la preparación de la mezcla cecal y comportamientos ratón neonatal servirá como un excelente recurso para cualquier grupo de estudio de sepsis o reto recién nacido modelo animales.

Protocolo

Todos los experimentos de este protocolo han sido aprobados por el Comité de cuidado Animal de Universidad de Columbia Británica bajo número de protocolo A17-0110.

1. esterilización de la herramienta

1. En un gabinete de seguridad biológica (BSC), encender y precaliente el esterilizador de grano caliente a 250 ° C, por lo menos 30 minutos antes de su uso.
2. Sumergir las herramientas en etanol al 70%.
3. Sumerja los instrumentos en el esterilizador de grano caliente precalentado durante un mínimo de 1 minuto.
   Nota: Los mangos de las herramientas se calientan y pueden quemarse si se dejan en el esterilizador de bolas calientes durante más de 1,5.
4. Rocíe una estera de toallas de papel con etanol al 70% para esterilizarlo.
5. Quitar las herramientas de la esterilizadora de grano caliente sin tocar la parte esterilizada de la herramienta las asas sin esterilizar otras herramientas sumergidas y en las toallas de papel rociado de etanol.
6. Esperar 30 s a 2 min de las herramientas se enfríe antes de usarlas para la disección.

2. preparación de la mezcla cecal

1. Preweigh tubos de centrífuga de 15 mL (uno tubo de cada cinco ratones siendo sacrificados).
2. Eutanasia a los donantes cecal de la mezcla según las pautas de cuidado de los animales locales o utilizar el siguiente protocolo.
   Nota: Hasta 40 ratones C57BL/6J entre 6 y 12 semanas viejo fueron utilizado para la preparación de la mezcla cecal, con hasta cinco ratones siendo sacrificados a la vez.
   1. Transferencia de los ratones a la cámara de eutanasia y la máquina de la anestesia isoflurano en 5% con la perfusión de oxígeno.
   2. Controlar los ratones para observar la pérdida de la capacidad para moverse y para verlos entrar en el plano quirúrgico de anestesia y por último, dejan de respirar.
   3. Quite un ratón de la cámara de eutanasia, pellizque su pata y observar cualquier retracción de la pierna o la inhalación. Si bien está presente, regresar el ratón a la cámara de eutanasia; de lo contrario, continuar.
   4. Enfermos eutanasia a los ratones mediante dislocación cervical aguda.
3. Realizar la disección del intestino ciego, utilizando herramientas preesterilizadas y refrigeradas (ver sección 1) en un BSC.
   1. Las patas del ratón a una Junta de espuma de poliestireno extruido con agujas 23 G para que el ratón tenga su abdomen el perno. Asegure y luego rocíe el abdomen con etanol al 70%.
   2. Usando tijeras y pinzas estériles, cortar a través de la piel, afloje la piel de revestimiento peritoneal con las tijeras y corte abierto una región rectangular de la ingle al esternón y lado izquierdo al lado derecho. Retire cualquier piel de peritoneo.
   3. Cambiar a un nuevo par de herramientas estériles para cortar a través del peritoneo, haciendo una abertura rectangular, como se hizo para la piel, herramientas de cambio si los utilizan contacto la piel.
   4. Identificar el intestino ciego, que debe estar en ejecución izquierdo a derecha todo el cuerpo. Alteran el tejido conectivo para identificar las ramas intestino ciego de los intestinos y para cortar el intestino ciego de los intestinos. Lugar el ciego en una hoja esterilizada de peso papel.
      Nota: Peso de papel puede esterilizarse mediante pulverización con etanol al 70% en ambos lados y dejándola secar, o por la irradiación UV. Alternativamente, el ciego puede ser diseccionado en una placa de Petri estéril.
4. Extrusión de contenido cecal
   1. En un BSC, herramientas estériles para cortar a través de ambos extremos del intestino ciego.
   2. Sostenga el centro del ciego con pinzas estériles y use una espátula de metal plano estéril a suavemente inserte el contenido cecal del corte, mediante un movimiento de balanceo y evitar un movimiento de rascado que podría romper el epitelio. Recoger el contenido y colocar en un tubo de centrífuga de 15 mL previamente.
   3. El contenido cecal de un máximo de cinco ratones de la piscina en el mismo tubo. Pesar nuevamente el tubo una vez que se han añadido todo el contenido.
      Nota: Esperar un promedio de 300 mg y hasta a 390 mg de mezcla cecal por ratón, que requieren 1,8 a 2,4 mL de D5W por resuspensión por ratón; por lo tanto, usar más de cinco ratones durante este paso puede resultar en exceso el tubo de centrífuga de 15 mL.
   4. Limpie las herramientas con una toalla de papel rociado de etanol y esterilizar, repitiendo los pasos 1.2-1.6.
5. Filtración de lodos cecal
   1. Pesar el tubo de centrífuga con contenido cecal y calcular la cantidad de D5W para añadir al contenido cecal dividiendo el peso del contenido cecal la acción concentración en miligramos por mililitro, como en la siguiente ecuación.
      
   2. En un BSC, añada la cantidad necesaria de D5W helada para el tubo de centrífuga de 15 mL que contiene el contenido cecal.
   3. Mezclar 15 mL tubo de centrífuga vertical y horizontalmente para 30 s. comprobación de partículas de más de 1-3 mm de diámetro y si está presente, continúe Vortex partículas grandes todos visiblemente ha desaparecido.
   4. Coloque un filtro estéril de células 70 μm en un tubo de centrífuga de 50 mL que se coloca en hielo. Pipetear 4 mL de la mezcla cecal resuspendida en el colador de la célula y, luego en el tubo de la colección. Resuspender las partículas mediante pipeteo arriba y abajo 2 x x-3. Suavemente saque burbujas para aumentar la velocidad de filtración agitando el contenido con la punta de la pipeta hasta que no hay más gotas se filtra.
      Nota: Cuando se mezcla, puede haber partículas lo suficientemente grandes como para tapar la pipeta de 5 mL. En este caso, repita el Vortex de paso 2.5.3 y si la solución aún no se rompen aparte, utilizar la pipeta para presionar las partículas contra la pared del tubo de centrífuga.
   5. Repita el paso 2.5.4, cambio de filtros de células entre cada tubo de mezcla del ciego y la piscina todo el contenido en el tubo de colección de centrífuga de 50 mL mismo mantenido en hielo o en un segundo tubo de centrífuga de 50 mL si el volumen del filtrado excede el nivel de hielo en la nevera.
6. Parte alícuota de la mezcla cecal.
   1. En su caso, se combinan múltiples tubos de 50 mL mezcla cecal filtrado de paso 2.5.5 en un envase estéril más grande (por ejemplo, una botella de 1.000 mL y almacenamiento). Entonces, vortex por 15 s y lugar 20 mL en un tubo de centrífuga de 50 mL nuevo.
   2. Vórtice el stock de cecal de la mezcla que se encuentra en el tubo de centrífuga de 50 mL para 5-10 s y alícuotas de 500 μL en tres viales criogénicos de 2 mL que tienen un sello de goma, para evitar la evaporación con el tiempo. Coloque inmediatamente la acción principal y alícuotas viales criogénicos en hielo.
   3. Repita los pasos 2.6.1 y 2.6.2 hasta que toda la mezcla ciego ha estado alícuotas, Vortex el stock principal después de cada tres viales criogénicos para prevenir el asentamiento de cualquier partículas y mantener una mezcla homogénea.
   4. Congele las porciones de la mezcla cecal a-80 ° C.
      Nota: Esperar entre tres a cuatro frascos de stock en 500 μl de cada ratón adulto. Cada frasco de stock debe ser lo suficientemente áspero desafío una camada de ocho ratones en DOL 7.

3. reto sepsis neonatal ratones de 7 días de edad

1. Separar, identificar y pesar ratones neonatales.
   1. En un BSC, transferir los ratones neonatales a una nueva jaula para mantener los ratones de la presa y para reducir la tensión a la presa.
   2. Retire y frote la parte del material de anidación con guantes transferencia de olor de la jaula a los guantes. Luego, moldear el material de nidificación en un nido más pequeño y colocarlo en una jaula nueva sin la presa.
   3. Transferencia de los ratones neonatales para el material de nidificación en la jaula de nuevo.
   4. Transferencia de material de anidación más para hacer un nido vacío, segundo en la jaula de nuevo.
   5. Cierre y quite la jaula de la presa de la campana para que la presa no se tensiona de oír cualquiera de distrés neonatal de los ratones.
   6. Para realizar el seguimiento individuales ratones neonatales dentro de la camada con el tiempo, utilice un marcador a prueba de etanol para marcar puntos de uno a cinco en el frente o atrás de la cola, volver a aplicar cada 12-24 h según sea necesario.
   7. Peso de cada ratón que será desafiada, colocando cada uno en la secundaria nido después de pesar y repetir este proceso para todos los ratones.
   8. Devolver la camada entera a la presa antes de preparar el reto mezcla cecal alícuota.
2. Calcular la dosis ajustada por peso individual de cecal de la mezcla y dilución requerida con D5W por completar este paso para cada camada por separado, utilizando los cálculos más abajo o utilizando la hoja de trabajo proporcionada (ver Archivo suplementario).
   1. Calcular los miligramos de cecal de la mezcla (a) para ser administrada a cada ratón multiplicando el peso del ratón en gramos (b) la dosis de desafío deseado en miligramos de mezcla cecal por gramo de ratón (c).
      
   2. Calcular el volumen individual de material cecal no diluido de la mezcla requerida por ratón en microlitros (d) dividiendo los miligramos de mezcla ciego necesita por ratón de paso 3.2.1 (a) por la concentración de lodos cecal stock, 160 mg de la mezcla cecal por mililitro de D5W (e) y multiplicando por 1000 μl por mililitro para convertir de mililitros a microlitros.
      
   3. Promedio el volumen común de lodos cecal requerido por ratón (g) sumando el volumen de material cecal de la mezcla (d) por el ratón en una camada de ratones n , dividido por el número de ratones (n).
      
   4. Calcular el factor de dilución promedio del material cecal de la mezcla (h) dividiendo el volumen de inyección promedio (100 μL) por el volumen medio de existencias de cecal mezcla requerida por ratón (g).
      
   5. Calcular el volumen de inyección específica de cada ratón en microlitros (j) multiplicando el volumen de cada ratón de bolsa cecal la mezcla necesaria (d) por el factor de dilución promedio (h) y luego redondear a la decena más cercana (para que coincida con el 10 μl incrementos de la jeringa de inyección).
      
   6. Calcular el volumen requerido promedio de D5W para diluir el caldo mezcla cecal (k) restando el stock promedio mezcla cecal (g) del volumen promedio de inyección (100 μL).
      
   7. Calcular la cantidad total de mezcla cecal en microlitros (l) multiplicando la mezcla cecal stock promedio por ratón en microlitros (g) por el número de ratones en esta camada (n) y multiplicando por 1,4 para crear extra.
      
   8. Calcular la cantidad total de D5W en microlitros (m) necesaria para diluir el caldo mezcla cecal multiplicando el volumen requerido promedio de D5W (k) por el número de ratones (n) y multiplicando por 1,4 para crear extra.
      
3. Preparación de la alícuota de desafío después de calcular la cantidad de stock cecal de la mezcla requerida (l del paso 3.2.7). En un BSC, descongele la cantidad necesaria de frascos bolsa cecal de la mezcla a temperatura ambiente, su contenido para mezclar el pipeteo.
   1. Cuando no son no más visibles cristales de hielo presentes en la mezcla cecal descongelada, transferir la cantidad calculada de material cecal de la mezcla (l del paso 3.2.7) a un tubo de microcentrífuga estéril 1.8 mL.
   2. Diluir a la concentración requerida por añadir D5W helada calculado en el paso 3.2.8 (m). Almacenar la alícuota de desafío sobre el hielo.
   3. Antes de cargar la jeringa, mezclar el tubo de microcentrífuga por lo sacudiendo x 20, seguido por 3 x de elaborar y expulsar a 300-500 μl de la mezcla cecal con una 500 cc 28 G 1/2 pulgada de jeringa de insulina.
   4. Elaborar aproximadamente 150 μL de la mezcla diluida de ciego en la misma jeringa.
   5. Flick la jeringa para desalojar las burbujas desde el émbolo, retroceder un poco en la jeringa y luego expulsar las burbujas.
   6. La dosificación la mezcla exceso de cecal hacia el tubo de microcentrífuga hasta la cantidad correcta de mezcla ciego para un ratón, como se calculó para ratones individuales en el paso 3.2.5 (j), es cargado en la jeringa.
4. Por vía intraperitoneal inyectar lodos ciego, según las pautas de institución de cuidado de los animales locales relevantes, o siga los pasos descritos a continuación.
   1. En un BSC, separar los ratones neonatales de la presa como se describe en el paso 3.1.
   2. Scruff el ratón por la parte posterior del cuello, utilizando el pulgar y el dedo índice.
   3. Fijar la cola del ratón a través de la parte de atrás de la media y los dedos anulares, o en la parte delantera de los dedos del anillo y pinky.
   4. Para minimizar las fugas, incline el ratón neonatal hacia abajo e inserte el bisel de la aguja de la aguja hacia arriba, entre las piernas y los genitales, manteniendo la aguja, superficial y subcutánea.
   5. Cuando se inserta la aguja 1 cm, presiona hacia abajo y hacia adelante para sentir la aguja de punción del peritoneo. Presione lentamente el émbolo, manteniendo la punta de la aguja lo más firmemente posible, como movimientos laterales pueden dañar órganos del ratón.
   6. Retire cuidadosamente la aguja en 5-10 s, siguiendo la misma ruta hacia fuera como en el dedo medio de la relajación durante la eliminación y reducir la tensión en el cuerpo del ratón.
   7. Para comprobar si hay fugas, mantenga el ratón durante unos segundos después del retiro de la aguja permitir que el sitio de la inyección cerrar y observe cualquier fuga o abultamiento en el sitio de inyección, momento en el que el ratón no debe utilizarse en el análisis.
      Nota: Abultamiento de la piel en el sitio de la inyección indica una inyección intraperitoneal de fallido, con el injectant ser subcutánea.
   8. Coloque el ratón sobre una toalla de papel y deje que el ratón para dar un paso. Si el ratón está inmóvil durante 5 s, luego presione ligeramente la cola.
   9. Coge el ratón y busque alguna fuga de mezcla cecal en el sitio de inyección. Si hay una fuga, excluir el ratón desde el análisis y eutanasia el ratón.

4. seguimiento del ratón

1. Seguimiento de los ratones con regularidad para comprobar para llegar a un extremo humano.
   1. Observar los ratones postchallenge 2 h para cualquier complicación relacionada con la inyección.
   2. Controlar lo ratones 12 h postchallenge morbilidad relacionada con la sepsis y la identificación de los ratones en un extremo humano (ver pasos de 4.2-4.3 criterios).
   3. Posteriormente monitorear cada 4-6 h para los primeros 2 días, excepto para 8 h de la noche, cuando los ratones neonatales desatendidos.
   4. Más allá de 2 días postchallenge, monitor x x-2 1 por día. Si enfermo se observan ratones o ratones cuya puntuación de salud disminuye, entonces aumente la frecuencia de monitoreo a cada 4-6 h.
2. Control de ratones neonatales
   1. En cualquier régimen que implique ratones neonatales, transferir el material a una nueva jaula de cama como se describe en el paso 3.1 (por la misma razones como se ha dicho allí). Revise cuidadosamente para cualquier recién nacidos que se arrastran desde el nido al mismo tiempo de enfermería. Cualquier ratones que se arrastran fuera de la cama mientras que enfermería no debe considerarse al esparcirse ratones.
   2. Al retirar la parte superior de la jerarquía, identificar cualquier dispersión de ratones neonatales o lejos del nido o atascados en el material de nidificación pero lejos de sus hermanos de camada, con la excepción de ratones arrastrados lejos de la litera mientras enfermería. Consulte el extremo humano criterios en el paso 4.5 si un ratón se encuentra dispersa.
3. Medir los ratones adrizamiento reflejos y movilidad.
   1. Sobre una toalla de papel, coloque un ratón en su parte posterior y vigilar por su capacidad a sí mismo en un plazo máximo de 4 s. Cuando se coloca en la espalda, caerá el ratón a izquierda o derecha, que es cuando comienza el recuento de s 4.
      Nota: Para clasificar en el grupo de "los derechos", el ratón debe ser capaz de conseguir por lo menos tres de cuatro pata de almohadillas en la toalla de papel para 1 s. Todavía se agrupa como a sí mismo si se cae la derecha.
      1. Si el ratón puede correcto sí mismo, luego espere 8 s para determinar su nivel de movilidad.
      2. Categorizar el ratón como "Derechos móvil" si puede la derecha sí mismo y explorar su entorno tomando varios pasos en una fila.
      3. Categorizar el ratón como "Derechos letárgico" si puede sí mismo a la derecha y toma unos cuantos pasos para explorar su entorno. Los ratones de este grupo pueden caerse mientras está tomando un paso, mira inestables sobre sus pies y pausas entre pasos.
      4. Categorizar el ratón como "Derechos-Nonmobile" si puede la derecha sí mismo pero no se mueve mucho. Todavía puede caer, y si no toma medidas en 8 s, se agrupa como derechos Nonmobile.
   2. Si el ratón no puede correcto sí mismo, luego categorizar su movilidad basado en el movimiento de cadera observado.
      Nota: Evitar la repetición de la supervisión o aumentando la longitud de tiempo que el ratón pasa sobre la espalda porque esto podría afectar el sistema de puntuación y el extremo humano, como un ratón, que se falla a sí mismo en 4 s puede a veces hacerlo si se les da más tiempo.
      1. Categorizar el ratón como "derecho (FTR), no-móviles" si no puede a sí mismo y muestra movimiento de cadera que excede el ángulo de 90° respecto a la horizontal. Algunos ratones pueden derecho ellos mismos si se les da más de 4 s, pero aún debe ser categorizada como FTR, con puntuaciones de movilidad basados en el movimiento de cadera.
      2. Categorizar el ratón como "FTR-letárgico" si no puede a sí mismo y muestra movimiento de cadera por debajo del ángulo de 90° desde la horizontal.
      3. Categorizar el ratón como "FTR-Nonmobile" si no puede a sí mismo y tiene que agitar o vibrarán las piernas, pero ningún movimiento de cadera. Extremidades pueden extender o retraer aunque carecen de movimiento lateral. El ratón está visiblemente enfermo y ha alcanzado el extremo humano.
4. Repita el paso 4.3 en el otro lado del ratón, la grabación de ambos lados.
   Nota: Consulte el Archivo complementario para el registro de observaciones.
5. Determinar si el mouse está en un extremo humano y requiere la eutanasia como se indica en la tabla 1y a continuación.
   1. Clasificar los ratones en corregir diferentes y niveles de movilidad basan en las observaciones de seguimiento en pasos 4.3 y 4.4. Movilidad del ratón se mide para cada lado, y el comportamiento móvil se utiliza para determinar si el ratón requiere eutanasia.
   2. Asignar cualquier ratones con un enderezamiento reflejos de (a) FTR-Nonmobile o (b) FTR-letárgico y se encuentran separadas del nido en un extremo humano.
   3. En el seguimiento de puntos de tiempo más allá de postchallenge 20 h, clasificar cualquier ratón righting Reflex de "no derecho" en ambos lados como en un extremo humano, ya que los datos presentados predicen con alta exactitud que estos ratones finalmente sucumban a la enfermedad y no recuperar.
6. Separado ratones que han de ser sacrificados, según lo determinado en el paso 4.5. Si el ratón monitoreado no se ve como en un extremo humano, coloque en el segundo nido vacío en la jaula de nuevo sin la presa y continuar con los otros ratones neonatales.
7. Una vez que la camada entera ha sido monitoreada, mover la mitad del material de nidificación en la jaula con la presa, reformar un nido con espacio en medio para los ratones neonatales.
   Nota: Un nido mal formado puede ocasionar los ratones a la dispersión y reducir la cantidad de atención disponible que puede ofrecer la presa.
8. Transferencia de los ratones neonatales en la jaula con la presa.
9. Incluya la camada en el nido poniendo el material de anidación restante sobre la camada y pellizcarla suavemente alrededor de la tapa para asegurar el material de nidificación en el lugar.
10. Eutanasia a los ratones neonatales separados en el paso 4.6 según requisitos de la institución local.

5. valoración de la mezcla cecal

1. Reta a los ratones a la dosis de desafío deseado (sección 3) y monitorizar los resultados (sección 4).
2. Observar si el resultado final resulta en el LD deseado y si no, repita los puntos 3 y 4 con una nueva camada en una dosis de desafío mayor o menor, ajuste de 5% - 10%.
   Nota: Dosis de desafío pueden ser similar a la figura 1B pero necesitan ser dosificado en cada centro y la cepa de ratones.
3. También, observar si los ratones alcanzar un extremo humano más rápido o más lento que la cinética esperada en la figura 1B, repiten los puntos 3 y 4 con una nueva camada en una dosis de desafío mayor o menor, ajuste de 5% - 10%.

Resultados

Viabilidad de cecal lodos almacenado a-80 ° C puede ser probado en el tiempo por dilución en serie y galjanoplastia alícuotas de acción mezcla cecal en agar de soja tríptica de sangre de oveja al 5% seguido de 24 h de incubación aeróbica a 37 ° C. Posterior cuenta del contenido de unidad (UFC) forman colonias cultivables de una preparación de la mezcla cecal fue encontrado no para cambiar durante un período de 6 meses, y la viabilidad no fue afectada por un almacenamiento prolongado a-80 ° C (figura 2). Cada ratón donante resultó, en promedio, en suficiente mezcla cecal a tres o cuatro camadas (datos no mostrados).

Ratones desafiados en DOL 7 con mezcla cecal para inducir sepsis polimicrobiana comenzaron a llegar a la meta humana dentro de las 12 h del desafío, y sepsia polimicrobial sobre todo fue resuelto por postchallenge 48 h, como se observa en una curva de supervivencia de Kaplan-Meier combinada de datos de más de 200 ratones desafiados (figura 1A). La letalidad fue dependiente de la dosis de desafío administrada, con un cambio de 5% en dosis de desafío, lo que resulta en un áspero 15% de diferencia en la tasa de supervivencia (figura 1B). Se midió el peso corporal de ratón en cada visita de control. Pérdida de peso se observó en los animales desafiados, ser no discriminatoria entre ratones que sobreviven y los que no lo hizo durante la inicial 24 h postchallenge (figura 1). Después de 24 h, animales más supervivientes comenzaron a recuperar su peso, mientras que todos los que no sobreviven continuaron bajar de peso y se trasladó a su extremo humano. Sin embargo, una pequeña proporción de animales que habían conservado su righting reflex también continuado para perder peso o no aumento de peso, hasta el final del experimento, incluso perdiendo tanto como el 20% de su peso corporal inicial dentro de las 40 h del reto de sobrevivir. Como había una superposición de pérdida de peso entre ratones que sobreviven y los que no, el cambio en peso o un umbral de pérdida de peso no se podía utilizar como un criterio para extremo humano manteniendo el objetivo de dividir exactamente sobrevivientes de los que no sobreviven.

El comportamiento de los ratones fue supervisado como se indica en el protocolo y en la tabla 2. Instantáneas de la salud son categorías aparecen (Figura 3A-C). Estas fotos muestran las categorías de salud diferentes de los ratones que no ellos mismos a la derecha después de ser situados en su espalda y trazar la diferencia entre FTR-móvil y FTR-letárgico, que es una distinción importante. Ratones sanos indiscutidas de esta edad no muestran actividad FTR-letárgico; por lo tanto, esta categoría de la salud es un marcador de la enfermedad y respuesta al desafío. Enfermo ratones muestran síntomas FTR-letárgico (figura 3B) y podrían retroceder hacia Nonmobile FTR (figura 3), donde la pierna superior permanece paralela a la pierna inferior, con poca o cero cadera oscilante movimiento, que es uno de los criterios para criterio de valoración humana. Los ratones también podrían recuperarse, ganando mayor movimiento de cadera y convertirse en FTR-móvil (Figura 3A). Se determinaron la righting reflex y puntuaciones de movilidad para la izquierda y la derecha de cada ratón, y el puntaje más alto fue utilizado para determinar si el ratón había llegado a un extremo humano. Se obtuvo información conductual más de 240 animales con una dosis letal 60 (LD₆₀) de la mezcla cecal, y 144 puntos finales fueron observados (figura 3D-F y tabla 1). Este enfoque basado en evidencia se utilizó para definir y afinar el extremo humano a través de cuatro etapas de la enfermedad, clasificadas por los experimentadores basados en ambos las diferencias conductuales entre los sobrevivientes y los que no sobreviven y por la fracción de extremos humanos alcanzadas durante cada período de tiempo. Durante los primeros experimentos, ratones Nonmobile FTR que ningún movimiento de cadera constantemente fueron encontrados muertos dentro de las 4-6 h de este comportamiento se observa. En la recolección de la información presentada, una puntuación de salud Nonmobile FTR se utilizó como criterio para un extremo humano. De postchallenge 12-21 h, mientras que ratones FTR Nonmobile fueron sacrificados, animales sobrevivientes y las muestran patrones de comportamiento muy similares y no pueden ser distinguidos de cualquier otro modo (figura 3D). De postchallenge 21-48 h, la mayoría de sobrevivir ratones recuperó su righting reflex, mientras que menos del 1% de los comportamientos FTR observados en los animales que van a sobrevivir el experimento (figura 3E). Así, los ratones que no se haga por ambos lados se convirtió en un criterio adicional para el extremo humano durante este tiempo. Entre 12 y 20 postchallenge h, 12.5% del total de puntos finales se observaron, versus 80,5% entre 20 y 48 h y 7% después de 48 h (tabla 1). Una característica distintiva entre ratones que acabó sobreviviendo y eventualmente se empeoró a un extremo humano fue la pérdida del reflejo del adrizamiento, independiente de la movilidad de cadera (figura 3F). De hecho, entre 20 y 48 h después del desafío, un total de 121 ratones había fallado a sí mismos de ambos lados, con 116 de estos ratones eventualmente progresar a un extremo humano (lo cual representa un 96% de precisión en la identificación de los ratones que no recuperaría). Más allá de 48 h después del desafío, se observaron 11 ratones para quebrar a la derecha ellos mismos de ambos lados y 10 de estos progresado a un extremo humano (un 91% de precisión). Más allá de 20 h después del desafío, el número de ratones que perdido el reflejo de adrizamiento para ambos lados predice el resultado final con una precisión de más del 90%; por lo tanto, esto se ha agregado a los criterios de punto final humano, identificar nonrecovering ratones antes y reducir ratón sufriendo (tabla 1).

La frecuencia que los ratones necesitan control cambia con el tiempo, debido a diferentes tasas de postchallenge de muerte y se describe en la tabla 1. Un ratón era considerado para estar en su punto final humanitario en cualquier momento si había fallado a sí mismo y estáticos movimiento de cadera en ambos lados, o si el ratón se encuentra dispersos de la jerarquía, podía correcto sí mismo y había aletargado movimiento hip. Ratones con cualquiera de estas condiciones no se esperaba para poder reincorporarse a la basura y se han observado que FTR Nonmobile dentro de 4-6 h. a partir 20 h después del desafío, se agregó un nuevo extremo humano porque la información presentada muestra que la gran mayoría de los ratones que FTR de ambas partes termina por sucumbir a la enfermedad.

Los videos, tablas y recursos presentados en este manuscrito son un recurso didáctico eficaz para la asignación correcta de comportamiento de ratones desafiados. Siete experimentadores pidieron ver el video de entrenamiento y leer tanto el protocolo como las mesas antes de asignar comportamientos a 60 animales desafiados. La identificación de la asignación del endpoint humana era precisa tanto para ratones de FTR-Nonmobile distintivas de los ratones que muestran otros comportamientos (Figura 4A) y ratones FTR de ratones que se haga dentro del tiempo permitido ( Figura 4B).

Figura 1 : Curva de supervivencia Kaplan-Meier, titulación de dosis de mezcla cecal y cambio de peso siguiendo el reto mezcla cecal. (A) resultados de supervivencia neonatal ratones C57BL/6J desafiada con una inyección intraperitoneal de mezcla cecal en DOL 7. Los datos de esta figura se combinan de experimentos independientes con desafío de múltiples dosis, que van de 0,7 a 1,3 mg de mezcla cecal por gramo de peso corporal fue administrados a los ratones. (B) Neonatal ratones desafiados con 0,80 a 0,95 mg de mezcla cecal por gramo de peso corporal de una preparación de la mezcla cecal mostrar una relación dosis dependiente entre la cantidad de mezcla ciego dado y el porcentaje de supervivencia. ()C) el porcentaje de cambio en el peso comparado con el peso del reto, con la línea de puntos que denotan un 20% de pérdida de peso desde el momento del desafío. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 : Concentración de UFC en la acción de mezcla cecal almacenado a-80 ° C no cambia durante un período de 6 meses. El efecto de la edad de lodos cecal en concentración de UFC se evaluó mediante regresión lineal. Cada punto representa una parte alícuota de la misma preparación de la mezcla cecal, diluidos en serie y plateado durante un período de 6 meses. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3 : Cadera categorías de movilidad de los ratones que no a ellos mismos y de comportamiento de los animales en diferentes épocas postchallenge. Ratones que han sido desmentidos con sepsis, cuando situados en su espalda, mostrará signos de morbilidad que se puede medir por el grado de movimiento de cadera. No (A) A la derecha (FTR)-ratón móvil muestra cadera oscilante movimiento de su pierna superior superior al ángulo de 90 ° respecto a la horizontal. (B) un FTR-letárgico muestra cadera oscilante movimiento del ratón pero no excede el ángulo de 90 ° de horizontal en cualquier momento durante los 4 s de vigilancia. (C) algunos FTR-Nonmobile ratones extenderán su pierna, flexión en la rodilla, pero muestran muy poco (menos de ángulos de 10 °) a cero cadera oscilante movimiento y las piernas permanecerán paralela entre sí. (D) comportamiento de los animales 12-21 h postchallenge mostrar que sólo comportamientos de FTR-Nonmobile separan a sobrevivientes de los que no sobreviven. (E) del 21 al postchallenge 48 h, sólo 4 de los comportamientos observados 592 de FTR (0.67%) pertenecen a los sobrevivientes, lo que permite el enderezamiento reflejo para predecir el resultado final y ser utilizado como un criterio nuevo para extremo humano. Postinfection de (F) más allá de 48 h, 6 clientes de los 131 ratones (4.55%) que tenían un reflejo adrizamiento pasó a formar parte del grupo FTR y fueron sacrificados al final del experimento, justificando el monitoreo sostenido a través del curso de recuperación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4 : Recursos educativos resultan en clasificación conductual exacta por experimentadores independientes. Experimentadores entrenados por ver el video que acompaña este protocolo categorizaron videos de 60 ratones neonatales en diferentes grupos. (A) la capacidad de distinguir un humano extremo fue determinada y un promedio de 97% de conductas fue correctamente categorizado como FTR Nonmobile o no, mientras que sólo el 1% de los ratones de FTR-Nonmobile eran mal identificado. Dos por ciento de los ratones fueron falsamente identificadas como Nonmobile FTR. (B) la identificación del segundo extremo humano criterio de distinguir correctamente entre ratones FTR o los que tienen la capacidad de ellos mismos a la derecha en 4 s de ser situados en su espalda fue asignada correctamente en el 97% de las puntuaciones, mientras que sólo 0.96% de los ratones fueron asignados incorrectamente como corregir ellos mismos y 2% de los ratones fueron asignado incorrectamente como FTR. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Etapa de la enfermedad	A: alta morbilidad, no mortalidad	B: alta morbilidad, baja mortalidad	C: alta morbilidad, alta mortalidad	D: la baja morbilidad, baja mortalidad
Horas post desafío	0−12	12−20	20−48	> 48
Frecuencia de monitoreo	desafío de 2 h post	cada h 4−6	Cada h 4−6, 8 h, sin vigilancia durante la noche	1−2 veces al día, más si es necesario
Proporción de extremos humanos total observado	0/144	18/144	116/144	10/144
Porcentaje de humanos extremos observados	0%	12.5%	80,5%	7%
Criterios de punto final humanitario	1. FTR−Nonmobile en ambos lados		1. FTR−Nonmobile en ambos lados
	2. dispersos de nido y es FTR−Lethargic		2. dispersos de nido y es FTR−Lethargic
			3. FTR a izquierda o derecha (con cualquier grado de movilidad)

Tabla 1: frecuencia de monitoreo y humano criterios de punto final en las diferentes etapas de la enfermedad. Control de frecuencia, extremos humanas observa, el porcentaje de criterios de valoración humanas y criterios de punto final humanitario durante las diferentes etapas de la enfermedad.

Reflejo de enderezamiento	Movilidad	Límite de tiempo para después ser colocado en parte posterior	Límite de tiempo para medir la cantidad de movimiento (móvil / letárgico y estáticos)	Criterios de puntuación de movilidad
Derechos	Móvil	4 s	Un 8 adicional s	El ratón lleva varios pasos en una fila, mantener el impulso hacia el futuro y explora su entorno. Cachorro se caiga.
	Letárgico			El ratón puede dar un paso pero parada y pausa antes de tomar otro. Cachorro puede caerse.
	Nonmobile			El ratón no tiene las medidas después de corregir a sí mismo. Cachorro puede caerse.
No derecho	Caderas móviles		El mismo 4 s utilizada para medir righting reflex	Cuenta con enérgico movimiento de cadera con la pierna superior girando más allá de 90° de horizontal por lo menos una vez en 4 s.
	Caderas, letárgicos			Movimiento de cadera para arriba pero no más allá de 90° respecto a la horizontal.
	Estáticos las caderas			Extremidades pueden moverse por prolongar y de contraer pero no gire las caderas. Perrito se ve muy enfermo.

Tabla 2: seguimiento de mesa y criterios en la determinación de la puntuación de la salud de los ratones. Se aplicaron los criterios proporcionados para definir grupos categoría a los ratones y para reducir la variación individual en la asignación de cuentas de salud.

Discusión

Ratones de neonatales postnatales tienen muy limitada la movilidad y no se justo después de ser situados en su espalda, incluso cuando indiscutido. 7 DOL, la edad de los ratones desafiados en este modelo, un rango de movimiento que abarca desde los derechos móvil a FTR-Mobile se observó en ratones indiscutible, con una diferencia importante, es decir, que un ratón indiscutible a esta edad no se mostraban comportamiento letárgico FTR. Sólo ratones desafiados con sepsis polimicrobiana se observaron a ser FTR-letárgico; por lo tanto, esta respuesta puede ser un marcador de severidad de la enfermedad. Estar atentos al corte de un ángulo de 90° de horizontal para el movimiento de cadera permite la asignación consistente y exacta del movimiento de cadera letárgico o móvil en ratones. El marco de tiempo de 4 s a ver si un ratón puede correcto sí mismo fue seleccionado porque indiscutible ratones pudieron constantemente a la derecha ellos mismos dentro de este marco de tiempo. Repite la medición del mismo ratón fue evitado, mientras que el tiempo a sí mismos y la medición de la movilidad de cadera fue limitada a 4 s, para evitar cansarse excesivamente el ratón, que de lo contrario podría afectar su capacidad para obtener alimentos y calor y podría afectar a su pronóstico mejor. Corregir a sí mismo de la izquierda y la derecha fueron observadas, y la mayor de las puntuaciones fue utilizado para determinar si el ratón estaba en un extremo humano, porque algunos ratones fueron encontrados para mostrar Nonmobile FTR en un lado pero tiene una mayor movilidad en el otro lado y b e recuperar eventualmente.

El sistema de puntuación utilizado para evaluar la salud de ratón se basó en la aplicación de cortes categóricos a lo que es un espectro de movimiento y, por tanto, podría ser propenso al sesgo individual. El personal fue entrenado juntos para que cada persona anotó los ratones de la misma; sin embargo, probablemente se mantendrá un nivel de subjetividad que conduce a la variación. Se evaluó la consistencia de la puntuación por tener siete investigadores que no habían realizado previamente el seguimiento neonatal del ratón aprender los requisitos descritos en este protocolo y el video y, entonces, independientemente asignar comportamientos y determinar humanos punto final. Una exactitud de 97% se observó con puntaje en 60 ratones desafiados, sugiriendo que sesgo individual no desempeña un papel substancial en las asignaciones de comportamiento de este modelo. El protocolo de monitoreo conductual presentado se basa en observaciones de animales desafiados en DOL 7, sin embargo, ratones menores de 6 días en un estado saludable sin respuesta no constantemente a la derecha ellos mismos. Así, los criterios de punto final humanitario descrito no podrían aplicarse directamente a los ratones más jóvenes. Si se utilizan ratones más jóvenes en este modelo experimental o si se aplica un modelo de desafío diferente con cinética de diferentes enfermedades, entonces criterios de punto final humanitario adecuado deben ser desarrollados y pilotados para evitar la eutanasia de ratones que de lo contrario, con el tiempo, recuperar. El sistema de puntuación muestra un método robusto de mejorar clasificación extremo humano que prueba y confirmación, potencialmente podría ser aplicado a otros modelos.

Cada preparación de la mezcla de ciego o el uso de una nueva cepa de ratón necesaria la retitration de la dosis de mezcla cecal a administrar para alcanzar una dosis letal similar. Cada preparación fue estandarizado por la lectura de interés, es decir, supervivencia, en lugar de dar el mismo recuento bacteriano. Concentración bacteriana viable de cada preparación de la mezcla ciego variada ligeramente, potencialmente debido a diferencias en las bacterias comensales del donante o a variaciones en el peso a la izquierda en el colador de la célula de la postfiltration bolsa cecal de la mezcla. Durante la valoración de la mezcla del ciego, las dos primeras camadas fueron divididas en dos grupos y cada mitad de la camada fueron desafiados con una de las dos dosis para que cada una de las dosis sería probada en dos camadas. Si la tasa de supervivencia resultante no coincide con el nivel requerido, entonces la dosis de desafío aumentada o disminuida en un 5% - 10% y repite el experimento. Se utilizaron varias camadas para tener en cuenta las diferencias de la camada a camada que podrían provocar resistencia o mayor susceptibilidad a la sepsis a través de una camada. Era importante título exactamente el stock de mezcla cecal con cada nueva preparación para asegurarse de que la nueva valoración de lodos ciego era comparable a preparaciones de cecal de la mezcla anterior. Se observaron períodos de excesivo ruido y vibraciones, específicamente durante la compactación de asfalto y la construcción de un edificio cercano y de camino, para aumentar la tensión en las presas. Esto correlaciona con aumento de las tasas de canibalización y afecta la mortalidad de los experimentos de supervivencia, incluso afectando a ratones sin respuesta, indicando que pueden ser extraños efectos sobre la supervivencia neonatal que también deben ser controlados para.

Anteriores métodos para preparación de stock la mezcla cecal incluyen el uso de la mezcla fresca de cecal o la preparación de la mezcla cecal congeladora, usando una variedad de métodos, incluyendo el almacenaje en glicerol que inevitablemente sería transferido durante el desafío. Mientras que el uso de la mezcla cecal fresco proporciona la ventaja de tener una composición bacteriana más cercana al original contenido cecal, existe el riesgo de variación entre ratones donantes individuales debido a la variación de bacterias comensales. Cuando esto fue minimizado mediante el uso de donantes cecales al mismo vendedor con mínimo tiempo entre llegada y progresión del experimento, esto podría convertirse en una opción coste-prohibitivos para algunos laboratorios y presenta otro desafío de logística de distribución que experimentan de ratones de edad comparable disponibles al partir de una mezcla de cecal en ratones neonatales que fueron 7 días de edad. Se utilizó un método alternativo al uso de lodos cecal fresco, donde contenido cecal de múltiples donantes adultos se agruparon, resuspendió en D5W, congelados a-80 ° C sin glicerol y descongelado una alícuota en un momento para experimentos. La utilización de lodos cecal de donante adulto para el estudio de la sepsis neonatal potencialmente podría transferir especies de bacterias presentes en la mezcla cecal que el ratón neonatal no ha sido expuesto a, pero es una estrategia que permite el estudio de la sepsis en ratones neonatales y se ha utilizado para estudiar la biología del ratón neonatal en los últimos^13,14,15. Mezcla cecal se diluyó en D5W para proporcionar alimentación a las bacterias, que permitió el establecimiento de una infección activa una vez que las bacterias se inyectaron y fue hecho para imitar la disponibilidad de nutrientes en la cavidad peritoneal durante necrotizante enterocolitis. No se incluyó como un agente estabilizador de congelación las bacterias debido a los efectos secundarios negativos potenciales que podrían surgir de la inyección de glicerol solo glicerol. Si el glicerol se ha incluido en la preparación de la mezcla de ciego, entonces el daño potencial que glicerol solo podría inducir necesita comprobarse mediante la inclusión de una solo glicerol (falta cecal mezcla) inyección en ratones, que habría aumentado ratón uso. La viabilidad de las bacterias de las poblaciones de mezcla cecal fue probada después de congelar el caldo mezcla ciego sin glicerol y fue encontrada para ser constante, sin cambios en la concentración de bacterias en distintas alícuotas de la misma preparación de la mezcla cecal almacenada a-80 ° C durante 6 período de meses. Esto sugiere que el almacenamiento sin glicerol es factible en la prestación de un resultado biológico consistente. También permite la utilización de un bulto preparado, mezcla cecal caldo congelado para el uso de ratones criados en casa, reduciendo los costos y utilizando ratones machos que serían exceso de cría, reduciendo despilfarro de ratón.

La identificación de retos fallidos en ratones fue importante para evitar la adición de ruido adicional al sistema. Después de someterse a una inyección intraperitoneal de mezcla cecal, los ratones se observan la presencia de un abultamiento por debajo de la piel, que indica una inyección fallida que fue realmente subcutánea. Ratones se observaron fugas en el sitio de inyección, inmediatamente después del retiro de la aguja y después de lo que les permite dar un paso después de la inyección, ya que ratones sería a veces (raramente) fugas sólo después de mover el miembro del sitio de inyección por dar un paso. La presencia de un abultamiento o fugas después de la inyección dio lugar a quitar el ratón de los análisis. Después de todo, cualquiera de estas puede resultar en un resultado diferente debido a la cantidad incorrecta de cecal mezcla inyectada como se ha observado una diferencia de 5% en la dosis de desafío que afectan la supervivencia posterior.

Desafío de mezcla ciego experimenta a menudo requieren diferentes dosis letales de destino con diferentes dosis ajustada por peso. Debido a esto, los volúmenes de inyección pueden variar desde tan poco como 20 μl y 100 μl. El error experimental proporcional asociado con aguja muerta volumen también cambia junto con el volumen de inyección, aumentando la dificultad para comparar directamente diferentes dosis. Con la simple modificación de normalizar el volumen de inyección, se elimina esta fuente de variación del experimento.

Sistema de monitoreo conductual neonatal del ratón utilizado en este protocolo es el primero de su tipo. Intención de los investigadores en investigación ética con ratones recién nacidos a menudo se enfrentan a la desafiante falta de recursos para evaluar el bienestar de los animales a esta edad. El sistema de control intuitivo y consistente presentado comienza a abordar esta brecha de conocimiento. Lo importante, este enfoque basado en evidencia no sólo aumenta la calidad de los datos experimentales obtenidos, pero, al mismo tiempo, también reduce el sufrimiento de los animales experimentales.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 - 20 μL pipette tips	VWR	732-0799
1.8 mL Microcentrifuge tube	Costar	3621
100 - 1000 μL pipette tips	VWR	732-0801
1 - 200 μL pipette tips	VWR	732-0800
15 mL Centrifuge tube	FroggaBio	TB15-25
23G1 needles	Becton Dickinson	305145	only the needle, not the syringe, used for pinning mouse to styrofoam
28G 0.5 mL Insulin syringe	BD	329461
2 mL Cryogenic vial	Corning	430488
50 mL Centrifuge tube	Fisher scientific	14-432-22
5 mL pipette	Costar	4487
6 - 10 week old C57BL/6J adult mice	Jackson Laboratories	664
7 + day old C57BL/6J neonatal mice	Bred in house	n.a
70 μm Cell strainer	Falcon	352350
Defibrinated Sheep's Blood	Dalynn	HS30-500
Dextrose 5% Water (D5W)	Baxter	JB0080
Dissecting forceps	VWR	82027-386
Dissecting Scissors, Sharp Tip	VWR	82027-592
Dissecting Scissors, Sharp/Blunt Tip	VWR	82027-594
Ethanol (HistoPrep 95% Denatured Ethyl Alcohol)	Fisherbrand	HC11001GL	diluted to 70% with double distilled water
Ethanol-proof marker; Lab marker	VWR	52877-310
EZ Anesthesia Vaporizer	EZ Anesthesia	EZ-155
Germinator 500, Dry sterilize surgicial instrument (Hot bead sterilizer)	Braintree Scientific	GER 5287-120V
Isoflurane	Fresenius Kabi	CP0406V2
Micro Spatula	Chemglass	CG-1983-12
Pipette-Aid	Drummond	4-000-100
Rainin Classic Pipette PR-1000	Rainin	17008653
Rainin Classic Pipette PR-20	Rainin	17008650
Rainin Classic Pipette PR-200	Rainin	17008652
Scale	Sartorius	BL 150 S
Specimen forceps	VWR	82027-440 / 82027-442
Square 1000 mL Storage Bottle	Corning	431433
Styrofoam board	Any	n.a
Sure-Seal Mouse/Rat euthanasia chamber	Euthanex	EZ-178
Tryptic Soy Agar	Sigma-Aldrich	22091-2.5KG
VX-200 Lab Vortex Mixer	Labnet International	S0200
weigh paper	Fisherbrand	09-898-12B