التقنيات الإنجابية لرصد المبيض والسيطرة عليه في البرمائيات

Natalie  E. Calatayud; Norin Chai; Nicole  R. Gardner; Michelle  J. Curtis; Monica A. Stoops

doi:10.3791/58675

Summary

توفر دراسة البيولوجيا البرمائية معلومات قيمة عن العمليات الإنجابية والفسيولوجية والجنينية والتنموية التي تدفع الكائنات الحية في العديد من المجموعات التصنيفية. هنا، نقدم دليلا شاملا على المنهجيات المختلفة التي يمكن استخدامها لدراسة مراقبة المبيض والرصد في البرمائيات.

Abstract

تتطلب السيطرة على المبيض والرصد في البرمائيات نهجا متعدد الأوجه. هناك العديد من التطبيقات التي يمكن أن تحفز بنجاح السلوكيات الإنجابية والحصول على الجيمتس والأجنة للبحوث الفسيولوجية أو الجزيئية. وتسهم البرمائيات في ربع إلى ثلث البحوث الفقارية، ومن المهم في هذا السياق إسهامها في معرفة الأوساط العلمية بالعمليات الإنجابية والتطور الجنيني. ومع ذلك، فإن معظم هذه المعارف مستمدة من عدد صغير من الأنواع. وفي الآونة الأخيرة، تطلب تدمير البرمائيات في جميع أنحاء العالم تدخلا متزايدا من جانب القائمين على حفظ الطبيعة. فمستعمرات التعافي والضمان الأسيرة التي لا تزال تظهر استجابة لخطر الانقراض تجعل البحوث والتطبيقات السريرية القائمة لا تقدر بثمن لبقاء وتكاثر البرمائيات المحتجزة تحت الرعاية البشرية. ويستند نجاح أي مجموعة من الأسرى على صحتها وتكاثرها والقدرة على تطوير ذرية قابلة للحياة تحمل إلى الأمام التمثيل الجيني الأكثر تنوعا من أنواعها. بالنسبة للباحثين والأطباء البيطريين، فإن القدرة على رصد ومراقبة نمو المبيض والصحة أمر حتمي. يركز هذا المقال على تسليط الضوء على مختلف تقنيات الإنجاب المساعدة التي يمكن استخدامها لرصد، والسيطرة، حيثما كان ذلك مناسبا أو ضروريا، وظيفة المبيض في البرمائيات. ومن الناحية المثالية، ينبغي الحد من أي مسائل تتعلق بالإنجاب والصحة من خلال تربية الأسرى على النحو المناسب، ولكن، كما هو الحال مع أي حيواني، لا مفر من قضايا الصحة والأمراض الإنجابية. وتشمل التقنيات غير الغازية التقييمات السلوكية، والتفتيش البصري والجس والقياسات المورفولومترية لحساب مؤشرات حالة الجسم والموجات فوق الصوتية. وتشمل التقنيات الغازية الحقن الهرمونية، وأخذ عينات الدم، والجراحة. يمكن ممارسة السيطرة على المبيض في عدد من الطرق اعتمادا على التطبيق المطلوب والأنواع ذات الأهمية.

Introduction

وقد تم الاعتراف البرمائيات منذ فترة طويلة كنماذج بيولوجية وطبية هامة من قبل مجموعة واسعة من التخصصات البحثية. وقد تم تطبيق البيانات التي تم الحصول عليها من خلال دراسة أنواع معينة مثل Xenopus laevis وX. tropicalis، وضفدع ليوبارد (Lithobates (سابقا رنا) pipiens) وaxolotl (Ambystomamexicanum)إلى عدد من الأنواع الفقارية الأخرى، بما في ذلك البشر. توفر تقنيات الطب البيطري وتربية الأفراد والتقنيات الإنجابية المساعدة التي انبثقت عن دراسة هذه البرمائيات وغيرها من البرمائيات المساعدة لأولئك المكلفين بتطوير الرعاية الناجحة للسكان النادرين في الأسر وإعالتهم واستدامتهم ¹ ^, ² ^, ³ ^, ⁴.

ويكتسب الاهتمام بالاستخدام المتزامن للنُهج القائمة على الحفظ في الموقع وخارجه لعكس اتجاه موجة الانقراض بالنسبة للعديد من الأنواع البرمائية المعرضة للخطر¹^و2. توفر هذه المقالة المنهجيات المتاحة حاليا لرصد ومراقبة وظيفة المبيض البرمائي في الأنواع النموذجية من أنوران وCaudates. بالإضافة إلى ذلك، يتم عرض التقنيات القائمة لمعالجة الأمراض الإنجابية الشائعة للاحتفاظ بالبويضات.

كما هو الحال في العديد من المجموعات التصنيفية، ينطوي التحكم في المبيض البرمائي على سلسلة من التفاعلات المتزامنة بإحكام بين البيئة وعلم وظائف الأعضاء. يتم فك شفرة درجة الحرارة والفترة الضوئية (المعروفة باسم الإشارات القريبة) من قبل العين والدماغ حيث يتم تحويلها بسرعة إلى العمليات الوراثية والهرمونية وcircadian (إشارات في نهاية المطاف)³^،⁴. وتشمل أساليب رصد ومراقبة وظيفة المبيض المشمولة في هذه المقالة تقنيات الغازية وغير الغازية. اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) متطلبات البحث والتدريس تعريف التقنيات غير الغازية مثل تلك التي من شأنها أن تسبب الحد الأدنى من أي ألم بدني أو ضائقة عقلية ولا تتطلب أي أدوية تخفيف الألم⁵. هنا، وتشمل التقنيات غير الغازية الفحص البصري والجس، والملاحظات السلوكية، والتقييمات المورفولومترية والموجات فوق الصوتية. على العكس من ذلك، تصنف تقنيات جمع الدم، وإدارة الهرمونات والجراحة (استئصال المبيض وإزالة البيض المحتفظ به) على أنها الغازية لأنها قد تؤدي إلى بعض الألم أو عدم الراحة وتتطلب التخدير أو العلاج بالعقاقير بعد الإجراءات.

يمكن دمج تقنيات مراقبة المبيض غير الغازية بسهولة في روتين الرعاية اليومية لمعظم البرمائيات الأسيرة. اعتمادا على الأنواع، يمكن في كثير من الأحيان تحديد جاذبية المبيض عن طريق التفتيش البصري البسيط (الضفدع الزجاجي). في حالات أخرى، قد يشير الجس إلى ما إذا كانت الأنثى مناهية. مؤشرات حالة الجسم المختلفة (BCI) مثل الوزن، طول خطم urostyle (SUL)، طول تنفيس خطم (SVL) ومؤشر الكتلة القياسية (SMI) متاحة للتنبؤ بوجود أو غياب البيض⁴^،⁶^،⁷^، ^8،⁹. ومع ذلك، ينبغي توخي الحذر مع تفسير النتائج لأن معظم لا تنظر في العمر، شكل الجسم أو تكوين (على سبيل المثال، الماء الاحتفاظ مقابل كتلة المبيض أو الدهون)⁶. يمكن تحقيق التشخيصات الإنجابية النهائية عن طريق الموجات فوق الصوتية مع مزيد من المعرفة المتعمقة المكتسبة فيما يتعلق بتطوير البيض وتنظيم دورة المبيض⁴^،⁷. كما يوفر الموجات فوق الصوتية وسيلة لتأكيد ورصد الأمراض التناسلية والظروف الفسيولوجية المرتبطة^{بها 4}^،⁸.

بالإضافة إلى تقديم المعلومات المتعلقة بالحالة الصحية، يمكن استخدام عينات الدم لقياس الهرمونات الإنجابية. إذا كان التنميط هرمون هو الهدف النهائي, من المهم تجنب التأثيرات المتعلقة بالإجهاد التي قد تشوش بيانات الستيرويد النظامية. في حين أن أداة رصد قوية محتملة, لا يزال هناك دراسة تبين استجابات الغدد الصماء الفطرية لإدارة هرمون الخارجية في أي أنواع البرمائيات. يمكن أخذ الدم بأمان من عدة مواقع; في الضفادع وهذا يشمل الوريد البطني البطني، الضفيرةاللسانية، الوريد الفخذي والقلب 9،¹⁰. في Caudates، يتم جمع الدم من الوريد الذيل البطني. درجة التوغل، وكمية ضبط النفس المطلوبة، والحاجة إلى التخدير، وحساسية الجهاز المستهدف، وحجم الحيوان هي العوامل التي يجب أخذها في الاعتبار عند اختيار تقنية جمع للمريض البرمائي. سوف تقدم هذه المقالة تقنية جمع الدم من الفك العلوي للوجه أو الوريد العضلي الجلدي من الضفادع كما هو موضح في الأصل من قبل فورزان وآخرون⁹.

السيطرة على المبيض هو الأنواع الخاصة، وعلى هذا النحو، ينبغي اختبار بروتوكولات هرمون وتحسينها. بخلاف الموسمية وما يرتبط بها من بيئة هرمون تعميم, السيطرة المبيض قد تكون أيضا مرتبطة ارتباطا وثيقا إلى العمر, الوقت الذي يقضيه في الأسر والتعرض لإدارة هرمون المتكررة, التي لا توجد معلومات قليلة في الأدب¹¹ ^, ¹² ^, ^13.أصبح تنفيذ العلاجات الهرمونية للحصول على السلوكيات الإنجابية، وإنتاج الجاميت، والنضج وoviposition نهجا أبلغ على نطاق واسع لحل المشاكل الإنجابية الشائعة المرتبطة الأسر^4، ^8،^14،^15،^16. لأن آليات التحكم في التكاثر في الفقاريات يتم الحفاظ عليها بشكل كبير، وهناك عدد من الهرمونات، الببتيدات العصبية والأدوية المتاحة تجاريا المستخدمة علاجيا في المجموعات التصنيفية الأخرى التي يمكن أيضا أن تستخدم بشكل موثوق في عدد من الأنواع البرمائية(الجدول 1). Gonadotropin الإفراج عن هرمون (GnRH) وgonadotropin القرنية البشرية (hCG) (أو الاختلافات منها، أي PMSG وeCG)¹⁷^،¹⁸، إما بشكل فردي أو في تركيبة ، وقد استخدمت على نطاق واسع في البرمائيات الأسير برامج تربية بما في ذلك: جبل روكي الجنوبي بوريال(Anaxyrus boreas boreas)4,¹⁹^,²⁰; العلجوم, [دسكي] [غوفر] ضفدع, [رنا] [سفوسا] ([لنغهورن] [إت ل.], [أونبوبّد])⁷; ال [غلف كوست] [وتردوغ], [نكتوروس] [ويري]²⁰; وايومنغ العلجوم, Anaxyrus باكستري¹⁸; ال [بولّفروغ], [رنا] [كتّسبينا]²¹; العلجوم الأمريكي, Anaxyrus أمريكانوس²²; ضفدع العشب, [لمنوديستر] [تسمنينس]²³; [كوكي], [إلووثيرودلس] [كوكي]²⁴; [إكسنبوس], [إكسنبوس] [لفيس]²⁵; [غنثر] [لوادلت], [بسّدووبرين] [غينثري]²⁶; ال [ليوبارد] شماليّة ضفدع, [ليثوبيتس] [ببينس]; الأرجنتيني القرن الضفدع ، سيراتوفاريس المزخرفة ، و ضفدع كرانويل القرن ، C. كرانويلى ، و والضفدع الأرضي الأمريكي، أودونوسفيرينوس أمريكانوس²⁷؛ وسلامندر النار (سالاماندرا)²²⁸. هرمونات الستيرويد, مثل البروجسترون (P4), يتم الإبلاغ عنها أقل شيوعا ولكن أظهرت فعالية جيدة في الحصول على الإباضة وoviposition في بعض الأنواع من anurans¹⁶^,¹⁸^,²⁹. البروستاجلاندين (وخاصة البروستاجلاندين 2-ألفا (PGF_2α))تشارك في الإباضة جنبا إلى جنب مع الكورتيكوستيرويدات^30،^31،^32،³⁴ وتصل إلى مستويات عالية خلال المرحلة التمهيدية³¹.

في الدراسات المختبرية، PGF_2α هو محفز قوي للإباضة³¹، بينما في الجسم الحي يمكن أن تحفز oviposition من البيض المحتجز في رنا muscosa⁴^،³⁰^،³². مقتطفات الغدة النخامية هي أيضا محفزات فعالة من الإباضة¹⁵^,¹⁶^,³⁴; ومع ذلك، فإن المخاوف المحيطة بالأمن البيولوجي وإمكانية انتقال الأمراض غالبا ً ما تكون رادعاً لمستعمرات تربية الأسرى عند النظر في هذا النهج³⁵.

الجزء الأخير من هذه المقالة تفاصيل الإجراءات الجراحية ويوفر نهج بديلة لتوسيع دراسات المبيض أو المساعدة في حل الأمراض التناسلية. يتم إجراء استئصال المبيضات الأكثر شيوعا في البرمائيات للحصول على البويضات للبحوث الجنينية. ومع ذلك، فإنه يمكن أيضا أن توفر علاجا للبيض الاحتفاظ بها عندما تفشل خيارات أخرى. على الرغم من أن هذا الإجراء هو الغازية، والتي تتطلب التخدير الكامل والشقوق لفضح كتل البيض، فإنه لا يتطلب القتل الرحيم. وعلاوة على ذلك، بعد استئصال المبيض الجزئي، يمكن للالحيوانات جعل الشفاءالكامل والاستمرار في أن تكون نشطة الإنجابية بعد الجراحة 8،³⁶.

البروتوكولات المذكورة أدناه الخطوط العريضة للأساليب الغازية وغير الغازية لمراقبة المبيض والرصد في أنورانو وCaudates. وتشمل الأنواع المحددة التي تم اختيارها لتوضيح التقنيات في Anurans R. الغشاء المخاطي وX. laevis. Necturus maculosus, N. beyeri, N. alabamensis, و A. mexicanum تشمل الأنواع المستخدمة لوصف تقنيات مماثلة في Caudates.

Protocol

تمت الموافقة على إجراءات سالاماندر من قبل حديقة الحيوان سينسيناتي والحديقة النباتية (CZBG) اللجنة المؤسسية للرعاية والاستخدام (IACUC) بروتوكولات 11-106، 13-110، 14-133، و 15-138. تمت الموافقة على جميع إجراءات الضفدع والضفدع من قبل حديقة الحيوان سان دييغو العالمية (SDZG)، الرعاية المؤسسية والبروتوكولات لجنة الاستخدام (IACUC): 15-001، 16-005 و 18-003.

وافقت اللجنة الأخلاقية للمتحف الوطني للتاريخ الطبيعي (باريس) على رعاية الحيوانات ومعالجتها، وفقاً للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية (Commission de Génie Génétique, Direction Départementale des Services Vétérinaires, European Union Directive 2010/63/EU, agreement decision decision No. C75-05-01-2 للاتفاقية الأوروبية للالحيوانات الفقارية المستخدمة لأغراض تجريبية وغيرها من الأغراض العلمية. تمت الموافقة على جميع البروتوكولات المستخدمة في هذه الدراسة تحت الرقم المرجعي 68-037.

1. تقنيات مراقبة المبيض غير الغازية

الفحص البصري والجس
1. عقد Anuran الإناث في واحدة من الطرق الثلاث الموضحة أدناه.
  1. تأمين الساقين الضفدع أو الضفدع مع الحلقة والإصبع الصغير، ودعم الجانب الردور (البطن) من جسم الضفدع مع مؤشر والإصبع الأوسط والجانب البطني مع الإبهام (الشكل1A).
  2. عقد الضفدع أو الضفدع في اليد المهيمنة مع الإبهام على بطنه وبقية الأصابع تأمين الجزء الخلفي من الحيوان. باستخدام اليد غير المهيمنة لجس بطن الحيوان، ويشعر إذا كان هناك نتوء تحت الجلد (الشكل1B).
  3. وضع بطن الضفدع أو الضفدع على كف اليد، والذراعين الأماميين رايات على السبابة والإبهام على الجزء العلوي من ظهره.
2. بما أن الكوات مائية بالكامل في الطبيعة، قم بإجراء الفحص البصري بإحدى الطريقتين الموضحتين أدناه.
  1. نقل الحيوان إلى حاوية منفصلة 4 L تحتوي على مياه الخزان. عقد الحاوية (غطاء آمن) حتى وتألق مصباح يدوي على الجانب السفلي لتصور وجود / غياب البيض.
  2. التخدير في MS222 (0.5 غرام / لتر; ثلاثي الكينات ميثانسولفونات، المخزنة بـ 0.5 م ناهكو_3). بعد الحث، تدوير الحيوان على ظهره وفحص البطن.
التقييمات المورفولومترية
1. أنوران
  ملاحظة: التخدير غير مطلوب.
  1. باستخدام الفرجار، وقياس الحيوان من طرف الفم، على طول وسط الجسم إلى طرف الذيل للحصول على SUL وSVL (الشكل2A،B).
  2. تُشفى حاوية بلاستيكية على مقياس رقمي دقيق. وضع الحيوان في وعاء قطره وتزن (الشكل2C).
  3. للالحيوانات الكبيرة، مثل الضفادع، أو عند الحصول على الأوزان في الميدان، استخدم مقياس معلق (الشكل2D).
  4. كما هو الحال في العديد من الأنواع أنوران، تمييز R. muscosa الإناث الكبار من الذكورمن قبل حجمها أكبر وعدم وجود منصات الزواج (الإبهام) على اليدين (الشكل 3).
  5. حساب حالة الجسم، كتقييم أساسي للصحة العامة من خلال الصيغة التالية:
    مؤشر فولتون: K = كتلة - طول³
    ملاحظة: يستخدم مؤشر فولتون توازن الأبعاد من وحدة التخزين المتعلقة بالكتلة والطول حيث ³ هو أس التحجيم الذي يتعلق الكتلة والطول متساوي القياس.
2. الكاودات
  1. تُفرّع مع كيس فارغ قبل وضع الحيوان غير المُسِن ّداخله. الحرص على عدم إدخال المياه الزائدة (الشكل2D)والعمل بسرعة كما الحيوانات تفرز المخاط كاستجابة الإجهاد إلى يجري تقييدها.
  2. الحصول على تدابير الكبار عن طريق شل حركة الأفراد في وضع مستقيم في الجزء السفلي من كيس من البلاستيك إعادة ختم أو في حاوية بلاستيكية منفصلة التي يمكن أن تستوعب الفرجار الموسعة.
  3. قياس طول الجسم مع الفرجار (الشكل2E).
  4. قياس caudate من طرف الخطم إلى طرف الذيل (SVL) لرصد النمو.
الملاحظات السلوكية
1. مراقبة الحيوانات جسديا في الوقت الحقيقي أو استخدام كاميرا فيديو لتسجيل السلوك.
2. سجل ملاحظات الحيوانات تصنيف السلوكيات وبناء ethogram (الشكل4).
3. تصنيف السلوكيات الإنجابية
  ملاحظة: الشكل 4 يجسد نوع واحد من السلوك الإنجابي لوحظ في المناور.
الموجات فوق الصوتيه
ملاحظة: محول الموجات فوق الصوتية من الاختيار، في هذه الحالة، 7.5 ميغاهيرتز الخطية أو متعددة التردد (10-6 ميغاهيرتز) محدبة صغيرة، هو التوصية لNecturus و10 ميغاهيرتز التحقيق والمياه القابلة للذوبان، هلام خالية من الملح لR. muscosa. قد يتطلب إجراء الموجات فوق الصوتية على سلاماندرز التخدير (انظر القسم 1.5 للحصول على التعليمات).
1. أنوران
  1. إجراء الموجات فوق الصوتية على R. muscosa باستخدام شخصين (الشكل5A).
  2. الشخص الأول: عقد الحيوان مع اليد المهيمنة وتطبيق هلام قابل للذوبان في الماء والملح مجانا على بطن الحيوان.
  3. الشخص الثاني (فائق ة سونوغرافير): خذ مسبار 10 ميغاهيرتز في اليد المهيمنة وتطبيقه على البطن مع التأكد من إجراء اتصال جيد بين التحقيق وهلام.
  4. تنزلق إلى الداخل من أسفل حفرة الذراع نحو مركز خط الوسط البطني للحيواني لتصور المبيض بأكمله.
  5. فائقة سونوغرافير: استخدام اليد غير المهيمنة لتجميد الإطار والتقاط الصور المطلوبة على الموجات فوق الصوتية.
  6. تصنيف مرحلة دورة المبيض من قبل نظام الدرجات المنشأة للجنس⁴ (الجدول2، الشكل 5B-F).
  7. شطف أي هلام قبالة الحيوان في نهاية الإجراء.
2. الكاودات
  1. نقل Necturus غير التخدير إلى حاوية مستطيلة 4 L مليئة 2 لتر من مياه الخزان.
  2. تقليل حركة الحيوان عن طريق إطفاء أضواء الغرفة و / أو كوب يد واحدة على رأس الحيوان.
  3. ضع محول على مسافة 1-2 سم من جدار الجسم.
  4. حدد موقع القلب على مستوى خط الوسط البطني إلى الأطراف الأمامية ثم حركمحول الكظر بشكل غير مستتر وفحص أنسجة المبيض 7.
  5. تصنيف الإناث وفقا لنظام الدرجات التي أنشئت للجنس⁴ (الشكل6A،B،C).
  6. الحصول على مقاييس دقيقة من البيض في منتصف إلى مرحلة أواخر الجاذبية عن طريق التقاط الصور عندما يكون جسم الحيوان في زاوية إلى محول (أي، ليس الخطي، ولكن قوس طفيف. الشكل 6باء). خلاف ذلك، بصيلات متداخلة تجعل من الصعب التمييز بين حجم البيض الفردية.
الحث والتعافي من التخدير
1. أنوران
  1. التخدير في MS222 (0.5 غرام / لتر; ثلاثي الكينان الميثانسولفونات المخزنة (0.5 M NaHCO₃₎كما هو موضح سابقا.
  2. استخدام رد الفعل الصحيح كمؤشر أساسي للدرجة التي أصبح الحيوان التخدير. فقدان كامل من رد الفعل يدل على حالة من التخدير العميق.
  3. إزالة الحيوان من التخدير القائم على حمام الماء (MS-222) بمجرد فقدان رد الفعل الصحيح.
  4. ضع الحيوان على منشفة مبللة (مع مياه خالية من التخدير).
  5. تأكد من الحفاظ على الحيوانات رطبة خلال العملية الجراحية بأكملها.
  6. تنبيب البرمائيات الصغيرة مع القسطرة المطاطية الحمراء، أنابيب غير مكبلة أو أنابيب الرغامى الكلاسيكية المكبلة دون تضخيم الكفة.
  7. توفير تدفق منخفض من الأكسجين (0.5-0.75 لتر / دقيقة) مع 0.5-1٪ isoflurane.
  8. إيقاف isoflurane بعد الإجراء ولكن الحفاظ على تدفق الأكسجين لمدة 1 دقيقة.
  9. قم باستئصال الحيوان واشطف هالحيوان جيداً بالماء الخالي من الكلور ة التخدير لمدة دقيقتين.
  10. وضع الحيوان في كمية ضحلة من المياه غير المكلورة أو على منشفة مبللة.
  11. تقييم تعافي الحيوان عن طريق سحب بلطف على طرف خلفي إلى elongate. أي تقلص الاستجابة من الطرف يشير إلى رد فعل الانسحاب.
  12. رصد مؤشرات أخرى من الانتعاش مثل التنفس الزاوي (حركة الحلق) وردود الفعل الصحيح.
  13. النظر في البرمائيات تعافى عندما عادت جميع ردود الفعل، ومعدلات القلب والتنفس قد عادت إلى القيم ما قبل التخدير.
2. الكاودات
  1. التخدير Necturus وAmbystoma في MS222 (0.5 غرام / لتر من ميثانسولفونات Tricaine، المخزنة مع 0.5 M NaHCO₃، (MS222) في خزان مستطيل 4 L.
  2. ضع حجر الهواء (1 بوصة) ومضخة الهواء في الخزان وتشغيله إلى تدفق مستمر لتوفير الأوكسجين الكافي.
  3. عندما يتم فقدان وظيفة الطرف وانعكاس الحق، وإزالة الحيوان من التخدير القائم على حمام الماء (MS-222) ووضع الحيوان على الرطب (مع المياه الخالية من التخدير de-chlorinated).
  4. الحفاظ على رطوبة الجلد والخياشيم مع زجاجة ضغط من مياه الخزان.
  5. لاستعادة الحيوان، ضعه بعناية الجانب البطني أسفل في حاوية بلاستيكية 4 L مليئة 2 لتر من مياه الخزان مع حجر الهواء.
    ملاحظة: يبدأ الانتعاش مع وميض الخيشوم، تليها القدرة على تحريك ذيله ودفع إلى الأمام وأخيرا الحركة الوظيفية للأطراف.
  6. إعادة الحيوان إلى خزان الإسكان الأصلي ومراقبة عن كثب على مدى 24 ساعة المقبل.
    ملاحظة: طرق أخرى للتخدير للبرمائيات موجودة وهذه هي موضحة في رايت وويتكر⁸.

2. تقنيات مراقبة المبيض الغازية والسيطرة عليها

ملاحظة: تم تكييف هذا الإجراء من Forzán et al.¹⁰.

عقد الضفدع في اليد المهيمنة، والدب الجافة الجانب الوريد من وجه الضفدع مع مسح معقمة أو الشاش.
تجفيف الوجه لتجنب الدم من تفريق عبر الجلد أكثر من اللازم.
أدخل الإبرة (26 G 1/2"و 27 G 1/2")، مع شطبة تواجه صعودا، من خلال الجلد حيث الجلد مرتفعة حول العين وحافة الفك العلوي تلبية لتشكيل نقطة مثلث (مخطط أصفر) (الشكل7A)الوصول إلى الوجهين اعلى فينا المداريالخلفي.
ثقب الوريد الوجه تحت العين اليمنى وفوق حافة الفك العلوي، بدءا من 1-2 ملم مرة أخرى من خط الوسط للعين (الشكل7A).
ملاحظة: بالنسبة للضفادع الصغيرة (أقل من 20 جم)، حرك نقطة الإدراج أقرب إلى موضع أسفل خط الوسط للعين مباشرةً.
زاوية أنبوب microhematocrit إلى أسفل لتمكين الجاذبية للمساعدة في تدفق الدم إلى الأنبوب. يجب أن يتدفق الدم مباشرة بعد ثقب (الشكل7B،C).
في أول علامة على تدفق الدم، ضع طرف أنبوب microhematocrit في موقع ثقب وجمع 1-2 أنابيب microhematocrit كاملة من الدم ووضع أنابيب في أوعية مناسبة لجمع (الشكل7B،C).
إذا كان الدم لا يتدفق بسهولة، أو حجم منخفض جدا، وتحويل إدخال الإبرة قليلا أو إدراج الإبرة في الجانب الآخر من الوجه.
وقف النزيف عن طريق الضغط على الشاش بحزم إلى موقع ثقب لمدة 20 s على الأقل.
اترك الضفدع خارج الماء لمدة 10 دقائق لتأكيد عدم إعادة فتح موقع الثقب.
استخدام إبرة جديدة وأنابيب microhematocrit جديدة لكل ضفدع عينات.

3. الحث على الهرمونات

إعداد الهرمونات
1. إعداد حقن هرمون مباشرة قبل استخدامها لضمان أقصى قدر من التأثير.
2. حدد هرمونًا من التحديد المدرج في الجدول 1.
3. تحديد تركيز الهرمون ليتم حقنه باستخدام ميكرولتر أو مل / ز من وزن الجسم¹⁶.
4. تمييع الهرمون في أحد الإجراءات التالية: الماء، الفوسفات المخزنة المالحة (PBS)، محلول البرمائيات المالحة (السارس) أو المالحة.
5. لا تتجاوز حجم حقن 200 ميكرولتر للضفادع التي تزن 30-70 غرام و 300 ميكرولتر للضفادع التي تزن 80-110 غرام (المراقبة الشخصية)¹⁶.
6. للاحتفاظ الصحيح للحيواني أثناء إدارة هرمون أي الحيوان تتراوح بين 10-100 غرام، استخدم أي من الطرق المناسبة لعقد الموصوفة في القسم 1.1.
أنوران
1. حساب التركيز المطلوب لكل فرد باستخدام غرام لكل حساب وزن الجسم (ز / وزن الجسم).
2. قبل الإدارة مباشرة، إعادة تشكيل في تخفيف عقيمة من الاختيار.
3. تأكد من عدم ترك أي فقاعات في الحقنة قبل الحقنة.
4. عقد الحيوان بشكل آمن في اليد غير المهيمنة وإدارة الحقن مع اليد المهيمنة.
5. إدارة الحقن وفقا لمواصفات هرمون. الحقن الأكثر شيوعا في anurans هي تحت الجلد، داخل العضد أوداخل العضلات (الشكل 8).
6. إعطاء حقن IP في الجزء السفلي من البطن أو في الجزء السفلي من الجانب الظهري من الجسم بالقرب من الساق الخلفية (الشكل 9).
7. إدارة الحقن داخل العضلات ويفضل في الساقين الخلفيتين.
الكُوُتُدُنُس (نيكتوروس)
1. إعادة تشكيل هرمون الاختيار في الماء المعقم وفقا للغرام لكل طريقة وزن الجسم المذكورة أعلاه.
2. في حالة Necturus, استخدام جرعات من 1.7-2.3 ميكروغرام GnRH / ز وزن الجسم.
3. إزالة Necturus من غرفة التخدير ووضعها على سطح 45 درجة مغطاة الستائر الجراحية.
4. وضع الحيوان مع رئيس مشيرا إلى أسفل.
5. اقترب من الربع الخلفي من البطن (مُقدِّد الساق الخلفية) بزاوية 15-20 درجة. يجب الحرص على عدم إدخال الهواء في الحقنة.
6. حقن (IP) باستخدام حقنة الأنسولين وإبرة 27-30 G.
7. حقن الهرمون باستخدام حقنة الأنسولين وإبرة 27-30 G.

4. الجراحة

الإعداد والإجراء الجراحي العام
1. للحفاظ على إجراءات العقيم، استخدم الستائر البلاستيكية المعقمة واضحة لعزل الموقع الجراحي. تقليل التبخر عن طريق الحفاظ على البشرة المحيطة رطبة.
2. ترطيب أي مواد من شأنها أن تتصل جلد الحيوان بالماء المعقم. قم بعمل شق الجلد باستخدام شفرة مشرط رقم 15 أو رقم 11.
  ملاحظة: مزيج من الصلب البارد، الجراحة الإشعاعية أو ليزر الصمام الثنائي. يمكن تحقيق الهيموستاسي في إجراء نزفي خفيف عن طريق الكي الكهربائي أو ليزر الصمام الثنائي.
3. استخدم الرماح ذات الرؤوس القطنية أو التطبيقات للسماح بتطبيق الضغط الموضعي على الأوعية الصغيرة التي تتعقب فقدان الدم.
4. استخدم الرماح ذات الرؤوس القطنية أو التطبيقات لإدارة المساحات الضيقة الصغيرة بدلاً من مربعات الشاش القياسية.
5. استخدام الأدوات الدقيقة، مثل أجهزة طب العيون، مع نصائح غرامة وصغيرة، عند إجراء عملية جراحية على وزن الحيوانات أقل من 1 كجم.
6. استخدم المناضد البلاستيكية ذاتية الاحتفاظ (على سبيل المثال، مُسحب لون ستار) لتناسب أحجامًا مختلفة من الشقوق.
7. استخدم مُعيدي الجفن للسحب من الشقوق الcoelomic.
8. استخدام أجهزة التكبير عند الضرورة لإجراء عملية جراحية على المرضى الأصغر حجما.
  ملاحظة: مطلوب التسكين مع أي إجراء جراحي في البرمائيات. وقد ارتبط الفشل في إعطاء التسكين الكافي أثناء الجراحة مع تأخر عودة الوظائف العادية. وعلاوة على ذلك ، يقوي التسكين آثار الأدوية المخدرة (الجدول 3)³⁴.
أنوران
1. مرة واحدة X. laevis قد تم التخدير كما هو موضح في الخطوة 1.5.1، وضع الحيوان في recumbency الظهرية (الشكل10A،C).
2. إعداد المجال الجراحي عن طريق التعقيم عن طريق مسح الشاش المعقم الرطب مع تخفيف محلول البوفيدون اليود (1/10) على الموقع لمدة 10-15 ق أو 0.75٪ حل الكلورهيكسيدين على الموقع الجراحي لمدة 10 دقائق على الأقل قبل الجراحة^35.
3. قم بعمل شق جلدي متوسط مقاس 3 مم في منتصف الكولوم (بين الكتفين والكلواكا) بضربة واحدة جريئة تاركة شقًا نظيفًا باستخدام مشرط رقم 15 أو رقم 11.
  ملاحظة: يمكن للمرء استخدام ليزر الصمام الثنائي أيضا لشقوق الجلد.
4. رفع غشاء البطن، وجعل وشق وتشريح بعناية باستخدام مشرط رقم 15 أو رقم 11. (الشكل10B،D).
5. سحب الشقوق coelomic مع المنافيت الجفن (أو أي معدات مناسبة).
6. استئصال جزء من كتلة البيض دون ربط أي الأوعية الدموية.
7. لاستئصال المبيض الكامل، الكي الأوعية الدموية المحيطة عن طريق الكي الكهربائي أو صمام ثنائي الليزر (الشكل11).
8. باستخدام خياطة حيدة، أغلق شق استئصال الكلى مع نمط خياطة متقطعة ومتقطعة.
الكاودات
1. مرة واحدة A. وقد تم التخدير المكسيكية، ووضعها في recumbency الجانبي الأيمن، مع الطرف الحوض الأيسر وضعت ببساطة ضد قاعدة الذيل.
2. إعداد المجال الجراحي عن طريق التعقيم عن طريق وضع الشاش المعقم الرطب مع تخفيف محلول البوفيدون اليود (1:10) على الموقع لمدة 10-15 ق. بدلا من ذلك، استخدم الشاش المعقم غارقة في 0.75٪ حل الكلورهيكسيدين ووضعها في الموقع الجراحي لمدة 10 دقائق على الأقل قبل الجراحة (الشكل12A)³⁶^،³⁷ .
3. رسم خط بين الكتف والأطراف الخلفية لتقسيم الجسم إلى ثلاثة أجزاء متساوية (الشكل12B).
4. جعل موقع شق بين الجزأين الثاني والثالث.
5. فهم العضلات الكامنة ورفع بعيدا عن الحشوة coelomic.
6. بلطف قوة الهيموستات الصغيرة من خلال العضلات الcoelomic وإلى تجويف coelomic.
7. سحب الشقوق coelomic مع المناقفي الجفن (أو أي مادة مناسبة) (الشكل12C).
8. لاستئصال المبيض الكامل، الكي الأوعية الدموية المحيطة عن طريق الكي الكهربائي أو صمام ثنائي الليزر (الشكل12D).
9. باستخدام خياطة حيدة، أغلق شق استئصال الكلى مع نمط خياطة متقطعة ومتقطعة.

النتائج

المورفومتريات والاستنساخ

ويختلف تصور الحالة الإنجابية للإناث في البرمائيات حسب الأنواع. الطريقة الأكثر فعالية هي الموجات فوق الصوتية. ومع ذلك، قد تظهر بعض الأنواع درجات متفاوتة من الشفافية في بشرتهم (الشكل13A،B،C). يمكن للتفتيش البصري في كثير من الأحيان أن يوضح بوضوح الاختلافات بين الإناث الجاذبة وغير الجاذبة عندما يكون الجلد شبه شفاف كما لوحظ في N. alabamensis و N. maculosus (الشكل13A,B); أو شفافة كما يتضح من الضفدع الزجاجي (الشكل13C). تلوين الجلد رصدت الظلام على بطن N. beyeri يحظر هذا التقييم أن يتم. في R. muscosa، الجلد ليست شفافة ولكن يمكن الكشف عن اختلافات ملحوظة بين الإناث التي هي gravid بالمقارنة مع تلك التي قد oviposited مؤخرا لأن الجلد هو مترهل ، والحيوان يبدو أرق (خط أصفر) مقارنة مع الإناث التي هي gravid (الخط الأزرق) (الشكل13D). مع الخبرة المعالج يمكن التعرف على أنفسهم مع الفرق بين أنثى كبيرة وواحد gravid ولكن تأكيد المرحلة الجاذبية سوف تتطلب الموجات فوق الصوتية. يمكن حساب مؤشرات كتلة الجسم في البرمائيات باستخدام عدد من الصيغ ولكن تطبيقها كأداة تنبؤية للاستنساخ قابل للنقاش. في الحالة على [ر.]. [موسكوسا],يبقى علاقة بين [فولتون] فهرسة, صحة و [أنجاب ليست] حالة غير واضحة.

السلوك التناسلي والموجات فوق الصوتية

تظهر نتائجنا كيفية توصيف السلوكيات الإنجابية في R. muscosa للتنبؤ oviposition (الشكل4). عدة مراحل تستمر من بضع ساعات إلى عدة أسابيع تشمل، التودد حيث يقوم الذكور بمطاردة أنثى بنشاط (الشكل4A)،يتصاعد الذكور والمشابك بقوة على ظهر الأنثى، وتسمى amplexus (الشكل4B). مرة واحدة amplexed, الزوج يمكن أن تبقى في amplexus لمدة 1 - 5 أسابيع والزوج سوف تظهر السلوكيات الأخرى بالإضافة إلى amplexus. Amplexus هو سلوك نشط جدا يتضمن الذكور الضغط على الأنثى بطريقة ضخ لينة (الشكل 4C); الأنثى تتحرك والبدء في عرض السلوكيات اليد الوقوف بشكل متقطع (الشكل4D،E)؛ وأقرب إلى وقت oviposition، فإن الأنثى، في موقف اليد، تميل ضد الأسطح التي يمكن أن عصا البيض على حين أن الذكور مضخات بطنها بقوة (في هذه الحالة فمن الممكن أيضا أن نلاحظ أيضا فرك الإناث بطنها إلى أسفل من تحت حفر ذراعها نحو cloaca. قد يكون هذا وسيلة الميكانيكية التي لدفع البيض إلى أسفل oviducts) (الشكل4F،G).

توضح هذه الدراسة كيف يمكن للموجات فوق الصوتية توفير المعلومات التي يمكن من خلالها التأكد من الحالة الإنجابية في الإناث R. muscosa وNecturus. يتم تمثيل أربع مراحل من التنمية في R. muscosa (الشكل5C،D، E،F) وتتميز بالمثل في Necturus⁴ (الشكل6A،B، C). وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تفشل البيض المتبقية لطرد مما يؤدي إلى الاحتفاظ البيض (الشكل5G، الشكل 15A،B). تظهر المرحلة 1 المبيض مباشرة بعد oviposition حيث من الصعب تصور بصيلات (الشكل5C). يتم تمثيل المرحلة 2 من خلال ظهور النقاط صدى (البقع البيضاء) المنتشرة في جميع أنحاء المبيض (الشكل5D). يتم تمثيل المرحلتين 2 و3 بنقاط صدى أكبر ومستديرة مع مراكز مظلمة تمثل بصيلات متوسطة إلى كبيرة (الشكل5E,F). وفي الفترة من 2013 إلى 2017، تم فحص النكتورات الأنثوية الأسيرة عن طريق التصوير بالموجات فوق الصوتية على أساس شهري. وخلال كل امتحان، تم تعيين درجة تقدير للأفراد وفقاً للمعايير الإنجابية الموضوعة للجنس (الجدول2). وبلغ متوسط النسبة المئوية للإناث اللاتي يطورن بيضا جديدا كلسنة 88.2 ± 3.01 في المائة (الجدول 5). في حين كان تطوير البيض عالية، لم يتم ضمان oviposition (الشكل16). وقامت غالبية الإناث اللاتي خضعن لإيداع البيض بالكامل، في حين أن بعض الأفراد لم يودعوا سوى جزء صغير من البيض الذي تطور. تلك الإناث R. muscosa وNecturus مع البيض الاحتفاظ بها المصاحبة مع كسب السوائل في تجويف الجسم تم توسيع بصريا ظاهريا مع بقع حمراء على الجلد بما يتفق مع الأوعية الدموية انفجار (الشكل 14A، B ) . ويمكن إجراء مزيد من التقييم لدرجة احتباس السوائل عن طريق الموجات فوق الصوتية (الشكل15B). في كلا النوعين، خضع البيض المحتفظ به للتأَرَسَيْسِاأو أخذ مظهرًا أكثر صدىً (الشكل14C،D، الشكل 15A).

إدارة الهرمونات

اعتمادا على عمق نوع الحقن زاوية وعمق الإبرة سوف تختلف. بالنسبة لمعظم الحقن عمق الإبرة لا تحتاج إلى أن تكون أكثر من 1-2 مم عميق عند العمل مع الأنواع مثل R. muscosa ولكن سوف تختلف في زاوية الاختراق. حقن البروستاجلاندين تتطلب داخل العضلات (ايم) إبرة الإدراج الزاوية في 90 درجة، في الساق الخلفية من R. muscosa في حين أن الحقن داخل السوق النحوي (الملكية الفكرية)، مع عمق مماثل للحقن داخل العضلات، تدار في منطقة تجويف coelomic في 45 درجة (الشكل10). لم يكن لإدارة أمفيليكس أي تأثير كبير في زيادة عدد البيض المودع من قبل الإناث المعالجة بالهرمونات مقارنة بالضوابط (P = 0.547)، كما لم تكن هناك أي اختلافات في عدد الأجنة التي تتقص (P = 0.673) أو بقيت على قيد الحياة إلى تادبول (P = = P = 0.629)(الجدول4). وبوجه عام، انخفضت النسبة المئوية للإناث اللاتي ينعنن من الإناث في عام 2011 إلى 28 في المائة في عام 2014. وكان عدد الإناث في عام 2015 أعلى بكثير من عام 2013 (P = 0.0002)، 2013 (P = 0.0001) و 2014 (P = 0.0026) ولكن ليس 2011 (P = 0.0885)، مما يؤكد من جديد فكرة أن الإناث من هذا النوع قد لا تولد سنويا وأن البروتوكولات الهرمونية تتطلب refi لا ، لا ، لا ، لا ، لا ، لا بالنسبة للإناث R. muscosa مع علامات الاحتفاظ بالبيض، والحقن داخل العضلات من PGF_2α كان معدل نجاح 60٪ في تحفيز طرد البيض المتحلل. ومع ذلك، في واحدة من الإناث 5 حقن، PGF_2αلم يكن كافيا للتسبب في طرد كامل وبقيت بعض البيض داخل الأنثى حتى موسم التكاثر التالي. تلقت 17 أنثى Necturus LHRH / (GnRH) و 13 تلقى حقنة وهمية من المياه المعقمة لتكون بمثابة عنصر تحكم (الجدول 5). في المجموع، ذهبت سبع إناث Necturus (ن = 4 المرمر، ن = 2 beyeri، ن = 1 maculosus)إلى oviposit 11 براثن كاملة التي نسبت إلى كل من GnRH تعامل (ن = 6) والسيطرة (ن = 5) الأفراد. ثلاث إناث (ن = 2 بايري، ن = 1 maculosus) oviposited خمسة براثن جزئية (الشكل 13). ولا يبدو أن هذه الظاهرة مرتبطة بالعلاج بالهرمونات الخارجية حيث أنثلاث إناث متحكمات في الصدمات المعوَّلة بالمثل (الجدول 5). حدث أوفيبوسعلى مدى 37 يوما (3/31-5/7) الإطارالزمني على مدى خمس سنوات (الجدول 5). لم يكن هناك فرق (P = 0.194) في معدلات oviposition بين LHRH/GnRH المعالجة (41 ± 13.08٪، والنطاق 17-67٪) والسيطرة (66.75 ± 11.79٪، ومجموعة 50-100٪) الاناث. LHRH /GnRH معالجة الإناث المودعة البيض في المتوسط 7.44 ± 1.41 (نطاق 3-13) أيام بعد الحقن. وبالنظر إلى الطبيعة المائية الكاملة للأنواع وعدم القدرة على كبح جماح هائجا ً يدوياً دون تخدير، كان من الضروري ضمان مستوى مناسب من التخدير قبل إجراء حقن هرمون الملكية الفكرية (انظر القسم 3-2 للاطلاع على تعليمات بشأن التخدير).

جمع الدم والتخدير والجراحة

تم أخذ تقنية أخذ عينات الدم في هذه المقالة من فورزان وآخرون 2013¹⁰ وأثبتت أنها وسيلة فعالة لجمع الدم من R. muscosa مع الحد الأدنى من الغازية والإجهاد. باستخدام أنابيب microhematocrit، يمكن جمع ما يقرب من 35-45μl من البلازماأو المصل في 70 ميكرولتر من الدم كله (الشكل 7). وكان الحد الأقصى لحجم جمع في R. muscosa 1 أنبوب microhematocrit كامل لكل 10 غرام من الضفدع، وتصل إلى 4 أنابيب لكل ضفدع للضفادع 40 غرام وأكبر. وكان هذا حجم جمع المحافظ من 0.7 مل لكل 100 غرام، 70٪ من التوصية القصوى من 1.0 مل لكل 100 غرام (تكييفها من Allender وفراي، 2008)¹³.

نادرا ما يتم الإبلاغ عن التخدير والجراحة في البرمائيات ولكن من المهم أن نلاحظ أن الجرعات والفعالية سوف تختلف بطريقة خاصة بالأنواع. في Bombina orientalis على سبيل المثال، MS222 له تأثير منخفض جدا، حتى مع جرعات عالية (1 غرام / لتر) في حين في الضفادع بوريال، Anaxyrus بوريس بوريس، 1 غرام / لتر سريع (مسألة دقائق) وطويلة الأمد (3 + ح) (Calatayud، المراقبة الشخصية). في R. muscosa, التخدير يتطلب جرعات المبلغ عنها لA. بورياس بورياس ولها تأثير مماثل وأوقات الانتعاش. البرمائيات الصيام قبل التخدير لا يكون مطلوبا عادة كما الحنجرة لا تزال مغلقة بإحكام حتى تحت التخدير العام. ومع ذلك، إذا لزم الأمر، وخاصة إذا كان إجراء التخدير أن تشمل الجراحة الكلوية، يمكن أن تكون الحيوانات صائمة 24 ساعة قبل التخدير.

أثناء الجراحة، رد الفعل الصحيح هو المؤشر الرئيسي على أن الحيوان قد أصبح التخدير. رد الفعل الصحيح هو القدرة ودرجة السهولة التي يمكن للحيواني العودة إلى وضع مستقيم بعد وضعه على ظهره. فقدان رد الفعل يشير إلى مرحلة خفيفة من التخدير. يشار إلى الطائرة الجراحية بفقدان رد فعل الانسحاب الذي يتضمن سحب طفيفة على الطرف لتصويبه والحيوان لم يعد قادرا على التراجع عنه⁷. الجراحة الإنجابية ليس لديها عقبات ساحقة والمرضى البرمائيات في الغالب شفاء جيدا التغاضي عن فقدان الدم أكثر من الفقاريات أعلى. يجب أن تستمر الجراحة بسرعة، وتستمر حوالي 15 دقيقة من البداية إلى النهاية. يجب تحديد الوقت الزمني للخطوات تقريبًا على النحو التالي: <1 دقيقة للشق الأولي و<2 دقيقة لاستئصال الكلى وإدراج الجرار، < 2-3 دقائق للعزل لكل مبيض و<1 دقيقة لخياطة الأوعية أو الكي وخياطة الجلد < 4 دقائق. مجموع وقت الانتعاش بعد الجراحة مع بروتوكولات MS222 هي حوالي 45 دقيقة ولكن هذا يمكن أن يكون نوع معين. في A. boreas boreas و R. muscosa يمكن أن تكون أوقات الانتعاش أطول, تصل إلى 1 - 2 ح. عند إجراء الجراحة، يجب توخي الحذر لتجنب ثقب الرئتين، الجهاز الهضمي أو المثانة المنتفرة، وعدم تلف الغدد العيانية، والقلوب الليمفاوية، والأوعية الدموية، وخاصة الوريد منتصف البطيني. اعتمادا على الموسم ، فإن وجود أجسام كبيرة من الدهون يمكن أن يجعل التصور من الأجهزة الأخرى صعبة. مرة واحدة مستيقظا بشكل واضح، وتصنف استجابات الحيوان لتحفيز الأطراف، مثل مقاومة لتمتد لطيف من طرف الظهر أو وامض عندما يتم تحفيز المنطقة المحيطة بالعين (المراقبة الشخصية)، كردود الانسحاب. رد الفعل الصحيح جنبا إلى جنب مع مؤشرات الانتعاش الأخرى بما في ذلك, ردود الفعل الانسحاب والحركات gular, هي مؤشرات هامة للانتعاش.

					الاداره
الاسم الشائع	الانواع	هرمون	الاجراء	مركب فتيلة	تم الإبلاغ عن جرعة فتيلة	عدد جرعات فتيلة	التوقيت (hr قبل الجرعة الإباضية)	مركب (مركب) يُدار للإباضة النهائية/الأوفيبوس	جرعات	مرجع
البورتوريكي ة	بيلتوبلين ليمور	GnRH & hCG	Ip	فى الانجليزية	1.5 وحدة جوية/ز	2	hCG - 48	GnRH; hCG؛ غنها + hCG	0.2 ميكروغرام؛ 4 وحدة من الوحدة الدولية؛ 0.5 ميكروغرام + 4 وحدة جوية	كالاتايود وآخرون غير منشورين
ضفدع جبل أصفر الساقين	رنا موسكوسا	أمفيليكس، لوت	Ip	GnRHa (des-Gly10, D-Ala6, Pro-NHEt9-GnRH)	0.4 ميكروغرام/غرام	1	24	GnRH + MET	1 × 0.4 ميكروغرام / ز + 10 ميكروغرام / غرام	كالاتايود وآخرون, 2018
	رنا موسكوسا	PGF₂α	الدردشه	PGF2α	5 نانوغرام/غرام	1	48	PGF2α	5 نانوغرام/غرام	كالاتايود وآخرون, 2018
جنوب روكي جبل العلجوم الشمالية	أناكسيروس بورياس بورياس	hCG, GnRH	Ip	فى الانجليزية	3.7 وحدة جوية/ز	2	96، 24	hCG + GnRHa	13.5 وحدة جوية / ز + 0.4 ميكروغرام / ز	كالاتايود وآخرون، 2015
شمال الكريكيت الضفدع	أكريس كريبتان	أمفيليكس	إضافة إلى الماء (10 مل)	اي	اي	صفر	Na	GnRH + MET	0.17 ميكروغرام + 0.42 ميكروغرام / ميكرولتر	سنايدر وآخرون، 2012
ضفدع النمر الشمالي	ليثوبات سبين	أمفيليكس	Ip	اي	اي	صفر	24	GnRH + MET	1 × 0.4 ميكروغرام / ز + 10 ميكروغرام / غرام	Trudeau et al., 2010
الضفدع الأرجنتيني القرن	سيراتورفيرس أورناتا	أمفيليكس	Ip	اي	اي	صفر	24	GnRH + MET	1 × 0.4 ميكروغرام / ز + 10 ميكروغرام / غرام
ضفدع كرانويل ذو القرن	سيراتوفاريس كرانويلي	أمفيليكس	Ip	اي	اي	صفر	24	GnRH + MET	1 × 0.4 ميكروغرام / ز + 10 ميكروغرام / غرام
الضفدع الأرضي الأمريكي	Odontophrynus americanus	أمفيليكس	Ip	اي	اي	صفر	24	GnRH + MET	1 × 0.4 ميكروغرام / ز + 10 ميكروغرام / غرام
ضفدع غوفير داكن	رانا سيفوسا	hCG, GnRH	Ip	فى الانجليزية	3.7 وحدة جوية/ز	2	96، 24	GnRH + hCG	1 × 0.4 ميكروغرام / ز + 13.5 وحدة جوية / ز	غراهام وآخرون, 2018
كوكي المشتركة	إليوثيروباكتيلوس كوكي	الأسماك والطيور والثدييات وGnRH (D-Ala, des-Gly, eth LHRH), hCG	Sc	mLHRH ؛ ALHR; fLHRH; GnRHa; فى الانجليزية	اي	صفر	Na	mLHRH ؛ ALHR; fLHRH; GnRHa; فى الانجليزية	7 μg, 33μg; 28 ميكروغرام؛ 7 μg، 20μg؛ 5، 10، 15، 20 ميكروغرام؛ 165 وحدة من وحدة الأمم المتحدة	مايكل وآخرون 2004
العلجوم غونتر	بسودوبرين غينثري	في هذا الـ4.		محمد الني	0.4 ميكروغرام/غرام	1	26	GnRHa مع أو بدون رئيس الوزراء	0.4 ميكروغرام/غرام	سيلا 2010
كوروبوبري الضفدع	بسودوبرين كوروبوري	لوسيرين	Sc	لوسيرين	1 ميكروغرام	1	26	لوسيرين	5 ميكروغرام	بيرن & سيلا, 2010
ضفدع كوروبري الشمالي	بسودوبرين بينجيلي	GnRHa GnRH (D-Ala, des-Gly, eth LHRH)	تا	اي	اي	صفر	Na	محمد الني	0.5 -2.0 ميكروغرام/غرام	سيلا وآخرون، 2017
ساحل الخليج المائية	Necturus beyeri	[des-Gly10, D- Ala6]-LhRH-RH إيثيل أميد خلات ملح هيدرات	Ip	اي	اي	صفر	Na	LHRH	100 ميكروغرام / 500 درجة مئوية	ستوبس وآخرون، 2014
ضفدع الجرس الجنوبي / الهدير الضفدع العشب	ليتوريا رانيفورميس	des-Gly10, D-Ala6-[LHRH]	Sc	اي	اي	صفر	Na	des-Gly10, D-Ala6-[LHRH]	50 ميكروغرام	مان وآخرون، 2010
العلجوم فاولر	أناكسيروس فاولر	GnRH, hCG, P4	Ip	فى الانجليزية	3.7 وحدة جوية/ز					Browne et al., 2006
أكسولوتل (سالاماندر مكسيكي)	أمبيستوما مكسيكانيوم	هرمونات محفزة للبصيلات	الدردشه	اي	اي	صفر	Na	Fsh	400 وحدة غير طيار	[تروتّر] و [أرمسترونغ], 1974
ضفدع الأفريقية	Xenopus laevis	hCG & P4	وأضاف المياه؛ Ip	PMSG, hCG						مارسيك , 2016
نمر [سمندر]	أمبيستوما تيغرينوم	hCG, LH
وايومنغ العلجوم	أناكسيروس باكستري	hCG, GnRHa, P4	Ip	hCG + GnRHa	100 وحدة جوية + 0.8 ميكروغرام	1	72	hCG + GnRHa	100 وحدة جوية + 0.8 ميكروغرام	Browne et al., 2006
ضفدع النمر الشمالي	ليثوبات سبين	استخراج الغدة النخامية (PE), P4, التستوستيرون (T), الكورتيكوستيوستيرون [C], أمفيبليكس, دومبيريدون (D)	SC, IP	اي	اي	صفر	Na	PE، PE + T، PE + P4، PE + C؛ أمفيليكس، GnRH + D	~ 100 وحدة IU (LHRH) في 1 مل؛ PE + 0.002μg / ميكرولتر؛ PE + 0.01mg/50mL؛ PE + 0.1mg/50mL؛ 0.4 ميكروغرام/غرام + 10 ميكروغرام/غرام؛ 0.4 ميكروغرام/غرام + D	رايت, 1961; حصن, 2000; ترودو وآخرون، 2013
ضفدع الأرض	Lymnodynastes tasmeniensis	مقتطفات الغدة النخامية، hCG، GnRHa، PZ	Ip	محمد الني	0.9-1.2 ميكروغرام/غرام + PZ 10 ميكروغرام/غرام	1	20	PE; PE + hCG؛ GnRH + PZ	PE المجلد; PE المجلد + 100 وحدة IU hCG؛ GnRH (0.9-1.2μg/g) + PZ (10μg/g)	كلوو وآخرون, 2018
الضفدع الأخضر والذهبي بيل	ليتويا أوريا	في هذا الـ4.	Ip	محمد الني	10 ميكروغرام	1	72	غنها + hCG	20 ميكروغرام + 300 وحدة جوية	كلوو وآخرون, 2018
الضفدع الممنوع العظيم	اللفافات الميكسوفية	hCG & PMSG	Sc	PMSG, hCG	50 وحدة IU و 25 وحدة من الوحدة الدولية؛ 1x100 وحدة من الوحدة الدولية	2؛ 2	PMSG-144 و 96; hCG-24	فى الانجليزية	100 وحدة غير طيار	كلوو وآخرون، 2012
رأيت ل كثير هرمون بروتوكولات وأنواع [وريغت] و [وهيتكر], 2001

الجدول 1: الأنواع البرمائية وبعض الهرمونات الخارجية التي تم اختبارها عليها على النحو المبلغ عنه في المؤلفات. الغدد التناسلية الشناهية البشرية (hCG); غونادوتروبين الإفراج عن هرمون (GnRH); هرمون الإفراج عن هرمون التأنيب (LHRH); الحروف م، أ و و تمثل 'الثدييات'، 'الطيور' و 'الأسماك'؛ الحوامل فرس المصل غونادوتروبين (PMSG)؛ البروجسترون (P4)؛ هرمون تحفيز الجريب FSH)؛ استخراج الغدة النخامية (PE)؛ التستوستيرون (T); كورتيكوستيستيرون (C). وتشمل مضادات الدوبامين المدرجة: دومبيرون (D); بيموزيد (P)؛ ميتوكلوبراميد (MET). Amphiplex هو اسم يعطى لمجمع تتكون من GnRH وMetoclopramide27. Lucrin هو ناهض GnRH المتاحة تجاريا مع العنصر النشط يجري خلات Leuprorelin. ⁴ ^, ⁷ ^, ^{17 سنة} ^, ^{18 سنة} ^, ^{19 سنة} ^, ²⁰ ^, ²⁶ ^, ²⁷ ^, ³⁸ ^, ³⁹ ^, ⁴⁰ ^, ⁴¹ ^, ⁴² ^, ⁴³ ^, ⁴⁴ ^, ⁴⁵

الصف	الحالة الإنجابية	وصف
صفر	غير الجاذب	لا بيض مرئي.
1	الجاذبية المبكرة	البيض مرئية (1-2mm في الحجم) أي خط echogenic متميزة المرتبطة البيض.
2	منتصف الجاذبية	البيض 2-3mm في الحجم، خط (خطوط) echogenic متميزة المرتبطة بكل بيضة.
3	[غرفيد] متأخّرة	البيض 4-5mm في الحجم، وخطوط echogenic لا تزال مرئية، وزيادة ملحوظة في مظهر الصدى من البيض.
4	البيض المحتفظ به	درجات متفاوتة من المواد echogenic الموجودة في بنية البيض الداخلية، تأخذ على شكل غير متبلور. قد يصبح بعض echogenic جدا والمرتبطة احتباس السوائل في تجويف الجسم.

الجدول 2: نظام الدرجات المستخدم لتسجيل الحالة الإنجابية للأنثى الأسيرة Necturus و رنا موسكوسا عن طريق التصوير بالموجات فوق الصوتية.

المخدرات	الجرعة والطريق	التعليقات - المرجع
بوبرينوروفين	50 مغ/كغ (إينتريسلوميك)	دراسة تجريبية في نيوت أحمر رصدت الشرقية(Notophthalmus viridescens). يجب إعطاء التسكين قبل الجراحة. (كولر، 2009)
بوتيتول	1 – 10 ملغ / كغ (IM أو intracelomic)	هناك العديد من التوصيات المحددة. ينصح أن تبدأ في 1 ملغ /كغ.
بوتيتول	0.5 ملغ / لتر (حمام)	دراسة تجريبية في نيوت أحمر رصدت الشرقية(Notophthalmus viridescens). (كولر، 2009)
الفنتانيل	1 مغ/كغ	التسكين > 4 ح, معادية من قبل naltrexone (ستيفنز, 1997)
ميلوكسيكام	0.1 إلى 0.2 ملغم/كغم (IM)	(منتر، 2011)

الجدول 3: بروتوكولات التسكين في البرمائيات.

	*رنا موسكوسا*
العام	عام 2014	عام 2015
لا ♀	18 سنة	18 سنة
تطوير البيض	61 في المائة	94 في المائة
♀ التحكم	4	6
♀ أمفيليكس	4	7
متوسط اليوم بعد أمفيبليكس إلى أوفيبوزيت	10.5	10.9
معدل الأوفيأوفيليس (أمفيليكس)	22.20 في المائة	33.33 في المائة
معدل Oviposition (التحكم)	22.20 في المائة	38.88 في المائة

الجدول 4: مقارنة بين البارامترات الإنجابية بين معاملة أمفيلإكس مقارنة بمراقبة الإناث الأسيرات رنا موسكوسا في عامي 2014 و 2015.

*نيكتوروس* sp.
العام	1	2	3	4	5
لا ♀	6*	7	7*	7*	7*
تطوير البيض	83 في المائة	100 في المائة	86 في المائة	86 في المائة	86 في المائة
♀ LHRH	3	5	3	6	صفر
♀ التحكم	2	2	3	صفر	6
يوم ما بعد LHRH إلى أوفيبوزيت	5	7	5.5 (نطاق 3 - 8)	13	غير مأـر/أ
سعر الأوفيسول (LHRH)	60 في المائة	20 في المائة	67 في المائة	17 في المائة	غير مأـر/أ
معدل Oviposition (التحكم)	50 في المائة	50 في المائة	100 في المائة	غير مأـر/أ	67 في المائة
* ن = 1 ♀ لا تطوير البيض

الجدول 5: مقارنة البارامترات الإنجابية بين الـ LHRH (NRH) - المعالجة والتحكم (ماءمعقم) الأسير الإناث نيكتوروس من ثلاثة أنواع على مدى فترة 5 سنوات من الزمن (2012-2017).

figure-results-25795
الشكل 1: ثلاث طرق لعقد ضفدع. (أ) الإجراء 1. (ب) الإجراء 2. (ج) الإجراء 3. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-26221
الشكل 2: التقييمات المورفومترية. (ألف،باء) SVL /SUL(C,D). الوزن، في R. muscosa وD. Necturus. (E). قياس الحجم مع الفرجار. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-26712
الشكل 3: يتميز التشوه الجنسي بمنصات الإبهام الزواجية على الذكور البالغين R. muscosa مقارنة بالإناث. (أ) أنثى (ب) ذكر. اللوحة السفلى يظهر طول الذكور مقابل الإناث. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-27252
الشكل 4: توصيف السلوكيات الإنجابية المؤدية إلى وضع أوفيأوفيس في ر. موسكوسا (أ) التودد. (ب) أمبيرلكزس. (ج) ذكر الضغط الإناث أثناء وجوده في amplexus. (د، هـ) أنثى مبتورة في موقف اليد. (واو،ز) تقلصات البطن وأوفيبوس. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-27865
الشكل 5: الموجات فوق الصوتية التي أجريت على R. muscosa A-B مع حالة الإنجاب وفقا للمرحلة التنموية^4. (A،B) إجراء الموجات فوق الصوتية على رنا muscosa. (C) الصف 0. (د) الصف الأول. (هـ)الصف الثاني. (F) الصف الثالث. (ز) الصف 4 (البيض المعبأ والاحتفاظ بها) الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-28560
الشكل 6: صور بالموجات فوق الصوتية من Necturus. (أ) الصف الأول. (ب) الصف الثاني. (C) البيض الصف 3. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-29020
الشكل 7: جمع الدم في ر. موسكوسا. (أ) جمع الدم عن طريق ثقب الوريد المداري الخلفي الوريد والوريد الوجه الوريد فقط فوق خط الفك في منتصف المدار. (باء،جيم) يتم تحرير الدم على سطح الجلد ويتم جمعه مع أنبوب الشعرية المعبأ. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-29570
الشكل 8: طرق الحقن في البرمائيات. اعتمادا على عمق نوع الحقن زاوية وعمق الإبرة سوف تختلف. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-29960
الشكل 9: الحقن الهرموني في ر. موسكوسا. تحريض oviposition عن طريق العلاج الهرموني في الإناث رنا muscosa حقن مع amphiplex داخل التجبية. يمكن العثور على المبيضين في تجويف coelomic الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-30446
الشكل 10: التحضير قبل الجراحة. (أ) إعداد مطهر للمنطقة الجراحية باستخدام تخفيف محلول اليود البوفيدون (1/10)، Trachycephalus resinifictrix. (ب) شق مشرط نظيفة في laevis Xenopus أو، (C) ليزر صمام ثنائي شق الجلد، Lithobates catesbeianus. (د) تجنب الإضرار الوريد منتصف البطين، Trachycephalus resinifictrix. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-31156
الشكل 11: استئصال المبيض في Xenopus laevis. (أ) فضح ونقل الهيئات الدهون الكبيرة للكشف عن كتلة البيض. (ب) مكوس جزء من كتلة البيض دون ربط أي الأوعية الدموية. (C) الكي الأوعية الدموية المحيطة عن طريق الكي الكهربائي لاستئصال المبيض الكامل. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-31747
الشكل 12: التحضير قبل الجراحة واستئصال المبيض في A. mexicanum. (أ) شاش معقم غارقة في، 0.75٪ الكلورهيكسيدين الحل المطبق على الموقع الجراحي(B). يقسم الخط بين الكتف والأطراف الخلفية الحيوان إلى ثلاثة أجزاء متساوية وعلامة البقعة الزرقاء على الموقع على شق. (ج) سحب الشقوق coelomic مع المنافيت الجفن. (د) لاستئصال المبيض الكامل، الكي الأوعية الدموية المحيطة عن طريق الكي الكهربائي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-32505
الشكل 13: التقييم البصري للمراحل الإنجابية. (ألف،باء) التقييمات البصرية للمرحلة الإنجابية من خلال الجلد شبه شفافة، Necturus. (ج) الجلد الشفاف، Hyalinobatrachium (الضفدع الزجاجي). (D) التقييم البصري لR. muscosa قبل (يمين، خط أزرق) وبعد oviposition (اليسار - الخط الأصفر). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-33158
الشكل 14: احتباس البيض. (ألف،باء) أنثى رنا muscosa مع حالة شديدة من الاحتفاظ بالبيض. (C) الموجات فوق الصوتية يظهر الانحطاط القديم والبيض (أعلى) والبيض أكبر (لوحة الأوسط والسفلي) البويضة والمحاصرين في coelom. (D) البيض الاحتفاظ بها استردادها عن طريق تجريد اليدوي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-33785
الشكل 15: صور بالموجات فوق الصوتية من البيض المحتفظ به في Necturus أن (أ) أصبح echogenic في المظهر (دائرة) وارتبطت مع (B) احتباس السوائل في تجويف الجسم (السهم). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-34294
الشكل 16: النسبة المئوية للأنثى الأسيرة Necturus التي أوفيبوزيت براثن كاملة أو جزئية (2013-2017) مقارنة مع تلك التي لم oviposit. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

وتوفر المناولة المباشرة والمراقبة البصرية والتدابير المورفومترية تقنيات غير غازية وهي أول معايير تقييم لتحديد المرحلة الإنجابية للإناث. ومع ذلك، تظهر هذه الدراسة أن المبيضين الجاذبين لا يمكن دائما أن يتم التعرف عليها بشكل موثوق عن طريق الجس. اعتمادا على الأنواع، يمكن في بعض الأحيان الكشف عن المبيضين الجاذبية بصريا من خلال شبه شفافة (الشكل13A،B) أو الجلد شفافة تماما على الجانب البطني من الحيوان (الشكل13C). الإناث التي أكملت oviposition يمكن أن تظهر تغييرات واضحة على مظهرها بالمقارنة مع الإناث gravid (على سبيل المثال، الجلد فضفاضوفقدان ما يصل إلى 30٪ من كتلة الجسم، الشكل 13D). أثناء التكاثر، سيعرض الذكور والإناث بعض السلوكيات التي توفر معلومات حول القرب من الإباضة وأوفيست. في حالة R. muscosa مؤشرات على أن أنثى قريبة من oviposition تبدأ مع دخول الإناث handstands.

تطبيق تكنولوجيا الموجات فوق الصوتية على Anurans وCaudates يسمح بتشخيص وجود أو غياب البيض وما إذا كان يرتبط oviposition مع الإفراج الكامل أو الجزئي من البيض المتقدمة. وهكذا، توفر هذه الطريقة تقييمًا أكثر اكتمالًا ودقة للحالة الإنجابية دون أن تقتصر على تحديد حالة الجاذبية/غير الجاذبة من خلال تقنية التصور التي تختلف باختلاف البشرة في البطن، أو اتساق البشرة بين الأنواع البرمائية المختلفة. يمكن إجراء الموجات فوق الصوتية بسهولة نسبية ومع القليل من الإجهاد على الحيوانات (الشكل5 والشكل 13)ويمكن استخدامها لتوصيف الدورات الإنجابية وتحديد الحالة الإنجابية^4. ومن الأهمية بمكان أن تصبح على دراية بالأنواع؛ ومع ذلك، أظهرت هذه الدراسة أن Necturus و R. muscosa تشترك في علامات النمو المشتركة في أنماطالإنجاب مما يسمح لتصنيف مماثل للمرحلة الإنجابية (الشكل5). من خلال هذه التكنولوجيا هناك الآن أدلة على أن تطوير البيض عالية في النكتورو الأسير وR. muscosa وأن كلا النوعين تتبع نمط موسمي. على الرغم من أن أسباب هذه الظواهر غير معروفة وتتطلب المزيد من التحقيق، دون استخدام الموجات فوق الصوتية، فإن العديد من مجالات خلل المبيض، مثل الاحتفاظ بالبيض وoviposition الجزئي، قد ذهبت دون الكشف عنها. وسوف تستخدم التطبيقات المستقبلية لهذه التقنية لتحديد ما إذا كان ينبغي اختيار الإناث للتربية في أي سنة معينة وما إذا كان أوفيستس قد اكتمل.

بروتوكول جمع الدم، مثل تلك المقدمة في R. muscosa، وهو فعال على حد سواء ويسبب الحد الأدنى من الضائقة للحيواني ، هو الأمثل لدراسة ملامح هرمون في الميورانين الأسير والبرية اشتعلت (Calatayud ، غير منشورة). حتى الآن, لا توجد معلومات بشأن ملامح هرمون السنوي من الأسير R. muscosa, وبالتالي, لا توجد معرفة حول كيفية تأثير الهرمونات على صحتهم والإنجاب. وعلاوة على ذلك، مع وجود أدلة على أن الإناث من هذا النوع قد لا يكون مربي السنوي، والتنميط الهرموني سيكون وسيلة أخرى لتتبع دورات المبيض. جنبا إلى جنب مع الموجات فوق الصوتية, تحليل هرمون قد يؤدي إلى التنبؤ بشكل أفضل ما الإناث سوف تكون جاهزة لoviposition. وعلاوة على ذلك، تم في العام الماضي توثيق حالتين من الجنس بين الجنسين في السكان الأسيرر ر. موسكوسا. وبالإضافة إلى ذلك، لوحظ تطور منصات الإبهام على بعض الإناث المؤسسات الأكبر سنا. أسباب هذا حاليا قيد التحقيق ولكن النتائج الأولية تشير إلى أنه قد تتصل التغيرات في مستويات هرمون تستوستيرون (كالاتايود, غير منشورة). الدورات الهرمونية المميزة في الإناث من مختلف الأعمار سوف تساعدنا على فهم لماذا الإناث قد تتطور الخصائص الجنسية الثانوية المرتبطة بالذكور وما إذا كان هذا هو المتوقع في السكان المسنين.

وقد استخدم العلاج الهرموني الخارجي للتغلب على الاختلالات الإنجابية التي كثيرا ما تواجه في البرمائيات الأسيرة. ومع ذلك، بالنسبة لكل من السكان R. muscosa وNecturus في هذه الدراسة، لم يتم الكشف عن أي اختلافات كبيرة في oviposition بين الإناث المعالجة بالهرمونات والسيطرة على مدى فترة 2 و 5 سنوات من الزمن، على التوالي. وهذا قد يشير إلى أن بروتوكول إدارة هرمون, جرعات, فتيلة ومزيج هرمون المستخدمة لم تكن كافية للأنواع. تحليل أدق للتاريخ الإنجابي الفردي للإناث يشير إلى R. muscosa قد لا تواجه تربية سنوية، والتي يمكن أن تفسر أيضا عدم وجود تأثير هرموني لوحظ في الإناث المعالجة. لأن نسبة معينة من الإناث تخطي باستمرار تربية كل عام، وفهم التاريخ الطبيعي للأنواع يمكن أن تساعد في تحديد ما إذا كانت هناك حاجة للهرمونات الخارجية ومتى أنها قد تكون أكثر فعالية. ويمكن تطبيق الإجراءات المبينة في هذه المادة على عدد من الأنواع (الجدول 1) وهي للأنواع التي تتراوح بين 5 ز و 150 غرام؛ قد تتطلب الحيوانات الأكبر محاقن مختلفة ومقاييس إبرة. يختلف موقع الحقن مع بعض الهرمونات التي تتطلب داخل العضلات، داخل العضد، تحت الجلد أوالحقن داخل tradermal (الشكل 7).

الجراحة لغرض استئصال المبيض هي طريقة شائعة تستخدم في مختلف الأنواع البرمائية للحصول على البويضات للدراسات الجنينية. ويمكن أيضا أن يشار إلى استئصال المبيض للسيطرة على السكان والمسائل الطبية مثل الاحتفاظ بالبيض. في حالة استئصال المبيض الجزئي الذي يتم فيه حصاد البويضات لأغراض البحث، يجب أن تضمن الجراحة بقاء الحيوان إنجابياً. وقد أظهرت إدارة PGF_2αبعض الوعد في حل الاحتفاظ البيض في الإناث R. muscosa. في العديد من الأفراد، أثار PGF_2αترسب كامل من البيض الاحتفاظ بها سابقا ولكن في حالات أخرى حدث ترسب جزئي فقط تتطلب تجريد يدوي لإزالة جميع البيض. في حين أن PGF_2α قد تكون بمثابة بديل لعملية جراحية للاحتفاظ بالبيض في R. muscosa, قدرتها على علاج الظروف المرضية المماثلة في البرمائيات الأخرى سوف تتطلب التحقق من صحة الأنواع الخاصة. عندما يتم تكليف التدخل الجراحي للمريض أنوران أو Caudate، فمن الضروري لضمان مستوى كافية من التخدير قبل إجراء الشقوق. وثمة حاجة إلى مهارات مراقبة ذكية لتقييم ورصد الاستجابات المعيارية التعريفية والمتعلقة بالتعافي على النحو المبين في هذه الدراسة لكل من التدابير الضريبية. مرة واحدة على دراية التشريح محددة، ونهج جراحي مناسب، وhemostasis، والتلاعب الأنسجة لطيف وإدارة كافية بعد الجراحة، والعمليات الجراحية الإنجابية لا تشكل عقبات ساحقة.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تود ناتالي كالاتايود أن تشكر الدكتورة باربرا دورانت على التدريب والمساعدة في مجال الموجات فوق الصوتية وعلى شركة Exploradora de Immuebles, S.A. (EISA) على منحها مساعدات مالية لموقفي المشارك في البحث في SDZG. شكرا ً للدكتورة كايلي كان على تعليقاتها على المخطوطة وكذلك على المراجعين الرسميين (أياً كانوا). بفضل جوناثان دين زميلنا الصيفي 2018، معهد حديقة الحيوان في سان دييغو لبحوث الحفظ لتوفير الصور (الشكل1A،B). تعرب مونيكا ستوبس عن تقديرها لجمعية حدائق الحيوان وصندوق الهبات لحفظ أحواض السمك وصندوق ديزني العالمي لحفظ الطبيعة على تقديم الدعم المالي لإنشاء مجموعة السكان النيكتوروس الأسيرة. وبالإضافة إلى ذلك، تلقى الدعم أيضا من خلال تبرعات خاصة من المحامية البرمائية السيدة إيريس دي لا موت. شكرا، يتم تقديم الشكر إلى السيد كريستوفر ديشانت والدكتور مارك كامبل لمساهمتهم الكبيرة في البحث.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
GE logiq Book XP and 8C-RS probe 4e10 MHz GE Medical Systems	GE medical systems	GE logiq Book XP	Ultrasound
Aloka 500 7.5mHz linear or IBEX multi-frequency (10-6mHz) micro-convex	GE medical systems	8C-RS (10 MHz)	Ultrasound probe
BD disposable U-100 insulin syringe (28-29 G needle)	Mettler Electronics Corp CA	Sonigel	Ultrasound gel (water soluble, salt-free)
Hormone
Gonadotropin releasing hormone	BACHEM	4012028	synonym: [Des-Gly10, D-Ala6, Pro-NHEt9]-GnRH acetate abbreviation: GnRH
Lutenizing hormone releasing hormone	BACHEM, Sigma-Aldrich	4033013; L1898	synonym: Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ acetate salt; [D-Ala6}-LHRH acetate salt hydrate abbreviation: LHRH
Human chorionic gonadotropin	BACHEM, Sigma-Aldrich	4030270, 4018894; C1063, CG5, CG10	synonym: Chorionic gonadotropin-β (109-145)(109-119); Choriogonin, HCG (2,500IU, 5,000IU, 10,000IU) abbreviation: hCG
Prostaglandin 2α	Sigma-Aldrich	P40424;	synonym: (5Z,9α,11α,13E,15S)-9,11,15-Trihydroxyprosta-5,13-dienoic acid tris salt, PGF2α−Tris; abbreviation: PGF2α
Follicle-stimulating hormone	Sigma-Aldrich	F4021, F8174	synonym: porcine, sheep abbreviation: FSH
Progesterone	Sigma-Aldrich	46665; P7556	synonym: Vetranal; P4 water soluble abbreviation: P4
Pituitary extract	na		synonym: Check papers for amphibian species derivation abbreviation: PE
Pregnant Mare Serum Gonadotropin	Prospec; Lee Biosolutions; Sigma-Aldrich	HOR-272; 493-10; 9002-70-4	synonym: Pregnant Mare Serum Gonadotropin abbreviation: PMSG
Metaclopromide	Sigma-Aldrich	M0763	synonym: 4-Amino-5-chloro-N-[2-(diethylamino)ethyl]-2-methoxybenzamide, Methoxychloroprocainamide abbreviation: MET
Lucrin	BACHEM; Sigma-Aldrich	4033014; L0399	synonym: Leuprorelin acetate abbreviation: Lucrin
Lutalyse	Pfizer		synonym: PGF2α - Dinoprost tromethamine abbreviation: Lut
Pimozide	Sigma-Aldrich	P1793	synonym: 1-[1-[4,4-bis(4-Fluorophenyl)butyl]-4-piperidinyl]-1,3-dihydro-2H-benzimidazol-2-one abbreviation: PZ
Amphiplex	see above		synonym: Gonadotropin releasing hormone + metoclopramide abbreviation: GnRH + MET
Ovopel	Ovopel	na	synonym: GnRHa + dopamine receptor antagonist (administered 1 pellet/ kg) abbreviation: Ovo
Ovaprim	Pentair aquatic eco-systems	Ova10	synonym: Salmon gonadotropin + domperidone abbreviation: Ova
Domperidone	Sigma-Aldrich	D122	synonym: 4-(5-Chloro-2-oxo-1-benzimidazolinyl)-1-[3-(2-oxobenzimidazolinyl)propyl]piperidine abbreviation: DOM

References

Conde, D. A., Flesness, N., Colchero, F., Jones, O. R., Scheuerlein, A. An emerging role of zoos to conserve biodiversity. Science. 331 (6023), 1390-1391 (2011).
Conde, D. A., et al. Zoos through the Lens of the IUCN Red List: A Global Metapopulation Approach to Support Conservation Breeding Programs. PLoS ONE. 8 (12), e80311(2013).
Morrison, C., Hero, J. -M. Geographic variation in life-history characteristics of amphibians: a review. Journal of Animal Ecology. 72 (2), 270-279 (2003).
Calatayud, N. E., Stoops, M., Durrant, B. S. Ovarian control and monitoring in amphibians. Theriogenology. , 70-81 (2018).
National Research Council. Institutional Animal Care and Use Committee Guidebook. , (2010).
Peig, J., Green, A. J. New perspectives for estimating body condition from mass/length data: the scaled mass index as an alternative method. Oikos. 118 (12), 1883-1891 (2009).
Graham, K. M., Langhorne, C. J., Vance, C. K., Willard, S. T., Kouba, A. J. Ultrasound imaging improves hormone therapy strategies for induction of ovulation and in vitro fertilization in the endangered dusky gopher frog (Lithobates sevosa). Conservation Physiology. 6 (1), coy020(2018).
Wright, K. M., Whitaker, B. R. Amphibian Medicine and Captive Husbandry. , Krieger Publishing Company. (2001).
Forzán, M. J., Vanderstichel, R. V., Ogbuah, C. T., Barta, J. R., Smith, T. G. Blood collection from the facial (maxillary)/musculo-cutaneous vein in true frogs (family Ranidae). Journal of Wildlife Diseases. 48 (1), 176-180 (2012).
Allender, M. C., Fry, M. M. Amphibian hematology. Veterinary Clinics of North America: Exotic Animal Practice. 11 (3), 463-480 (2008).
Green, S. L., Parker, J., Davis, C., Bouley, D. M. Ovarian hyperstimulation syndrome in gonadotropin-treated laboratory South African clawed frogs (Xenopus laevis). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 46 (3), 64-67 (2007).
Jorgensen, C. B. External and internal control of patterns of feeding, growth and gonadal function in a temperate zone anuran, the toad Bufo bufo. Journal of Zoology. 210 (2), 211-241 (1986).
Jørgensen, C. B. Growth and reproduction. Environmental Physiology of the Amphibians. , 439-466 (1992).
Vu, M., Trudeau, V. L. Neuroendocrine control of spawning in amphibians and its practical applications. General and Comparative Endocrinology. 234, 28-39 (2016).
Clulow, J., Trudeau, V. L., Kouba, A. J. Amphibian declines in the twenty-first century: why we need assisted reproductive technologies. Reproductive Sciences in Animal Conservation. , 275-316 (2014).
Kouba, A., et al. Assisted reproductive technologies (ART) for amphibians. Amphibian Husbandry Resource Guide. 2, 60-118 (2012).
Clulow, J., et al. Optimisation of an oviposition protocol employing human chorionic and pregnant mare serum gonadotropins in the Barred Frog Mixophyes fasciolatus (Myobatrachidae). Reproductive Biology and Endocrinology. 10 (1), 60(2012).
Browne, R. K., Seratt, J., Vance, C., Kouba, A. Hormonal priming, induction of ovulation and in-vitro fertilization of the endangered Wyoming toad (Bufo baxteri). Reproductive Biology and Endocrinology. 4 (1), 34(2006).
Calatayud, N. E., et al. A hormone priming regimen and hibernation affect oviposition in the boreal toad (Anaxyrus boreas boreas). Theriogenology. 84 (4), 600-607 (2015).
Stoops, M. A., Campbell, M. K., Dechant, C. J. Successful captive breeding of Necturus beyeri through manipulation of environmental cues and exogenous hormone administration: a model for endangered Necturus. Herpetological Review. 45 (2), 251-256 (2014).
Mc Creery, B. R., Licht, P. Induced ovulation and changes in pituitary responsiveness to continuous infusion of gonadotropin-releasing hormone during the ovarian cycle in the bullfrog, Rana catesbeiana. Biology of Reproduction. 29 (4), 863-871 (1983).
Johnson, C. J., Vance, C. K., Roth, T. L., Kouba, A. J. Oviposition and ultrasound monitoring of American toads (Bufo americanus) treated with exogenous hormones. Proceedings of the American Association of Zoo Veterinarians. 299, 301(2002).
Herbert, D. Studies of assisted reproduction in the spotted grass frog Limnodynastes tasmaniensis: ovulation, early development and microinjection (ICSI). , (2004).
Michael, S. F., Buckley, C., Toro, E., Estrada, A. R., Vincent, S. Induced ovulation and egg deposition in the direct developing anuran Eleutherodactylus coqui. Reproductive Biology and Endocrinology. 2, 6(2004).
Ogawa, A., Dake, J., Iwashina, Y., Tokumoto, T. Induction of ovulation in Xenopus without hCG injection: the effect of adding steroids into the aquatic environment. Reproductive Biology and Endocrinology. 9 (1), 11(2011).
Silla, A. J. Effects of luteinizing hormone-releasing hormone and arginine-vasotocin on the sperm-release response of Günther’s Toadlet, Pseudophryne guentheri. Reproductive Biology and Endocrinology. 8 (1), 139(2010).
Trudeau, V. L., et al. Hormonal induction of spawning in 4 species of frogs by coinjection with a gonadotropin-releasing hormone agonist and a dopamine antagonist. Reproductive Biology and Endocrinology. 8 (1), 36(2010).
Krause, E. T., von Engelhardt, N., Steinfartz, S., Trosien, R., Caspers, B. A. Ultrasonography as a minimally invasive method to assess pregnancy in the fire salamanders (Salamandra salamandra). Salamandra. 49, 211-214 (2013).
Browne, R. K., Li, H., Seratt, J., Kouba, A. Progesterone improves the number and quality of hormone induced Fowler toad (Bufo fowleri) oocytes. Reproductive Biology and Endocrinology. 4 (1), 3(2006).
Bramucci, M., et al. Different modulation of steroidogenesis and prostaglandin production in frog ovary in vitro by ACE and ANG II. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 273 (6), R2089-R2096 (1997).
Gobbetti, A., Zerani, M. Possible roles for prostaglandins E2 and F2α in seasonal changes in ovarian steroidogenesis in the frog (Rana esculenta). Journal of Reproduction and Fertility. 98 (1), 27-32 (1993).
Gobbetti, A., Zerani, M., Carnevali, O., Botte, V. Prostaglandin F2α in female water frog, Rana esculenta: Plasma levels during the annual cycle and effects of exogenous PGF2α on circulating sex hormones. General and Comparative Endocrinology. 80 (2), 175-180 (1990).
Guillette, L. J. Jr, Dubois, D. H., Cree, A. Prostaglandins, oviducal function, and parturient behavior in nonmammalian vertebrates. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 260 (5), R854-R861 (1991).
Clulow, J., Mahony, M., Browne, R., Pomering, M., Clark, A. Applications of assisted reproductive technologies (ART) to endangered anuran amphibians. Declines and Disappearances of Australian Frogs'. Campbell, A. , 219-225 (1999).
Browne, R. K., Wolfram, K., García, G., Bagaturov, M. F., Pereboom, Z. Zoo-based amphibian research and conservation breeding programs. Amphibian and Reptile Conservation. 5 (3), 1-14 (2011).
Chai, N. Surgery in amphibians. Veterinary Clinics: Exotic Animal Practice. 19 (1), 77-95 (2016).
Gentz, E. J. Medicine and surgery of amphibians. Ilar Journal. 48 (3), 255-259 (2007).
Snyder, W. E., Trudeau, V. L., Loskutoff, N. M. 168 a noninvasive, transdermal absorption approach for exogenous hormone induction of spawning in the northern cricket frog, Acris crepitans: a model for small, endangered amphibians. Reproduction, Fertility and Development. 25 (1), 232-233 (2012).
Kouba, A. J., et al. Emerging trends for biobanking amphibian genetic resources: the hope, reality and challenges for the next decade. Biological Conservation. 164, 10-21 (2013).
Michael, S. F., Buckley, C., Toro, E., Estrada, A. R., Vincent, S. Induced ovulation and egg deposition in the direct developing anuran Eleutherodactylus coqui. Reproductive Biology and Endocrinology. 2 (1), 6(2004).
Fort, D. J. Frog reproduction and development study 2000 rana pipiens reproduction and development study. , Environmental Protection Agency. (2003).
Clulow, J., et al. Differential success in obtaining gametes between male and female Australian temperate frogs by hormonal review: A Review. General and Comparative Endocrinology. 265, 141-148 (2018).
Trottier, T. M., Armstrong, J. B. Diploid gynogenesis in the Mexican axolotl. Genetics. 83 (4), 783-792 (1976).
Marcec, R. M. Development of assisted reproductive technologies for endangered North American salamanders. , Mississippi State University. (2016).
Wright, M. L. Melatonin, diel rhythms, and metamorphosis in anuran amphibians. General and Comparative Endocrinology. 4, (2002).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

147 Circadian

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: