Um modelo de Mouse controlado para sepse Neonatal Polymicrobial

Resumo

Este protocolo fornece as etapas necessárias para estabelecer e avaliar a sepse neonatal em ratos de 7 dias de idade.

Resumo

Sepse neonatal continua a ser um fardo global. É necessário um modelo de pré-clínicos para intervenções terapêuticas ou profiláticas eficazes tela. Sepse polymicrobial de rato neonatal pode ser induzida por injeção de chorume cecal intraperitonealmente em dia de ratos de vida 7 e monitorá-los para a semana seguinte. Aqui apresentados são os passos detalhados necessários para a implementação deste modelo de sepse neonatal. Isso inclui fazer um estoque de chorume cecal homogênea, diluindo-a uma dose de peso e maca-ajustado, um esboço do programa de monitoramento e uma definição das categorias de saúde observado usado para definir pontos de extremidade do humanos. A geração de um estoque de chorume cecal homogênea de doadores em pool permite a administração em muitas ninhadas ao longo do tempo, reduzindo a variação entre os doadores e evitar o uso de glicerol potencialmente tóxico. A estratégia de monitorização utilizada permite a antecipação do resultado de sobrevivência e a identificação dos ratos que mais tarde iria progredir até a morte, permitindo uma identificação anterior do ponto de extremidade humana. Duas principais características comportamentais são usadas para definir as pontuações de saúde, ou seja, a capacidade dos ratos neonatais para si quando colocados em suas costas e seu nível de mobilidade. Estes critérios potencialmente poderiam ser aplicados a morada humana os pontos de extremidade em outros estudos de doença neonatal em ratos, enquanto um estudo piloto é realizado para confirmar a exatidão. Em conclusão, essa abordagem fornece um método padronizado para sepse neonatal do modelo em ratos, proporcionando recursos para avaliar o bem-estar dos animal usado para definir o início humanos pontos de extremidade para animais desafiados.

Introdução

Sepse é das principais causas de mortes infecciosas recém-nascido humano¹. Porque a sepse neonatal é mal compreendido, pequenos progressos em ambos a identificação dos recém-nascidos em situação de risco mais cedo durante a doença e o desenvolvimento de tratamentos eficazes ou profilaxias. Isto exige a utilização de modelos animais de sepse para entender melhor os processo e teste possíveis intervenções. Além disso, roedores adultos respondem de forma diferente de sepse, com diferenças estatisticamente significativas no número de bactérias para administrar para obter a mesma dose letal (LD) e diferenças na resposta do hospedeiro a resultante em comparação com recém-nascidos². Assim, sepse neonatal deve ser estudado em neonatos. Vários modelos de sepse adultos têm sido utilizados na investigação de sepse. Estes incluem um desafio por via venosa com organismos específicos implicados na sepse humano adulto ou ligadura e perfuração cecal (CLP). CLP é um modelo endógeno de desafio onde o ceco é cirurgicamente isolado, ligado e perfurado para permitir o vazamento do conteúdo intestinal no peritônio, eventualmente conduzindo à disseminação sistêmica de micróbios e seus produtos³. No entanto, o procedimento cirúrgico necessário para estabelecer o CLP é letal para animais recém-nascidos; Portanto, um método alternativo é necessário imitar o desafio de polymicrobial do CLP para induzir sepse neonatal. O modelo de chorume cecal para sepse neonatal polymicrobial foi desenvolvido para atender a essa necessidade, pelo qual o conteúdo cecal de animais é colhido, suspenso em estéril de dextrose 5% em água (D5W) e injetado intraperitonealmente em camundongos recém-nascidos². Isso, desde então, tornou-se um modelo cada vez mais popular para estudar sepse em animais recém-nascidos e adultos e avançou substancialmente mecanicistas insights em processo^{4,5,6,7 a doença ,},^{8,9,10,11,12,13,14,15}.

Dada a crescente utilização desse modelo e desejo dos pesquisadores para comparar diretamente os resultados através de publicações, é necessário para ser bem descrita e padronizada através de estudos, os aspectos técnicos. Padronização aplica-se a três aspectos do modelo, ou seja, i) a preparação da unidade populacional de chorume cecal, ii) a preparação de alíquotas o desafio para injeção em animais experimentais e iii) a definição do ponto de extremidade humana pelo qual os animais são considerados nonsurvivors em experimentos de desafio. Especificamente, métodos para preparar o estoque de chorume cecal são muitas vezes referenciados para o artigo original, introduzindo o modelo². Um breve resumo desse modelo é que conteúdo cecal de ratos adultos foram colhido, suspenso em D5W estéril para uma concentração de 80 mg/mL e usado até 2 horas para injetar os animais experimentais. Este modelo original usado ratos da mesma idade, no mesmo local do fornecedor, que estavam alojados em suas instalações de pesquisa respectivo para menos de 2 semanas antes da colheita de conteúdo cecal. O uso de ratos criados internamente, embora reduzindo o custo de entrega do fornecedor regular e permitindo o uso de ratos em excesso de uma gama mais ampla de sexo e idade, também substancialmente aumentado variabilidade de doador-para-doador. Isto motivou o desenvolvimento de uma técnica alternativa, segundo a qual o conteúdo cecal de vários mouses foram agrupado para preparar um grande estoque, que era então aliquotadas e armazenado a-80 ° C¹³. Este método alternativo foi adaptado por vários grupos de^14,15. No entanto, que a adaptação resultou em algumas variações técnicas, tanto da mídia de armazenamento usada (10% ou 15% de glicerol, ou D5W sozinho) e na estratégia de filtração para remover partículas (multicelular filtração através um 860 µm e, em seguida, um 190 µm filtro ou indivíduo filtrações através de 100 µm ou 70 µm filtros)^13,14,15. A injeção de glicerol sozinho poderia potencialmente causar danos, dado que as injeções de glicerol de 25-50% têm sido usadas como um modelo roedor de lesão renal^{16,17,18,19, 20}. Para evitar efeitos colaterais não intencionais de glicerol, a preparação da pasta cecal para ratos neste estudo é congelada no D5W sem glicerol, e são realizados testes de viabilidade bacteriana do armazenamento a-80 ° C. A estratégia de filtração utilizada neste estudo é uma passagem através de um filtro de 70 µm, que não tem sido comparado diretamente com as outras estratégias de filtração listadas.

Doses de peso ajustado letais de chorume cecal injetado podem variar de instalação para instalação e devem ser tituladas para fora para a letalidade desejada para grupos individuais. Com doses diferentes de desafio, os volumes de desafio que acompanha mudam por necessidade. No entanto, esse detalhe metodológico não foi relatado antes. Além disso, estratégias para procedimentos padrão, tais como a injeção intraperitoneal, raramente são elaboradas na dentro da literatura, mas técnicas individuais podem afetar se ratos recém-nascidos vazam quando injetado e impacto de seus resultados finais.

Bem-estar dos animal, incluindo uma definição de ponto de extremidade do humano, é um aspecto central deste modelo e em qualquer modelo de infecção e inflamação em roedores²¹. Em 1998, o Conselho canadense no cuidado Animal (CCAC) publicou extensas diretrizes para seleção de ponto de extremidade humana, definindo o ponto de extremidade humano como "qualquer real ou potencial de dor, angústia ou desconforto deve ser minimizado ou atenuado, escolhendo o mais cedo ponto de extremidade que é compatível com os objectivos científicos da pesquisa"²². Outros também atenção que os pontos de extremidade humanos devem ser estabelecidos com base na justificação científica em vez de uma interpretação subjetiva do animal estado sozinho²¹. Enquanto há uma riqueza de recursos para clínicos, comportamentais e critérios baseados em sinal de corpo-condição humana ponto de extremidade, mesmo no contexto de infecção e inflamação especificamente^21,23,24, nenhum destes , incluindo as orientações do CCAC para ponto de extremidade humano²², mencionar ratos recém-nascidos. Assim, objetiva e cientificamente justificados os pontos de extremidade humanos são muito mais difíceis de estabelecer para animais recém-nascidos, dado tanto suas limitadas capacidades comportamentais e a falta de evidência de critérios como perda de peso, que é comumente usado para adulto ratos. Atualmente, os critérios para o ponto de extremidade humano usado para os ratos neonatais 5 - a 12 dias de idade, na literatura de chorume cecal todas as referências para o manuscrito original que introduziu o modelo². Neste trabalho original, a definição de ponto de extremidade humana para animais recém-nascidos baseou-se em dois critérios; ou seja, a localização do mouse fora do ninho (dispersão) e a falta de pontos de leite tinham sido vistos a resultar em morte dentro de horas. Uma questão complicador na atribuição de um ponto de extremidade humano é que manchas de leite torna-se difícil ver em cepas de rato com pelo escuro, tais como a tensão C57BL/6J comumente empregado, após a primeira semana de vida, enquanto os animais doentes são monitorados até o 14º dia de vida (DOL). Animais mortos, mais podem ser encontrados postchallenge ao aplicar esses critérios (própria observação; não publicado); assim, uma definição mais rigorosa do ponto de extremidade humana é necessária para aliviar o sofrimento de animais experimentais e evitar a mortalidade em situações onde o resultado poderia ser com precisão discerniu anteriormente.

Todos os três aspectos metodológicos do modelo cecal chorume são apresentados em um procedimento de rotina, detalhando a preparação de ações de chorume cecal, um método de injeção de animais experimentais que mantém constante do volume de injeção entre as doses e reduz o risco de vazamentos e uma definição de ponto de extremidade humana para ratos de 7 a 12 dias de idade, baseada em um sistema de modelagem comportamental. Informações comportamentais dos escores de saúde rato de mais de 240 animais experimentais foi coletadas e agrupadas por resultado de sobrevivência final, demonstrando uma definição baseada em evidência de ponto de extremidade humana. O sofrimento dos animais experimentais é reduzido através da identificação de ratos neonatais moribundos no ponto mais tempo possível, enquanto resultados de sobrevivência biologicamente significativa podem ser inferidos pela observação de variáveis-chave. A representação visual da preparação da pasta cecal e comportamentos do mouse neonatal irá servir como um excelente recurso para qualquer grupo estudando sépsis ou recém-nascido desafio modelo animais.

Protocolo

Todos os experimentos neste protocolo foram aprovados pelo Comitê de cuidados animais Universidade da Colúmbia Britânica sob o protocolo número A17-0110.

1. esterilização de ferramenta

1. Em uma câmara de segurança biológica (CSB), ligue e pré-aqueça o esterilizador de grânulo quente a 250 ° C, pelo menos, 30 min antes de usar.
2. Mergulhe as ferramentas em etanol a 70%.
3. Mergulhe as ferramentas o esterilizador de grânulo quente pré-aquecido durante um período mínimo de 1 min.
   Nota: As pegas das ferramentas ficará quentes e podem queimar-se deixado no esterilizador grânulo quente para mais de 1,5 min.
4. Pulverize uma esteira de papel toalha com etanol a 70% para esterilizá-lo.
5. Remover as ferramentas de esterilizador grânulo quente sem tocar a parte esterilizada da ferramenta para as alças não estéreis de outras ferramentas submersas e colocá-los sobre o etanol-pulverizado de papel-toalha.
6. Espere por 30 s a 2 min para as ferramentas arrefecer antes de usá-los para dissecação.

2. preparação da pasta cecal

1. Preweigh tubos de centrífuga de 15 mL (um tubo para cada cinco ratos sendo sacrificados).
2. Eutanásia em doadores de chorume cecal de acordo com as orientações de cuidados de animais locais ou usar o protocolo abaixo.
   Nota: Até 40 camundongos C57BL/6J entre 6 e 12 semanas velho foram utilizado para a preparação da pasta cecal, com até cinco ratos sendo sacrificados por vez.
   1. Os ratos de transferência para a câmara de eutanásia e ajustar a máquina de anestesia de isoflurano a 5% com perfusão de oxigênio.
   2. Monitore os ratos para observar a perda da capacidade para mover-se e vê-los entrar em avião da anestesia cirúrgico e finalmente, parar de respirar.
   3. Remover um mouse da câmara de eutanásia, belisque a pata e observar qualquer retração de perna ou inalação. Se qualquer um estiver presente, retornar o mouse para a câmara de eutanásia; caso contrário, continue.
   4. Terminal euthanize os ratos por deslocamento cervical acentuado.
3. Faz dissecação do ceco, usando ferramentas de presterilized e refrigeração (ver seção 1) em um BSC.
   1. Fixe as pernas do rato para uma placa de poliestireno extrudido usando agulhas 23G, para que o mouse tem seu abdômen acima. Seguro e em seguida pulverizar o abdômen com etanol a 70%.
   2. Usando uma tesoura e pinça estéril, cortar a pele, soltar a pele do revestimento peritoneal com a tesoura e corte aberto uma região retangular da virilha ao esterno e lado esquerdo para o lado direito. Remova qualquer pelo do peritônio.
   3. Mudar para um novo par de ferramentas estéreis para cortar através do peritônio, fazendo uma abertura retangular, como foi feito para a pele, comutação ferramentas se aqueles usado contato da pele.
   4. Identifica o ceco, que deve estar sendo executado à esquerda para a direita em todo o corpo. Perturbar o tecido conjuntivo para identificar as ramificações do ceco do intestino e cortar o ceco longe dos intestinos. Coloque o ceco sobre uma folha esterilizada de pesar o papel.
      Nota: Papel de pesagem pode ser esterilizado por pulverização com etanol a 70% em ambos os lados e deixando-a secar, ou por irradiação UV. Alternativamente, o ceco pode ser dissecado em uma placa de Petri estéril.
4. Extrusão de conteúdo cecal
   1. Em um BSC, use ferramentas estéril para cortar através de ambas as extremidades do ceco.
   2. Segure no meio do ceco com pinça estéril e use uma espátula metálica plana estéril gentilmente empurrar o conteúdo cecal fora do corte termina, usando um movimento de rolamento e evitando um movimento de raspagem que poderia rasgar o epitélio. Recolher o conteúdo e colocá-los em um tubo de centrífuga de preweighed 15 mL.
   3. Piscina do conteúdo cecal de um máximo de cinco ratos no mesmo tubo. Pese o tubo novamente, uma vez que todos os conteúdos foram adicionados.
      Nota: Esperar uma média de 300 mg e até a 390 mg de chorume cecal por rato, exigindo 1,8 a 2,4 mL de D5W para ressuspensão por rato; Portanto, usar mais de cinco ratos durante esta etapa pode resultar em encher em demasia o tubo de centrífuga de 15 mL.
   4. Limpe as ferramentas limpo com uma toalha de papel etanol-pulverizado e esterilizá-los, repetindo as etapas 1,2-1,6.
5. Filtração de chorume cecal
   1. Pesar o tubo de centrifugação repleto de conteúdo cecal e calcular a quantidade de D5W para adicionar o conteúdo cecal, dividindo o peso do conteúdo cecal pela concentração desejada de estoque em miligramas por mililitro, como na equação abaixo.
      
   2. Em um BSC, adicione a quantidade necessária de D5W gelada para tubo de centrífuga de 15 mL contendo o conteúdo cecal.
   3. Vórtice a 15ml centrifugar o tubo verticalmente e horizontalmente, durante 30 s. seleção de partículas de mais de 1-3 mm de diâmetro e se presente, continuar num Vortex até que todas as partículas grandes visivelmente desapareceu.
   4. Coloque um filtro de célula de 70 µm estéril em um tubo de centrífuga de 50 mL que é colocado no gelo. Pipete 4 mL de chorume cecal ressuspensão no filtro da célula e, em seguida para o tubo de coleta. Resuspenda as partículas pipetando e descer 2 x x-3. Delicadamente, extrude bolhas para aumentar a velocidade de filtragem, agitando o conteúdo com a ponta da pipeta, até que não haja nenhum mais gotículas sendo filtradas.
      Nota: Quando a mistura, pode haver partículas grandes o suficiente para tapar a pipeta de 5 mL. Neste caso, repita a utilização do Vortex da etapa 2.5.3 e se a solução ainda não separar, usar a pipeta para pressionar as partículas contra a parede do tubo.
   5. Repita a etapa 2.5.4, mudar filtros de célula entre cada tubo de chorume cecal e piscina todo o conteúdo no mesmo 50 mL tubo de centrífuga coleção mantidos no gelo, ou em um tubo de centrífuga de 50 mL segundo se o volume do filtrado excede o nível de gelo na caixa de gelo.
6. O chorume cecal de alíquota.
   1. Se for o caso, combine vários tubos de 50 mL chorume cecal filtrado da etapa 2.5.5 em um recipiente estéril maior (por exemplo, uma garrafa de armazenamento de 1.000 mL). Em seguida, vórtice por 15 s e coloque 20 mL para um novo tubo de centrifugação de 50 mL.
   2. Vórtice o estoque de chorume cecal que está no tubo de centrífuga de 50 mL por 5-10 s e alíquota 500 µ l em três frascos de 2ml criogênico que têm um selo de borracha, para evitar a evaporação ao longo do tempo. Coloca imediatamente o mestre estoque e frasco criogênico aliquotado no gelo.
   3. Repita as etapas 2.6.1 e 2.6.2 até todo o chorume cecal tem sido aliquotadas, utilização do Vortex o estoque mestre após cada três frascos criogênicos para evitar a sedimentação de quaisquer partículas e a manutenção de uma mistura homogênea.
   4. Congelar as alíquotas de chorume cecal a-80 ° C.
      Nota: Espera-se entre três a quatro frascos de estoque 500 µ l de cada rato adulto. Cada frasco de estoque deve ser suficiente, cerca de desafio uma ninhada de oito ratos no DOL 7.

3. desafio sepse neonatais ratos 7 dias de idade

1. Separar, identificar e pesar ratos neonatais.
   1. Em um BSC, transferi os ratos neonatais para uma gaiola nova para manter os ratos longe da barragem e reduzir o estresse para a represa.
   2. Retire e esfregue a parte do material de nidificação com luvas para transferir o cheiro da gaiola para as luvas. Em seguida, moldar o assentamento do material em um pequeno ninho e colocá-lo em uma gaiola nova sem a barragem.
   3. Transferi os ratos neonatais para o material de nidificação na nova gaiola.
   4. Transferência de material de nidificação mais para fazer um ninho vazio, segundo a nova gaiola.
   5. Feche e remover gaiola da barragem do bairro, para que a represa não é estressada de aflição dos ratos neonatal a ouvir.
   6. Para controlar ratos neonatais individuais dentro da ninhada ao longo do tempo, use um marcador de etanol-prova para marcar um a cinco pontos na parte frontal ou reversa da cauda, reaplicando a cada 12-24 h, conforme necessário.
   7. Pese cada rato que serão desafiados, colocando cada um no secundário ninho após a pesagem e repita isto para todos os ratos.
   8. Retorne a ninhada inteira até à barragem antes de preparar o desafio de chorume cecal alíquota.
2. Calcular as doses individuais de peso ajustado de chorume cecal e necessária diluição com D5W concluir esta etapa para cada ninhada separadamente, usando os cálculos abaixo ou usando a planilha fornecida (ver Arquivo suplementar).
   1. Calcule as miligramas de chorume cecal (um) para ser administrado a cada rato multiplicando o peso do rato em gramas (b) entre a dose desejada de desafio em mg de chorume cecal por grama de rato (c).
      
   2. Calcular o volume individual de chorume não diluído de cecal estoque exigido por rato em microlitros (d) dividindo as miligramas de chorume cecal necessários por rato da etapa 3.2.1 (um) pela concentração das ações da pasta cecal, 160 mg de chorume cecal por mililitro de D5W (e) e multiplicar por 1.000 µ l por mililitro para converter ml para microlitros.
      
   3. Média do volume de estoque de chorume cecal exigido por rato (g) pela soma do volume de estoque de chorume cecal (d) por rato em uma ninhada de ratos n , dividido pelo número de ratos (n).
      
   4. Calcule o factor de diluição média para o estoque de chorume cecal (h) dividindo o volume de injeção médio (100 µ l) pelo volume de estoque médio de chorume cecal exigido por rato (g).
      
   5. Calcular o volume de injeção específico do cada rato em microlitros (j) multiplicando o volume de cada rato de chorume cecal ações necessária (d) pelo factor de diluição média (h) e em seguida arredondar para as últimas 10 (para coincidir com o 10 µ l incrementos da seringa de injeção).
      
   6. Calcule o volume médio necessário de D5W para diluir o estoque de chorume cecal (k) subtraindo-se o estoque médio chorume cecal (g) do volume médio de injeção (100 µ l).
      
   7. Calcule a quantidade total de ações da pasta cecal em microlitros (l) multiplicando o chorume cecal estoque médio por rato em microlitros (g) pelo número de ratos nesta ninhada (n) e multiplicar por 1,4 para criar extra.
      
   8. Calcular a quantidade total de D5W em microlitros (m) necessários para diluir o estoque de chorume cecal multiplicando-se o volume médio necessário de D5W (k) pelo número de ratos (n) e multiplicar por 1,4 para criar extra.
      
3. Prepare-se alíquota o desafio depois de calcular a quantidade de chorume cecal ações necessária (l da etapa 3.2.7). Em um BSC, descongele o número necessário de frascos de estoque cecal chorume à temperatura ambiente, pipetagem seu conteúdo para misturar.
   1. Quando existem cristais de gelo não mais visíveis presentes no chorume cecal descongelado, transfira a quantidade calculada de estoque cecal de chorume (l da etapa 3.2.7) para um tubo de microcentrifuga estéril 1,8 mL.
   2. Dilua na concentração necessária adicionando D5W gelada, calculado na etapa 3.2.8 (m). Armazene a alíquota de desafio no gelo.
   3. Antes de carregar a seringa, misture o tubo de microcentrifuga por agredir-20x, seguido por 3 x de elaboração e expulsando 300-500 µ l de chorume cecal com uma seringa de insulina de ½ polegada de 28 G de 500 cc.
   4. Elaboração de aproximadamente 150 µ l de chorume cecal diluído na mesma seringa.
   5. Agite a seringa para retirar bolhas de êmbolo, retiraram-se ligeiramente na seringa e depois expulsar as bolhas.
   6. Dispense a excesso da pasta cecal volta no tubo de microcentrifugadora até a quantidade correta de chorume cecal para um rato, como foi calculado para ratos individuais em passo 3.2.5 (j), é carregado na seringa.
4. Intraperitonealmente injetar cecal chorume, de acordo com as diretrizes de instituição de cuidados de animais locais relevantes, ou usar as etapas descritas abaixo.
   1. Em um BSC, separe os ratos neonatais da barragem, conforme descrito na etapa 3.1.
   2. Nuca o mouse pela parte de trás do pescoço, usando o polegar e o dedo indicador.
   3. Prenda a cauda do rato através da parte traseira do meio e dedos anelares, ou na frente dos dedos anel e pinky.
   4. Para minimizar os vazamentos, incline o rato neonatal de modo que fique voltado para baixo e insira o bisel da agulha da agulha voltada para cima, entre a perna e a genitália, mantendo a agulha subcutânea e superficial.
   5. Quando a agulha é inserida para 1 cm, pressione para baixo e para frente para sentir a agulha de punção do peritônio. Lentamente, pressione o êmbolo, mantendo a ponta da agulha tão estável quanto possível, pois os movimentos laterais podem danificar órgãos do rato.
   6. Retire cuidadosamente a agulha sobre s 5-10, seguindo a mesma rota para fora como nos, o dedo médio de relaxamento durante a remoção para reduzir a tensão no corpo do mouse.
   7. Para verificar se há vazamentos, segure o mouse por alguns segundos após a remoção da agulha permitir que o tempo para o local da injeção fechar e observar quaisquer fugas ou abaulamento no local da injeção, no ponto em que o mouse não deve ser utilizado na análise.
      Nota: Abaulamento da pele no local da injeção indica uma falha injeção intraperitoneal, com o injectant sendo subcutâneo.
   8. Coloque o mouse sobre uma toalha de papel e permitir que o mouse para dar um passo. Se o mouse está imóvel por 5 s, em seguida, pressione levemente a cauda.
   9. Pegar o mouse e verificar se há algum vazamento de chorume cecal no local da injeção. Se houver um vazamento, excluir o mouse a partir da análise e eutanásia o mouse.

4. Mouse monitoramento

1. Monitore os ratos regularmente para verificá-los para chegar a um ponto de extremidade humano.
   1. Observe os ratos postchallenge 2h para quaisquer complicações relacionadas à injeção.
   2. Monitorar o postchallenge de 12 h de ratos para morbidade relacionadas com sepse e a identificação dos ratos no ponto de um humano (ver passos 4.2-4.3 para critérios).
   3. Posteriormente, monitore cada 4-6h para os primeiros 2 dias, exceto para 8 h durante a noite, quando os ratos neonatais são autônomas.
   4. Além de 2 dias postchallenge, monitore x-2 1x por dia. Se doente, observam-se os ratos ou camundongos cuja Pontuação de saúde diminui, então aumente a frequência de monitoramento a cada 4-6 h.
2. Monitoramento de ratos Neonatais
   1. Para qualquer procedimento envolvendo ratos neonatais, transferir o fundamento material para uma nova gaiola, conforme descrito na etapa 3.1 (para as mesmas razões como mencionado lá). Verifique cuidadosamente para qualquer recém-nascidos que são arrastados do ninho enquanto a enfermagem. Algum rato que é arrastado para fora da maca enquanto a enfermagem não deve ser considerado para ser espalhados ratos.
   2. Quando remover a parte superior do ninho, identificar qualquer dispersão dos ratos neonatais ou longe do ninho ou preso no material de nidificação, mas longe deles littermates, com excepção dos ratos arrastaram para longe do lixo enquanto a enfermagem. Referem-se ao ponto de extremidade humano critérios na etapa 4.5 se encontra-se um rato espalhados.
3. Medir dos ratos braço endireitante reflexos e mobilidade.
   1. Sobre uma toalha de papel, coloque um rato em suas costas e monitorar por sua capacidade de direito próprio, no prazo máximo de 4 s. Quando colocado em suas costas, o mouse vai cair para a esquerda ou direita, que é quando começa a contagem de s 4.
      Nota: Para ser classificado no grupo "Direitos", o rato deve ser capaz de obter pelo menos três de quatro pata almofadas sobre a toalha de papel para 1 s. Ele ainda é agrupado como sendo capaz de direito próprio, se isso cai.
      1. Se o mouse pode em si mesmo, então Aguarde 8 s para determinar seu nível de mobilidade.
      2. Categorize o mouse como "Direitos-móvel" se pode em si mesmo e explorar seu ambiente, tendo várias etapas em uma fileira.
      3. Categorize o mouse como "Direitos-letárgico" se pode dar alguns passos para explorar seu ambiente e em si mesmo. Os ratos deste grupo podem cair enquanto estiver a tomar um passo, parece instáveis em seus pés e pausa entre as etapas.
      4. Categorize o mouse como "Direitos-Nonmobile" se pode em si mesmo, mas não se move em torno de um lote. Pode cair ainda mais, e se não toma quaisquer etapas dentro de 8 s, é agrupado como direitos-Nonmobile.
   2. Se o mouse não pode está certo em si, então, categorize sua mobilidade com base no movimento de quadril observado.
      Nota: Evitar a repetição de acompanhamento ou aumentar o comprimento de tempo que o mouse passa nas costas porque isso pode afetar o sistema de Pontuação e endpoint humana, como um rato que em si mesmo dentro de 4 s pode às vezes, não fazê-lo se dado mais tempo.
      1. Categorizar o mouse como "Fail para a direita (FTR)-Mobile" se é incapaz de corrigir-se e mostra o movimento de quadril que exceda o ângulo de 90° da horizontal. Alguns ratos podem bem se se deu mais de 4 s, mas ainda deve ser classificada como FTR, com golo de mobilidade com base no movimento de quadril.
      2. Categorize o mouse como "FTR-letárgico" se é incapaz de direito próprio e mostra o movimento de quadril abaixo do ângulo de 90° da horizontal.
      3. Categorize o mouse como "FTR-Nonmobile", se é incapaz de direito próprio e tem pernas que sacudir ou vibram, mas nenhum movimento de quadril. Os membros podem estender ou retrair mas fazer não tem movimento lateral. O rato está visivelmente doente e atingiu o ponto de extremidade humano.
4. Repita a etapa 4.3 do outro lado do mouse, gravando a ambos os lados.
   Nota: Consulte o Arquivo complementar para a gravação de observações.
5. Determine se o mouse está em um ponto de extremidade humano e exige a eutanásia, conforme descrito na tabela 1e abaixo.
   1. Categorize os ratos em corrigir diferentes e níveis de mobilidade com base em observações monitoramento observadas em passos 4.3 e 4.4. Mobilidade do rato é medida para cada lado, e o comportamento de móvel é usado para determinar se o mouse necessita de eutanásia.
   2. Atribua algum rato com um endireitamento reflexo de FTR-Nonmobile (a) ou (b) FTR-letárgico e encontrado separada do ninho para ser um ponto de extremidade humana.
   3. No monitoramento de pontos de tempo além da postchallenge de 20 h, classificar qualquer mouse com um braço endireitante reflexo de "falha ao direito", em ambos os lados como sendo um ponto de extremidade humana, porque os dados apresentados preveem com exatidão elevada que estes ratos eventualmente sucumbem à doença e não Recupere-se.
6. Ratos separados que estão a ser sacrificados, conforme determinado na etapa 4.5. Se o mouse monitorado não é visto como um ponto de extremidade humana, coloque-o no segundo ninho vazio na gaiola nova sem a barragem e continuar com os outros ratos neonatais.
7. Assim que a ninhada inteira tem sido monitorizada, mova metade do material aninhamento dentro da jaula com a barragem, reformar um ninho com espaço no meio para os ratos neonatais.
   Nota: Um ninho formado incorretamente pode causar os ratos espalhar e reduzir a quantidade de cuidados disponíveis que a barragem pode oferecer.
8. Transferi os ratos neonatais volta para a jaula com a barragem.
9. Coloque o lixo no ninho, colocando o material de nidificação resto sobre a maca e apertar suavemente ao redor da tampa para fixar o material de nidificação no lugar.
10. Eutanásia nos ratos neonatais separados na etapa 4.6, de acordo com os requisitos da instituição local.

5. titulação do chorume cecal

1. Desafiar os ratos com a dose de desafio desejado (seção 3) e monitorar os resultados (seção 4).
2. Observar se o resultado final resulta na identificação desejada e se não, repita as secções 3 e 4 com uma nova ninhada com uma dose de desafio superior ou inferior, ajustando-o por 5% - 10%.
   Nota: Doses de desafio podem ser semelhante à figura 1B , mas precisa ser titulada em cada instalação e cepa de ratos.
3. Além disso, observe se os ratos atingir um ponto de extremidade humano mais rápido ou mais lento do que o esperado cinética na figura 1Be repita as secções 3 e 4 com uma nova ninhada com uma dose de desafio superior ou inferior, ajustando-o por 5% - 10%.

Resultados

Viabilidade de chorume cecal armazenada a-80 ° C pode ser testada ao longo do tempo por serialmente diluindo e chapeamento alíquotas de estoque de chorume cecal no ágar de tryptic soy de sangue de carneiro 5% seguido por 24h de aeróbia incubação a 37 ° C. Subsequente contagem dos viáveis conteúdo unidade (CFU) formadoras de uma preparação de chorume cecal foi encontrada para não mudar ao longo de um período de 6 meses, e a viabilidade não foi afetada pelo armazenamento prolongado a-80 ° C (Figura 2). Cada rato doador resultou, em média, em suficiente cecal chorume para desafiar três ou quatro ninhadas (dados não mostrados).

Camundongos desafiados no DOL 7 com chorume cecal a induzir sepse polymicrobial começaram a atingir o ponto de extremidade humano até 12 horas após o desafio, e sepse polymicrobial principalmente foi resolvido por postchallenge de 48 h, como observado em uma curva de sobrevivência de Kaplan-Meier combinada de dados de mais de 200 ratos desafiados (figura 1A). A letalidade foi dependente da dose de desafio administrada, com uma mudança de 5% na dose de desafio, resultando em uma cerca de 15% de diferença na taxa de sobrevivência (figura 1B). O peso do corpo do mouse foi medido em cada visita de controlo. Perda de peso foi vista em todos os animais desafiados, sendo não-discriminatório entre ratos que acabaram por sobreviver e aqueles que não durante os primeiros 24 h postchallenge (Figura 1). Após 24h, animais mais sobreviventes começaram a recuperar o seu peso, enquanto todos os nonsurvivors continuaram a perder peso e mudou-se para seu ponto de extremidade humano. No entanto, uma pequena proporção de animais que tinham mantido seu braço endireitante reflexo também continuou a perder peso ou falha ao ganho de peso, até o final do experimento, mesmo perdendo tanto quanto 20% do seu peso inicial dentro de 40 h do desafio de sobreviver. Como havia uma sobreposição de perda de peso entre os ratos que acabaram por sobreviver e aqueles que não o fez, a mudança de peso ou um limite de perda de peso pode não ser usado como critério para ponto de extremidade humano mantendo ainda o objetivo de dividir com precisão os sobreviventes de nonsurvivors.

O comportamento dos ratos foi monitorado conforme descrito no protocolo e na tabela 2. Instantâneos da saúde categorias são exibidas (Figura 3A-C). Estas fotos mostram as categorias de saúde diferentes dos ratos que não conseguiram se após serem colocados em suas costas e delinear a diferença entre móvel-FTR e FTR-letárgico, que é uma distinção importante. Incontestada ratos saudáveis desta idade não exibem atividade FTR-letárgico; Portanto, esta categoria de saúde é um marcador de doença e uma resposta ao desafio. Doente de ratos exibido sintomas FTR-letárgico (Figura 3B) e podem regredir em direção a FTR-Nonmobile (Figura 3), onde a coxa permanece paralela com a perna inferior, com pouco ou zero quadril balançar o movimento, que é um dos critérios para humana, ponto de extremidade. Os ratos também podem recuperar, ganhando maior movimento de quadril e se tornando FTR-Mobile (Figura 3A). Determinou-se o braço endireitante reflex e golo de mobilidade para a esquerda e o lado direito do mouse cada, e a maior pontuação foi utilizada para determinar se o mouse tinha atingido um ponto de extremidade humano. Informações comportamentais foi coletadas de mais de 240 animais desafiados com uma dose letal (LD₆₀) de 60 de chorume cecal e 144 pontos de extremidade humanos foram observados (Figura 3D-F e tabela 1). Esta abordagem baseada em evidência foi usada para definir e refinar o ponto de extremidade humano através de quatro estágios da doença, categorizados pelos experimentadores com base em ambas as diferenças comportamentais entre sobreviventes e nonsurvivors e pela fração de pontos de extremidade humanos alcançado durante cada período de tempo. Durante as primeiras experiências, ratos FTR-Nonmobile que não tinha nenhum movimento de quadril consistentemente foram encontrados mortos dentro de 4-6 h deste comportamento que está sendo observado. Na coleção da informação apresentada, uma pontuação de saúde FTR-Nonmobile foi usada como critério para uma empresa de humana. De postchallenge de 12-21 h, enquanto os ratos FTR-Nonmobile foram sacrificados, animais sobreviventes e nonsurviving exibido padrões comportamentais muito semelhantes e não poderiam ser distintos de qualquer outra forma (Figura 3D). De postchallenge 21-48 h, a maioria dos sobreviventes ratos recuperou seu braço endireitante reflexo, enquanto menos de 1% dos comportamentos FTR observados foram em animais que iria sobreviver o experimento (Figura 3E). Assim, os ratos que não conseguiram se direito de ambos os lados tornou-se um critério adicional para ponto de extremidade humano durante este tempo. Entre 12 e 20 h postchallenge, 12,5% do número total de pontos de extremidade humanos foram observados, versus 80,5% entre 20 e 48 h e 7% após 48 h (tabela 1). Uma característica distintiva entre ratos que acabou por sobreviver e que eventualmente se agravou a um ponto de extremidade humano foi a perda do braço endireitante reflexo, independente de mobilidade de quadril (Figura 3F). Com efeito, entre 20 e 48 h após o desafio, um total de 121 ratos tinha falhado ao certo se de ambos os lados, com 116 destes ratos eventualmente progredir a um ponto de extremidade humano (o que representa uma precisão de 96% na identificação de ratos que não recuperariam). Para além de 48 h após o desafio, observaram-se 11 ratos falhem ao certo se de ambos os lados e 10 destes progrediu para um ponto de extremidade humano (um 91% de precisão). Além de 20 h após o desafio, o número de ratos que perdeu o braço endireitante reflexo para ambos os lados prediz o resultado final com uma precisão de mais de 90%; Portanto, este foi adicionado aos critérios de ponto de extremidade humana, para identificar os ratos nonrecovering mais cedo e reduzir rato sofrendo (tabela 1).

A frequência que os ratos precisam de monitoramento muda ao longo do tempo, devido às diferentes taxas de postchallenge de morte e é descrita na tabela 1. Um rato foi considerado em sua extremidade humana em qualquer momento se tinha falhado para a direita se exibido nonmobile movimento de quadril de ambos os lados, ou se o mouse foi encontrado espalhada do ninho, foi incapaz de direito próprio e tinha movimento de quadril letárgico. Ratos com uma dessas condições não eram esperados para ser capaz de voltar para a maca e foram observados para ser FTR-Nonmobile dentro de 4-6 h h 20 começando após o desafio, um novo ponto de extremidade humano foi adicionado porque a informação apresentada mostra que o vasto maioria dos ratos que FTR de ambos os lados acaba por sucumbir à doença.

Os vídeos, tabelas e recursos apresentados neste manuscrito são um recurso de ensino eficazes para a correta atribuição comportamental de ratos desafiados. Sete experimentadores foram convidados a assistir ao vídeo de treinamento e ler o protocolo e as tabelas antes de atribuir comportamentos para 60 animais desafiados. A identificação de atribuição de ponto de extremidade humano foi precisa tanto para ratos de FTR-Nonmobile distintivos dos ratos que exibidos os outros comportamentos (Figura 4A) e FTR ratos de ratos que foram capazes de corrigir-se dentro o frame de tempo permitido ( Figura 4B).

Figura 1 : Curva de sobrevivência Kaplan-Meier, titulação de dose de chorume cecal e mudança de peso seguindo o desafio de chorume cecal. (A) resultado de sobrevivência de neonatais camundongos C57BL/6J, desafiado com uma injeção intraperitoneal de chorume cecal no DOL 7. Os dados para esta figura foram combinados de experimentos independentes usando o desafio de múltiplas doses, que variam de 0,7 a 1,3 mg de chorume cecal por grama de peso corporal foi administrados a estes ratos. (B) ratos Neonatal desafiados com 0,80 a 0,95 mg de chorume cecal por grama de peso corporal de uma preparação de chorume cecal exibem uma relação dose-dependente entre a quantidade de chorume cecal dada e a porcentagem de sobrevivência. (C) a percentagem de mudança de peso em relação ao peso do desafio, com a linha pontilhada que indicam uma perda de 20% do peso do tempo do desafio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 : Concentração de UFC no chorume cecal estoque armazenado a-80 ° C não muda ao longo de um período de 6 meses. O efeito da idade do chorume cecal na concentração de UFC foi testado usando a regressão linear. Cada ponto representa uma parte alíquota da mesma preparação de chorume cecal, serialmente diluída e banhado por um período de 6 meses. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 : Categorias de mobilidade dos ratos que deixam de si mesmo e de comportamentos animais em diversos momentos postchallenge no quadril. Ratos que têm sido desafiados com sepse, quando colocado em suas costas, irão exibir sinais de morbidade que pode ser medido pelo grau de movimento do quadril. (A), A falha para a direita (FTR)-rato móvel mostra hip movimento oscilatório de sua coxa superior a 90º de horizontal. (B) An FTR-letárgico mouse quadril mostra movimento de balanço mas não exceda o ângulo de 90 ° da horizontal em qualquer momento durante o 4 s de acompanhamento. (C) alguns FTR-Nonmobile ratos estenderá sua perna, dobra no joelho, mas irão mostrar muito pequeno (menos de ângulos de 10 °) para zero quadril em movimento e as pernas balançando permanecerão paralelo uns aos outros. (D) comportamentos animais h 12-21 postchallenge mostrar que somente a comportamentos FTR-Nonmobile separar sobreviventes do nonsurvivors. (E) de 21 a postchallenge de 48 h, apenas 4 fora os 592 comportamentos FTR observados (0,67%) pertencem aos sobreviventes, permitindo que o endireitamento reflexo para prever o resultado final e ser usado como um novo critério para humano de ponto de extremidade. Postinfection (F), além de 48 h, 6 de 131 ratos (4,55%) que tinham um braço endireitante reflexo passou a integrar o grupo FTR e sacrificaram-se até ao final do experimento, justificando acompanhamento sustentado ao longo do curso de recuperação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4 : Recursos instrucionais conduzir exata classificação comportamental por experimentadores independentes. Experimentadores treinados por assistir o vídeo que acompanha este protocolo Categorizado vídeos de 60 ratos neonatais em grupos diferentes saúde. (A), a capacidade de distinguir um ponto de extremidade humano foi determinada e uma média de 97% dos comportamentos foi com precisão categorizada como FTR-Nonmobile ou não, enquanto apenas 1% dos ratos FTR-Nonmobile foram identificados incorretamente. Dois por cento dos ratos foram falsamente identificados como FTR-Nonmobile. (B) a identificação do ponto de extremidade humana segunda critério de distinguir correctamente entre ratos FTR ou aqueles que têm a capacidade de corrigir-se dentro de 4 s de serem colocados nas costas foi atribuído corretamente em 97% do escore, enquanto única 0,96% dos ratos foram incorretamente atribuído como corrigir-se e 2% dos ratos foram incorretamente atribuído como FTR. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Estágio de doença	R: elevada morbilidade, a mortalidade não	B: alta morbidade, baixa mortalidade	C: alta taxa de morbidade, mortalidade elevada	D: baixa morbidade, baixa mortalidade
Horas pós desafio	0−12	12−20	20−48	> 48
Frequência de monitoramento	desafio de h 2 post	cada 4−6 h	Cada 4−6 h, 8 h, durante a noite desacompanhado	1−2 vezes ao dia, mais se necessário
Proporção de pontos de extremidade humanas totais observado	0/144	18/144	116/144	10/144
Percentagem de pontos de extremidade humanos observado	0%	12,5%	80,5%	7%
Critérios de ponto de extremidade humana	1. FTR−Nonmobile em ambos os lados		1. FTR−Nonmobile em ambos os lados
	2. espalhados de ninho e é FTR−Lethargic		2. espalhados de ninho e é FTR−Lethargic
			3. FTR em ambos lado esquerdo ou direito (com qualquer pontuação de mobilidade)

Tabela 1: frequência dos critérios de ponto de extremidade de monitoramento e humana nas diferentes fases da doença. Frequência de monitoramento, pontos de extremidade humanos observada, a percentagem de pontos de extremidade do humanos e critérios de ponto de extremidade humana durante diferentes estágios da doença de.

Reflexo de endireitamento	Mobilidade	Limite de tempo para a direita após serem colocados na traseira	Limite de tempo para medida de quantidade de movimento (móvel / letárgico / nonmobile)	Critérios de Pontuação de mobilidade
Direitos	Móvel	4 s	Um adicional de 8 s	O rato leva várias etapas consecutivas, mantendo o impulso para a frente e explora o seu ambiente. Filhote de cachorro não vai cair.
	Letárgico			O mouse pode dar um passo, mas irá parar e pausar antes de tomar outro. Filhote pode cair.
	Nonmobile			O mouse não tome quaisquer medidas após corrigir em si. Filhote pode cair.
Falhar para a direita	Quadris móveis		O mesmo 4 s usado para medir o braço endireitante reflex	Tem movimento enérgico de quadril com a perna superior rotativa para além de 90° da horizontal pelo menos uma vez dentro de 4 s.
	Quadris letárgicos			Movimento de quadril até, mas não para além de 90° da horizontal.
	Nonmobile ancas			Os membros podem mover-se estendendo e retraindo mas os quadris não rodará. Filhote de cachorro está muito doente.

Tabela 2: tabela e critérios para determinar a pontuação de saúde dos ratos de monitoramento. Os critérios fornecidos foram usados para definir grupos de categorias de saúde aos ratos e para reduzir a variação individual na atribuição de escores de saúde.

Discussão

Pós-natal ratos neonatais tem muito limitada mobilidade e falha de corrigir-se após serem colocados em suas costas, mesmo quando sob ameaça. Por DOL 7, a idade dos ratos desafiada neste modelo, uma gama de movimento desde a fase de direitos-Mobile para FTR-Mobile foi observada em ratos incontestados, com uma diferença importante, ou seja que um rato incontestado nesta idade não exibir comportamento FTR-letárgico. Só ratos desafiados com sepse polymicrobial foram observados para se tornar FTR-letárgico; Portanto, esta resposta pode ser um marcador de gravidade da doença. Estar atento para o corte de um ângulo de 90° da horizontal para o movimento de quadril permite a atribuição consistente e exata do movimento de quadril letárgico ou móvel em camundongos. O período de tempo de 4 s para ver se um rato pode certo em si foi selecionado porque incontestada de ratos foram capazes de direito-se consistentemente dentro deste prazo. Repetir a medição do mouse mesmo foi evitada, enquanto o tempo para si mesmo e a medida da mobilidade do quadril foi limitada a 4 s, para evitar excessivamente cansativo o mouse, o que pode afetar sua capacidade de obter alimento e calor e pode afetar sua prognóstico melhor. Corrigindo-se da esquerda e o lado direito foram observados, e a maior das pontuações foi usado para determinar se o mouse foi um ponto de extremidade humana, porque alguns ratos foram encontrados para exibir FTR-Nonmobile de um lado tem ainda uma maior mobilidade do outro lado e b e capaz de recuperar eventualmente.

O sistema de Pontuação utilizado para avaliar a saúde do rato baseou-se sobre a aplicação de cortes categóricos ao que é um espectro de movimento e, portanto, pode ser propenso a polarização individual. Pessoal foi treinado juntos para garantir que cada pessoa marcou os ratos o mesmo; no entanto, provavelmente continuarão a existir um nível de subjetividade, levando à variação. A consistência da pontuação foi avaliada por ter sete pesquisadores que não tinham anteriormente realizado o monitoramento do rato neonatal aprender os requisitos descritos no presente protocolo e vídeo e, em seguida, independentemente atribuir comportamentos e determinar humanos ponto de extremidade. Observou-se uma precisão de 97% com a pontuação executada em 60 ratos desafiados, sugerindo que o viés individual não desempenhar um papel substancial nas atribuições comportamentais deste modelo. O protocolo de monitoramento comportamental apresentado é baseado em observações de animais desafiados em DOL 7, ainda ratos mais jovens que 6 dias em um estado saudável incontestado consistentemente se não podem, certo. Assim, os critérios de ponto de extremidade humano descrito não podem ser aplicados diretamente aos ratos mais jovens. Se os ratos mais jovens são usados neste modelo experimental, ou se for aplicado um modelo diferente de desafio com cinética de doença diferente, então critérios adequados endpoint humana devem ser desenvolvidos e pilotados para evitar a eutanásia de ratos que seria caso contrário, eventualmente, Recupere-se. O sistema de Pontuação exibe um método robusto, de melhorar a classificação de ponto de extremidade humana que, com testes e confirmação, potencialmente poderia ser aplicada a outros modelos.

Cada preparação de chorume cecal ou o uso de uma Nova cepa de rato necessária a retitration da dose cecal chorume para administrar para atingir uma dose letal semelhante. Cada preparação foi padronizada pela leitura de interesse, ou seja, sobrevivência, ao invés de dar a mesma contagem bacteriana. Concentração de bactérias viáveis do cada preparação chorume cecal, variada ligeiramente, possivelmente devido a diferenças na bactéria comensal do doador ou devido a variações no peso deixou no filtro célula de postfiltration de estoque o chorume cecal. Durante a titulação do chorume cecal, as duas primeiras ninhadas foram divididas em dois grupos e cada metade da ninhada foram desafiados com uma das duas doses para que cada uma das doses seria testada em duas ninhadas. Se a taxa de sobrevivência resultante não combina com o nível exigido, então a dose de desafio foi aumentada ou diminuída de 5% - 10% e repetiu o experimento. Várias ninhadas foram usadas para explicar diferenças de maca-para-lixo que poderiam causar resistência ou aumentaram a susceptibilidade à infecção através de uma ninhada. Era importante com precisão o título o estoque de chorume cecal com cada nova preparação para garantir que a nova titulação de chorume cecal era comparável às preparações de chorume cecal anterior. Períodos de excesso ruído e vibração, especificamente durante a compactação de asfalto e a construção de um prédio vizinho e estrada, observou-se que aumentam o estresse em barragens. Esta correlacionada com o aumento das taxas de canibalização e afetou a mortalidade dos experimentos sobrevivência, afetando mesmo ratos incontestados, indicando que pode haver impactos externos a sobrevivência neonatal, que também precisam ser controlados para.

Métodos anteriores para preparação da pasta cecal incluem o uso do chorume cecal fresco ou a preparação de chorume cecal congelado, usando uma variedade de métodos, incluindo o armazenamento em glicerol que inevitavelmente seria transferido durante o desafio. Enquanto o uso do chorume cecal fresco fornece a vantagem de ter uma composição bacteriana mais próxima ao original conteúdo cecal, há o risco de variação entre ratos de doadores individuais, devido a variação de bactérias comensais. Enquanto isso foi minimizado usando cecal doadores do mesmo fornecedor com menor tempo entre a chegada e a progressão do experimento, isto poderia tornar-se uma opção de custo proibitivo para alguns laboratórios e apresentou outro desafio de logística de sincronismo em ter idade-combinadas ratos disponíveis quando iniciar um chorume cecal experiência em camundongos neonatais que eram 7 dias de idade. Foi utilizado um método alternativo ao uso de chorume cecal fresco, onde conteúdo cecal de múltiplos doadores adultos foram agrupado, resuspended em D5W, congelado a-80 ° C sem glicerol e descongelado uma alíquota de cada vez para experimentos. A utilização de dejetos cecal de doador adulto para estudar sepse neonatal poderia potencialmente transferência de espécies de bactérias presentes no chorume cecal que o rato neonatal não tem sido exposto a, mas é uma estratégia que permite o estudo da sepse em camundongos Neonatais e tem sido usada para estudar Biologia rato neonatal nos últimos^14,13,15. Cecal chorume foi diluído em D5W para fornecer nutrição para as bactérias, o que permitiu o estabelecimento de uma infecção activa, uma vez que as bactérias foram injetados e foi feito para imitar a disponibilidade de nutrientes no interior da cavidade peritoneal durante necrosante enterocolite. Glicerol não foi incluído como um agente de estabilização no congelamento de bactérias devido os potenciais efeitos colaterais negativos que poderiam decorrer de injeção de glicerol sozinha. Se glicerol tinha sido incluído na preparação da pasta cecal, então o dano potencial que glicerol sozinho poderia induzir iria precisar de ser testado, incluindo um somente glicerol (faltando cecal chorume) injeção em ratos, que teriam aumentado mouse uso. A viabilidade de bactérias das populações de chorume cecal foi testada após a congelação o estoque de chorume cecal sem glicerol e foi encontrada para ser constante, com nenhuma mudança na concentração de bactérias em alíquotas diferentes da mesma preparação de chorume cecal armazenada a-80 ° C por um 6 período de meses. Isto sugere que o armazenamento sem glicerol é viável em fornecer um resultado consistente e biológico. O uso de um preparado de granel congelado estoque cecal chorume também permitiu o uso de ratos criados internamente, reduzindo custos e, portanto, utilizando camundongos machos que seriam excesso de reprodução, reduzindo o desperdício de rato.

A identificação dos desafios falhou em camundongos foi importante para evitar a adição de ruído extra ao sistema. Depois de ser submetido a uma injeção intraperitoneal de chorume cecal, os ratos foram observados a presença de uma protuberância sob a pele, que indicou uma injeção de falha que era na verdade subcutânea. Os ratos foram observados vazamentos no local da injeção, imediatamente após a remoção da agulha e depois que lhes permite dar um passo após a injeção, porque os ratos que às vezes (raramente) vazamento apenas depois de mover o membro do local da injeção por dar um passo. A presença de uma protuberância ou vazamento após a injeção resultou na remoção do mouse a partir da análise. Afinal, qualquer um destes pode resultar em um resultado diferente devido a quantidade incorreta de chorume cecal injetado como uma diferença de 5% na dose de desafio tem sido observada para afetar a sobrevivência subsequente.

Desafio de chorume cecal experimentos frequentemente necessário letais alvo doses variando com diferentes doses de peso ajustado. Devido a isto, os volumes de injeção podem variar de tão pouco como 20 µ l e até 100 µ l. O erro experimental proporcional associado com agulha morta volume também altera junto com o volume de injeção, aumentando a dificuldade de comparar diretamente doses diferentes. Com a simples modificação de padronizar o volume de injeção, esta fonte de variância é removido do experimento.

Sistema de monitoramento comportamental do rato neonatal, utilizado neste protocolo é o primeiro de seu tipo. Intenção de pesquisadores na realização de pesquisas éticas com ratos recém-nascidos são frequentemente confrontados com a falta de um desafio de recursos para avaliar o bem-estar do animal nesta idade. O sistema de controlo intuitivo e consistente apresentado começa a resolver esta lacuna de conhecimento. Importante, esta abordagem baseada em evidência não só aumenta a qualidade dos dados experimentais obtidos, mas, ao mesmo tempo, também reduz o sofrimento dos animais experimentais.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 - 20 μL pipette tips	VWR	732-0799
1.8 mL Microcentrifuge tube	Costar	3621
100 - 1000 μL pipette tips	VWR	732-0801
1 - 200 μL pipette tips	VWR	732-0800
15 mL Centrifuge tube	FroggaBio	TB15-25
23G1 needles	Becton Dickinson	305145	only the needle, not the syringe, used for pinning mouse to styrofoam
28G 0.5 mL Insulin syringe	BD	329461
2 mL Cryogenic vial	Corning	430488
50 mL Centrifuge tube	Fisher scientific	14-432-22
5 mL pipette	Costar	4487
6 - 10 week old C57BL/6J adult mice	Jackson Laboratories	664
7 + day old C57BL/6J neonatal mice	Bred in house	n.a
70 μm Cell strainer	Falcon	352350
Defibrinated Sheep's Blood	Dalynn	HS30-500
Dextrose 5% Water (D5W)	Baxter	JB0080
Dissecting forceps	VWR	82027-386
Dissecting Scissors, Sharp Tip	VWR	82027-592
Dissecting Scissors, Sharp/Blunt Tip	VWR	82027-594
Ethanol (HistoPrep 95% Denatured Ethyl Alcohol)	Fisherbrand	HC11001GL	diluted to 70% with double distilled water
Ethanol-proof marker; Lab marker	VWR	52877-310
EZ Anesthesia Vaporizer	EZ Anesthesia	EZ-155
Germinator 500, Dry sterilize surgicial instrument (Hot bead sterilizer)	Braintree Scientific	GER 5287-120V
Isoflurane	Fresenius Kabi	CP0406V2
Micro Spatula	Chemglass	CG-1983-12
Pipette-Aid	Drummond	4-000-100
Rainin Classic Pipette PR-1000	Rainin	17008653
Rainin Classic Pipette PR-20	Rainin	17008650
Rainin Classic Pipette PR-200	Rainin	17008652
Scale	Sartorius	BL 150 S
Specimen forceps	VWR	82027-440 / 82027-442
Square 1000 mL Storage Bottle	Corning	431433
Styrofoam board	Any	n.a
Sure-Seal Mouse/Rat euthanasia chamber	Euthanex	EZ-178
Tryptic Soy Agar	Sigma-Aldrich	22091-2.5KG
VX-200 Lab Vortex Mixer	Labnet International	S0200
weigh paper	Fisherbrand	09-898-12B