Reproduktionstechniken für Diekarianüberwachung und -kontrolle bei Amphibien

Zusammenfassung

Das Studium der Amphibienbiologie liefert wertvolle Informationen über die reproduktiven, physiologischen, embryonalen und entwicklungstechnischen Prozesse, die Organismen vieler taxonomischer Gruppen antreiben. Hier stellen wir einen umfassenden Leitfaden zu verschiedenen Methoden vor, mit denen die Kontrolle und Überwachung von Eierstöcken bei Amphibien untersucht werden kann.

Zusammenfassung

Die Kontrolle und Überwachung von Eierstöcken bei Amphibien erfordert einen facettenreichen Ansatz. Es gibt mehrere Anwendungen, die erfolgreich Reproduktivverhalten und den Erwerb von Gameten und Embryonen für physiologische oder molekulare Forschung induzieren können. Amphibien tragen zu einem Viertel zu einem Drittel der Wirbeltierforschung bei, und von Interesse in diesem Zusammenhang ist ihr Beitrag zum Wissen der wissenschaftlichen Gemeinschaft über Fortpflanzungsprozesse und embryologische Entwicklung. Der größte Teil dieses Wissens stammt jedoch von einer kleinen Anzahl von Arten. In jüngster Zeit erforderte die Dezimierung von Amphibien auf der ganzen Welt ein zunehmendes Eingreifen von Naturschützern. Die Rückgewinnungs- und Sicherungskolonien, die weiterhin als Reaktion auf das Aussterberisiko entstehen, machen bestehende Forschungs- und klinische Anwendungen für das Überleben und die Fortpflanzung von Amphibien, die unter menschlicher Obhut gehalten werden, von unschätzbarem Wert. Der Erfolg jeder in Gefangenschaft gehaltenen Population beruht auf ihrer Gesundheit und Fortpflanzung und der Fähigkeit, lebensfähige Nachkommen zu entwickeln, die die unterschiedlichste genetische Darstellung ihrer Art vortragen. Für Forscher und Tierärzte ist daher die Fähigkeit, die Entwicklung und Gesundheit von Eierstöcken zu überwachen und zu kontrollieren, unerlässlich. Der Schwerpunkt dieses Artikels liegt darauf, die verschiedenen assistierten Reproduktionstechniken hervorzuheben, die verwendet werden können, um die Eierstockfunktion bei Amphibien zu überwachen und gegebenenfalls zu kontrollieren. Im Idealfall sollten alle Reproduktiv- und Gesundheitsprobleme durch eine ordnungsgemäße Haltung in Gefangenschaft reduziert werden, aber wie bei jedem Tier sind Fragen der Gesundheit und der Reproduktiven unausweichlich. Nicht-invasive Techniken umfassen Verhaltensbeurteilungen, visuelle Inspektion und Palpation sowie morphometrische Messungen zur Berechnung von Körperzustandsindizes und Ultraschall. Invasive Techniken umfassen hormonelle Injektionen, Blutentnahme, und Chirurgie. Die Kontrolle der Eierstöcke kann je nach Anwendung und Arten von Interesse auf verschiedene Weise ausgeübt werden.

Einleitung

Amphibien sind seit langem als wichtige biologische und medizinische Modelle durch eine breite Palette von Forschungsdisziplinen anerkannt. Daten, die durch das Studium bestimmter Arten wie Xenopus laevis und X. tropicalis, der Leopardenfrosch (Lithobate (früher Rana) pipiens) und das Axolotl (Ambystoma mexicanum) gewonnen wurden, wurden auf eine Reihe anderer Wirbeltierarten, einschließlich des Menschen. Die Tier-, Haltungs- und assistierten Reproduktionstechniken, die aus der Untersuchung dieser und anderer Amphibien hervorgegangen sind, unterstützen diejenigen, die mit der Entwicklung einer erfolgreichen Pflege, Erhaltung und Nachhaltigkeit seltenerer Populationen in Gefangenschaft beauftragt sind. ^{1 , 2 , 3 , 4}.

Das Interesse für die gleichzeitige Verwendung von in und ex situ naturschutzbasierten Ansätzen zur Umkehrung der Flut des Aussterbens für viele gefährdete Amphibienarten^1,2. Dieser Artikel enthält die derzeit verfügbaren Methoden zur Überwachung und Kontrolle der Amphibien-Ovarialfunktion in Modellarten von Anurans und Caudates. Zusätzlich werden bestehende Techniken zur Bekämpfung einer gemeinsamen Reproduktivpathologie der Eiretention vorgestellt.

Wie in vielen taxonomischen Gruppen beinhaltet die amphibische Ovarialkontrolle eine Reihe eng synchronisierter Wechselwirkungen zwischen Umwelt und Physiologie. Temperatur und Photoperiode (bekannt als nahe Signale) werden von Auge und Gehirn entschlüsselt, wo sie schnell in genetische, hormonelle und zirkadiane Prozesse (ultimative Signale)^umgewandeltwerden 3^,4. Die in diesem Artikel behandelten Methoden zur Überwachung und Kontrolle der Eierstockfunktion umfassen invasive und nicht-invasive Techniken. Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Forschungs- und Lehranforderungen definieren nicht-invasive Techniken als diejenigen, die minimale bis keine körperlichen Schmerzen oder psychischen Beschwerden verursachen und keine schmerzlindernden Medikamente erfordern⁵. Nicht-invasive Techniken umfassen hier visuelle Inspektion und Palpation, Verhaltensbeobachtungen, morphometrische Bewertungen und Ultraschall. Im Gegenteil, die Techniken der Blutentnahme, Hormonverabreichung und Chirurgie (Ovariektomie und Entfernung von zurückgehaltenen Eiern) werden als invasiv eingestuft, da sie zu einigen Schmerzen oder Beschwerden führen können und eine Anästhesie oder eine postprozedurale medikamentöse Therapie erfordern.

Nicht-invasive Ovarialüberwachungstechniken können für die meisten in Gefangenschaft gehaltenen Amphibien leicht in die tägliche Pflegeroutine integriert werden. Je nach Art kann die Ovarialgravitation oft durch einfache Sichtprüfung (Glasfrosch) bestimmt werden. In anderen Fällen kann die Palpation darauf hinweisen, ob ein Weibchen gravid ist. Verschiedene Körperzustandsindizes (BCI) wie Gewicht, Schnospe-Urostyle-Länge (SUL), Schnommen-Entlüftungslänge (SVL) und Standard-Massenindex (SMI) stehen zur Vorhersage des Vorhandenseins oder Fehlens von Eiern^{4,6,7, 8,9}. Bei der Interpretation der Ergebnisse sollte jedoch Vorsicht geboten sein, da die meisten Alter, Körperform oder Zusammensetzung (z. B. wasserzurückgehaltenes Wasser im Vergleich zu Eierstockmasse oder Fett) nicht berücksichtigen⁶. Definitive Reproduktionsdiagnosen können über Ultraschall mit tieferen Kenntnissen über die Eientwicklung und die Inszenierung des Eierstockzyklus erreicht werden^4,7. Ultraschall bietet auch ein Mittel, um reproduktive Pathologien und damit verbundene physiologische Bedingungen zu bestätigen und zu überwachen^4,8.

Neben der Bereitstellung von Informationen über den Gesundheitszustand, Blutentnahme kann verwendet werden, um Fortpflanzungshormone zu messen. Wenn Hormon-Profiling ist das Endziel, Es ist wichtig, stressbedingte Einflüsse zu vermeiden, die systemische Steroid-Daten verwirren können. Während ein potenziell leistungsfähiges Überwachungsinstrument, Es gibt noch eine Studie, die angeborene endokrinologische Reaktionen auf exogene Hormon-Verabreichung bei jeder Amphibienart zeigt. Blut kann sicher von mehreren Stellen entnommen werden; bei Fröschen umfasst dies die ventrale Bauchvene, lingualen Plexus, Femoral vene und Herz^9,10. In Caudates wird Blut aus der ventralen Schwanzvene entnommen. Der Grad der Invasivität, der erforderliche Grad an Zurückhaltung, die Notwendigkeit des Anästhetikums, die Zartheit des angegriffenen Organs und die Größe des Tieres sind Faktoren, die bei der Wahl einer Sammeltechnik für den Amphibienpatienten zu berücksichtigen sind. Dieser Artikel wird die Technik der Blutentnahme aus der Gesichtskiefer oder muskelkultokutanen Vene von Fröschen, wie ursprünglich von Forzan et al. beschrieben.⁹.

Die Ovariankontrolle ist artspezifisch und als solche sollten Hormonprotokolle getestet und optimiert werden. Abgesehen von der Saisonalität und dem damit verbundenen zirkulierenden Hormonmilieu kann die Kontrolle der Eierstöcke auch eng mit dem Alter, der Zeit in Gefangenschaft und der Exposition gegenüber wiederholter Hormonverabreichung verbunden sein, für die es in der Literatur wenig Informationen gibt^{11 , 12 , 13}. Die Umsetzung von Hormontherapien zur Erzielung von Fortpflanzungsverhalten, Gametenproduktion, Reifung und Eileiter ist zu einem weithin berichteten Ansatz zur Lösung gemeinsamer Fortpflanzungsprobleme im Zusammenhang mit Gefangenschaft^{geworden 4, 8,14,15,16}. Da die Mechanismen zur Kontrolle der Fortpflanzung bei Wirbeltieren stark konserviert sind, gibt es eine Reihe von Hormonen, Neuropeptide und kommerziell erhältlichen Arzneimitteln, die therapeutisch in anderen taxonomischen Gruppen eingesetzt werden, die auch in einer Reihe von Amphibienarten (Tabelle 1). Gonadotropin-Releasing-Hormon (GnRH) und Humanchoriongonadotropin (hCG) (oder Variationen davon, d.h. PMSG und eCG)^17,18, einzeln oder in Kombination, wurden ausgiebig in Amphibien-Gefangenschaft Zuchtprogramme einschließlich: der Southern Rocky Mountain boreal (Anaxyrus boreas boreas)^4,19,20; die Kröte, Dusky Gopher Frosch, Rana sevosa (Langhorne et al., unveröffentlicht)⁷; der Wasserhund der Golfküste, Necturus beyeri²⁰; Wyoming Kröte, Anaxyrus baxteri¹⁸; der Stierfrosch, Rana catesbiana²¹; die amerikanische Kröte, Anaxyrus americanus²²; der Grasfrosch, Lymnodyaster tasmaniensis²³; der Coqui, Eleutherodactylus coqui²⁴; Xenopus, Xenopus laevis²⁵; die Gunther-Kröte, Pseduophryne guentheri²⁶; der Nördliche Leopardenfrosch, Lithobates pipiens; der argentinische Hornfrosch, Ceratophrys verziert; der Cranwell-Hornfrosch C. cranwelli; der amerikanische Bodenfrosch, Odontophrynus americanus^27; und der Feuersalamander (Salamandra)²²⁸. Steroidhormone, wie Progesteron (P4), sind weniger häufig berichtet, aber haben eine gute Wirksamkeit bei der Bildung von Eisprung und Oviposition bei einigen Arten von Anurans^16,18,29gezeigt. Prostaglandine (insbesondere Prostaglandin 2-alpha (PGF₂₎sind am Eisprung zusammen mit Kortikosteroiden^30,31,32,34 beteiligt und erreichen hohe die Eisprungphase³¹.

In In-vitro-Studien ist PGF_2a ein potenter Induktor des Eisprungs³¹, während es in vivo oviposition von zurückgehaltenen Eiern in Rana muscosa^4,30,32induzieren kann. Hypophysenextrakte sind auch wirksame Induktoren des Eisprungs^15,16,34; Bedenken im Zusammenhang mit der Biosicherheit und dem Potenzial für die Übertragung von Krankheiten sind jedoch oft eine Abschreckung für Zuchtkolonien in Gefangenschaft, wenn sie diesen Ansatz in Betracht ziehen³⁵.

Der letzte Abschnitt dieses Artikels beschreibt chirurgische Verfahren und bietet alternative Ansätze, um Eierstockstudien oder Hilfe bei der Lösung reproduktiver Pathologien zu erweitern. Ovariektomien werden am häufigsten in Amphibien durchgeführt, um Eizellen für die embryologische Forschung zu erhalten. Jedoch, Es kann auch ein Heilmittel für zurückgehaltene Eier bieten, wenn andere Optionen fehlschlagen. Obwohl dieses Verfahren invasiv ist und eine vollständige Anästhesie und Einschnitte erfordert, um die Eimassen freizulegen, erfordert es keine Euthanasie. Darüber hinaus können Tiere nach partieller Ovariektomie eine vollständige Genesung vornehmen und nach der Operation weiterhin reproduktiv aktiv sein^8,36.

Die unten beschriebenen Protokolle beschreiben die invasiven und nicht-invasiven Methoden der Eierstockkontrolle und -überwachung in Anurans und Caudates. Die spezifischen Arten, die ausgewählt wurden, um Techniken in Anurans zu veranschaulichen, sind R. mucosa und X. laevis. Necturus maculosus, N. beyeri, N. alabamensisund A. mexicanum umfassen die Arten, die verwendet werden, um Techniken in Caudates ähnlich zu beschreiben.

Protokoll

Salamander-Verfahren wurden von den Protokollen des Cincinnati Zoo & Botanical Garden (CZBG) Institutional Care and Use Committee (IACUC) 11-106, 13-110, 14-133 und 15-138 genehmigt. Alle Frosch- und Krötenprozeduren wurden von den Protokollen des San Diego Zoo Global (SDZG), Institutional Care and Use Committee (IACUC) genehmigt: 15-001, 16-005 und 18-003.

Die Pflege und Behandlung von Tieren wurde vom Ethikausschuss des Nationalmuseums für Naturgeschichte (Paris) (Museum National d'Histoire Naturelle-Ménagerie du Jardin des Plantes (MNHN)) in Übereinstimmung mit den institutionellen und nationalen Richtlinien genehmigt. (Commission de Génie Génétique, Direction Départementale des Services Vétérinaires, Richtlinie 2010/63/EU der Europäischen Union, Einigungsentscheidung Nr. C75-05-01-2 für das Europäische Übereinkommen für Wirbeltiere, die für experimentelle und andere wissenschaftliche Zwecke verwendet werden. Alle in dieser Studie verwendeten Protokolle wurden unter der Referenznummer 68-037 zugelassen.

1. Nichtinvasive Ovarialüberwachungstechniken

1. Visuelle Inspektion und Palpation
   1. Halten Sie das Weibchen Anuran auf eine der drei unten beschriebenen Weisen.
      1. Sichern Sie den Frosch oder die Beine der Kröte mit dem Ring und dem kleinen Finger, wobei Sie die Rückenseite (Bauch) des Froschkörpers mit dem Zeige- und Mittelfinger und die ventrale Seite mit dem Daumen stützen (Abbildung 1A).
      2. Halten Sie den Frosch oder die Kröte in der dominanten Hand mit einem Daumen auf dem Bauch und den Rest der Finger, die den Rücken des Tieres sichern. Mit der nicht-dominanten Hand, um den Bauch des Tieres zu palpaten, fühlen, wenn es subdermalen Unebenheiten gibt (Abbildung 1B).
      3. Ruhen Sie den Frosch oder Krötenbauch auf der Handfläche, die vorderen Arme über dem Zeigefinger drapiert und einen Daumen auf dem oberen Rücken.
   2. Da Caudates vollständig aquatisch sind, führen Sie eine visuelle Inspektion mit einer von zwei unten beschriebenen Methoden durch.
      1. Bewegen Sie das Tier in einen separaten 4 L Behälter mit Tankwasser. Halten Sie den Behälter (Deckel gesichert) hoch und leuchten Sie Taschenlampe auf der Unterseite, um das Vorhandensein / Abwesenheit von Eiern zu visualisieren.
      2. Anästhesisieren in MS222 (0,5 g/L; Tricain-Methansulfonat, gepuffert mit 0,5 M NaHCO₃). Nach der Induktion das Tier auf den Rücken drehen und den Bauch untersuchen.
2. Morphometrische Bewertungen
   1. Anurans
      HINWEIS: Anästhesie ist nicht erforderlich.
      1. Mit Sätteln, messen Sie das Tier von der Spitze des Mundes, entlang der Mitte des Körpers bis zur Spitze des Schwanzes, um SUL und SVL zu erhalten (Abbildung 2A, B).
      2. Tare einen Kunststoffbehälter auf einer digitalen Präzisionsskala. Legen Sie das Tier in einen geteerten Behälter und wiegen (Abbildung 2C).
      3. Verwenden Sie für größere Tiere, wie Stierfrösche, oder bei der Beschaffung von Gewichten im Feld eine hängende Skala (Abbildung2D).
      4. Wie bei vielen Anuran-Arten, unterscheiden R. muscosa erwachsene Weibchen von Männchen durch ihre größere Größe und das Fehlen von ehelichen (Daumen) Pads an den Händen (Abbildung 3).
      5. Berechnen Sie den Körperzustand als grundlegende Beurteilung der Gesamtgesundheit nach der folgenden Formel:
         Fultons Index: K = Masse - Länge³
         HINWEIS: Fultons Index verwendet einen Maßsaldo des Volumens in Bezug auf Masse und Länge, wobei ³ der Skalierungsexponent ist, der Masse und Länge isometrisch in Beziehung setzt.
   2. Caudates
      1. Tare Skala mit einem leeren Beutel vor dem Platzieren der nicht-anästhetisierten Tier in. Achten Sie darauf, kein überschüssiges Wasser einzuführen (Abbildung 2D) und schnell handeln, da Tiere Schleim als Stressreaktion auf Zurückhaltung absondern.
      2. Erhalten Sie Maßnahmen für Erwachsene, indem Sie Personen in einer geraden Position am Boden einer wiederverschließbaren Plastiktüte oder in einem separaten Kunststoffbehälter, der erweiterte Bremssättel aufnehmen kann, immobilisieren.
      3. Messen Sie die Körperlänge mit Bremssätteln (Abbildung 2E).
      4. Messen Sie das Caudate von der Schnoutspitze bis zur Schwanzspitze (SVL), um das Wachstum zu überwachen.
3. Verhaltensbeobachtungen
   1. Beobachten Sie Tiere physisch in Echtzeit oder verwenden Sie eine Videokamera, um das Verhalten aufzuzeichnen.
   2. Erfassen Sie Beobachtungen von Tieren, kategorisieren Verhaltensweisen und konstruieren Sie ein Ethogramm (Abbildung 4).
   3. Reproduktives Verhalten klassifizieren
      HINWEIS: Abbildung 4 veranschaulicht eine Art von Fortpflanzungsverhalten, das bei Anuranen beobachtet wird.
4. ultraschall
   HINWEIS: Der Ultraschallwandler der Wahl, in diesem Fall 7,5 mHz linear oder ein Multi-Frequenz (10-6 mHz) mikrokonvex, wird für Necturus und eine 10 MHz Sonde und wasserlösliches, salzfreies Gel für R. muscosaempfohlen. Die Durchführung von Ultraschall auf Salamandern kann eine Anästhesie erfordern (anweisungen siehe Abschnitt 1.5).
   1. Anurans
      1. Führen Sie Ultraschall auf R. muscosa mit zwei Personen (Abbildung5A).
      2. Erste Person: Halten Sie das Tier mit der dominanten Hand und tragen Sie das wasserlösliche, salzfreie Gel auf den Bauch des Tieres auf.
      3. Zweite Person (Ultra-Sonograph): Nehmen Sie die 10-MHz-Sonde in die dominante Hand und tragen Sie sie auf den Bauch auf, um sicherzustellen, dass ein guter Kontakt zwischen Sonde und Gel herzustellen ist.
      4. Schieben Sie nach innen von knapp unterhalb der Armgrube in Richtung der Mitte der Bauchlinie des Tieres, um den ganzen Eierstock zu visualisieren.
      5. Ultra-Sonograph: Verwenden Sie eine nicht-dominante Hand, um den Rahmen einzufrieren und die gewünschten Bilder auf dem Ultraschall zu erfassen.
      6. Kategorisieren Sie die Stufe des Ovarialzyklus durch das für die Gattung 4 eingerichtete Benotungssystem⁴ (Tabelle 2, Abbildung 5B-F).
      7. Spülen Sie jedes Gel von Tier am Ende des Verfahrens.
   2. Caudates
      1. Nicht anästhesierten Necturus in 4 L rechteckigen Behälter mit 2 L Tankwasser füllen.
      2. Minimieren Sie die Bewegung des Tieres, indem Sie das Raumlicht ausschalten und/oder eine Hand über den Kopf des Tieres bechern.
      3. Positionieren Sie den Messumformer in einem Abstand von 1-2 cm von der Körperwand.
      4. Suchen Sie das Herz auf der ventralen Mittellinie zu den Vorderbeinen und bewegen Sie dann den Transducer distally und untersuchen Sie das Eierstockgewebe⁷.
      5. Kategorisieren Sie Weibchen nach dem für die Gattung 4 eingerichteten Benotungssystem⁴ (Abbildung 6A,B,C).
      6. Erhalten Sie genaue Messungen der Eier im mittleren bis späten Stadium, indem Sie Bilder erfassen, wenn sich der Körper des Tieres in einem Winkel zum Messumformer befindet (d. h. nicht linear, sondern leichter Lichtbogen; Abbildung 6B). Andernfalls erschweren überlappende Follikel die Unterscheidung der individuellen Eigröße.
5. Anästhesieinduktion und -erholung
   1. Anurans
      1. Anästhesisieren in MS222 (0,5 g/L; Tricain-Methansulfonat gepuffert (0,5 M NaHCO₃) wie zuvor beschrieben.
      2. Verwenden Sie den Rechtenreflex als primären Indikator für den Grad, in dem das Tier beästhesiert wurde. Vollständiger Reflexverlust zeigt einen Zustand der tiefen Anästhesie.
      3. Entfernen Sie das Tier aus der Wasserbad-anästhesie (MS-222), sobald der Rechtereflex verloren geht.
      4. Legen Sie das Tier auf ein nasses (mit anästhetisch-freiem entchlortem Wasser) Handtuch.
      5. Achten Sie darauf, das Tier während des gesamten chirurgischen Eingriffs feucht zu halten.
      6. Intubieren Sie kleine Amphibien mit roten Gummikathetern, ungecuffed Tubes oder klassischen gefesselten Endotrachealröhren, ohne die Manschette aufzublasen.
      7. Geben Sie einen niedrigen Sauerstofffluss (0,5-0,75 l/min) mit 0,5-1% Isofluran.
      8. Stoppen Sie das Isofluran nach dem Eingriff, aber halten Sie den Sauerstofffluss für 1 Minute.
      9. Extubieren Sie das Tier und spülen Sie das Tier 2 Minuten lang gründlich mit anästhetischem, entchlortem Wasser ab.
      10. Legen Sie das Tier in eine geringe Menge entchlortem Wasser oder auf ein nasses Handtuch.
      11. Bewerten Sie die Genesung des Tieres, indem Sie sanft an einer Hintergliedsbeine ziehen, um sich zu verlängen. Jede reagierende Kontraktion der Gliedmaße deutet auf einen Entzugsreflex hin.
      12. Überwachen Sie andere Indikatoren der Erholung, wie z. B. Gularatmungen (Throat-Bewegung) und den Rechtenreflex.
      13. Betrachten Sie die Amphibien erholt, wenn alle Reflexe zurückgekehrt sind, und Herz- und Atmungsraten sind auf präanesthetische Werte zurückgekehrt.
   2. Caudates
      1. Anästhetisieren Necturus und Ambystoma in MS222 (0,5 g/L Tricainmemetulfonat, gepuffert mit 0,5 M NaHCO₃, (MS222) in einem 4 L rechteckigen Tank.
      2. Legen Sie einen Luftstein (1 Zoll) und eine Luftpumpe in den Tank und schalten Sie ihn auf einen konstanten Durchfluss ein, um eine ausreichende Sauerstoffversorgung zu gewährleisten.
      3. Wenn die Gliedmaßenfunktion und der Rechtereflex verloren gehen, entfernen Sie das Tier aus der Wasserbad-Anästhesie (MS-222) und legen Sie das Tier auf ein nasses (mit anästhetisch-freies entchlortes Wasser) Handtuch.
      4. Halten Sie Haut und Kiemenfeuchtigkeit mit einer gepressten Flasche Tankwasser.
      5. Um das Tier zu bergen, legen Sie es sorgfältig ventrale Seite nach unten in einem 4 L Kunststoffbehälter mit 2 L Tankwasser mit einem Luftstein gefüllt.
         HINWEIS: Die Erholung beginnt mit Kiemenblinken, gefolgt von der Fähigkeit, seinen Schwanz zu bewegen und vorwärts zu treiben und schließlich funktionelle Bewegung der Gliedmaßen.
      6. Bringen Sie das Tier in seinen ursprünglichen Gehäusetank zurück und überwachen Sie es in den nächsten 24 Stunden genau.
         HINWEIS: Es gibt andere Methoden der Anästhesie für Amphibien, die in Wright und Whitaker⁸beschrieben sind.

2. Invasive Eierstock-Monitor- und Kontrolltechniken

ANMERKUNG: Dieses Verfahren wurde von Forzén et al.¹⁰angepasst.

1. Halten Sie den Frosch in der dominanten Hand, und tupmeln Sie die Venenpunktionsseite des Froschgesichts mit einem sterilen Wisch oder Gaze trocknen.
2. Trocknen Sie das Gesicht, um zu vermeiden, dass sich das Blut zu sehr über die Haut verbreitet.
3. Setzen Sie die Nadel (26 G 1/2" und 27 G 1/2"), mit der Abschrägung nach oben, durch die Haut, wo die erhöhte Haut um das Auge und der Oberkiefer Grat treffen, um den Punkt eines Dreiecks (gelbe Umriss) (Abbildung7A) Zugriff auf die Vena facialis in der Nähe die vena orbitalis posterior.
4. Punktieren Sie die Gesichtsvene unter dem rechten Auge und über dem Oberkieferrücken, beginnend zwischen 1-2 mm zurück von der Mittellinie des Auges (Abbildung 7A).
   HINWEIS: Bei kleineren Fröschen (unter 20 g) bewegen Sie die Einfügemarke näher an eine Position direkt unter der Mittellinie des Auges.
5. Winkeln Sie das Mikrohematokritrohr nach unten, um die Schwerkraft zu ermöglichen, um das Blut in das Rohr zu fließen. Blut sollte unmittelbar nach der Punktion fließen (Abbildung 7B,C).
6. Beim ersten Anzeichen des Blutflusses, legen Sie die Spitze der Mikrohämatokrit-Röhrchen an der Punktionsstelle und sammeln 1-2 volle Mikrohämatokrit-Röhren von Blut und legen Sie Tuben in geeignete Behälter für die Sammlung (Abbildung 7B,C).
7. Wenn das Blut nicht leicht fließt oder das Volumen sehr gering ist, verschieben Sie das Einsetzen der Nadel leicht oder setzen Sie die Nadel in die andere Seite des Gesichts ein.
8. Stoppen Sie das Bluten, indem Sie Gaze mindestens 20 s lang fest an die Punktionsstelle drücken.
9. Lassen Sie Frosch für 10 Minuten aus dem Wasser, um zu bestätigen, dass die Punktionsstelle nicht wieder öffnet.
10. Verwenden Sie eine neue Nadel und neue Mikrohämatokrit-Röhren für jeden Frosch, der beprobt wird.

3. Hormoninduktion

1. Hormonzubereitung
   1. Bereiten Sie Hormoninjektionen unmittelbar vor der Verwendung, um maximale Wirkung zu gewährleisten.
   2. Wählen Sie ein Hormon aus der in Tabelle 1aufgeführten Auswahl aus.
   3. Bestimmen Sie die Konzentration des Hormons, das mit einem Körpergewicht von¹⁶injiziert werden soll.
   4. Verdünnen Sie das Hormon in einem der folgenden Punkte: Wasser, Phosphat gepufferte Salzsäure (PBS), Salzamphibien-Ringer-Lösung (SARS) oder Salzlösung.
   5. Nicht mehr als ein Injektionsvolumen von 200 l für Frösche mit einem Gewicht von 30-70 g und 300 l für Frösche mit einem Gewicht von 80-110 g (persönliche Beobachtung)¹⁶.
   6. Für den korrekten Halt eines Tieres während der Hormonverabreichung eines Tieres im Bereich von 10-100 g, verwenden Sie eine der geeigneten Haltungsmethoden gemäß Abschnitt 1.1.
2. Anurans
   1. Berechnen Sie die pro Person erforderliche Konzentration mit einem Gramm pro Körpergewicht (g/Körpergewicht).
   2. Kurz vor der Verabreichung in einem sterilen Verdünnungsverdünnungsmaterial der Wahl rekonstituieren.
   3. Stellen Sie sicher, dass vor der Injektion keine Blasen in der Spritze verbleiben.
   4. Halten Sie das Tier sicher in der nicht-dominanten Hand und verabreichen Sie die Injektion mit dominanter Hand.
   5. Verabreichen Sie Injektion nach Hormon-Spezifikationen. Die häufigsten Injektionen bei Anuranen sind subkutane, intraperitoneale oder intramuskuläre (Abbildung8).
   6. Verabreichen Sie IP-Injektionen im unteren Teil des Bauches oder im unteren Teil der Rückenseite des Körpers in der Nähe des Hinterbeins (Abbildung 9).
   7. Intramuskuläre Injektionen vorzugsweise in die Hinterbeine verabreichen.
3. Caudates (Necturus)
   1. Rekonstituieren Sie das Hormon der Wahl in sterilem Wasser nach dem oben beschriebenen Gramm pro Körpergewicht Methode.
   2. Verwenden Sie bei Necturus Dosen von 1,7-2,3 g GnRH/g Körpergewicht.
   3. Necturus aus der Anästhesiekammer entfernen und auf eine 45°-Oberfläche legen, die mit chirurgischem Vorhang bedeckt ist.
   4. Positionieren Sie das Tier mit dem Nachuntenkopf.
   5. Nähern Sie sich hinteren Quadranten des Bauches (Kaudal des hinteren Beins) in einem 15-20° Winkel. Achten Sie darauf, keine Luft in die Spritze zu bringen.
   6. Injektion (IP) mit einer Insulinspritze und einer 27-30 G Nadel.
   7. Injizieren Sie das Hormon mit einer Insulinspritze und 27-30 G Nadel.

4. Chirurgie

1. Allgemeine chirurgische Präparation und -prozedur
   1. Um aseptische Verfahren aufrechtzuerhalten, verwenden Sie klare sterile Kunststoffvorhänge, um chirurgische Stellen zu isolieren. Reduzieren Sie die Verdunstung, indem Sie die umgebende Haut feucht halten.
   2. Befeuchten Sie alle Materialien, die die Haut des Tieres mit sterilem Wasser kontaktieren. Machen Sie Hautschnitt mit einer Zahl 15 oder Nummer 11 Skalpellklinge.
      HINWEIS: Eine Kombination aus kalter Stahl, Radiochirurgie oder Diodenlaser. Hämostase in mildem hämorrhagischem Verfahren kann durch Elektrokauter oder Diodenlaser erreicht werden.
   3. Verwenden Sie Baumwollspieße oder Applikatoren, um die Anwendung von lokalisiertem Druck auf kleine Gefäße zu ermöglichen, die den Blutverlust verfolgen.
   4. Verwenden Sie Baumwoll-Spitzen-Speere oder Applikatoren, um kleine enge Räume anstelle von Standard-Gaze-Quadrate zu verwalten.
   5. Verwenden Sie Mikroinstrumente, wie ophthalmologische Instrumente, mit feinen, kleinen Spitzen, wenn Sie Operationen an Tieren mit einem Gewicht von weniger als 1 kg durchführen.
   6. Verwenden Sie kunststofffreie, selbsterhaltende Retraktoren (z. B. Lone Star Retractor), um verschiedene Schnittgrößen zu passen.
   7. Verwenden Sie Augenlid-Retraktoren zum Einziehen von coelomischen Schnitten.
   8. Verwenden Sie Vergrößerungsinstrumente, wenn dies für die Durchführung von Operationen an kleineren Patienten erforderlich ist.
      HINWEIS: Analgesie ist bei jedem chirurgischen Eingriff bei Amphibien erforderlich. Das Versäumnis, während der Operation eine angemessene Analgesie zu verabreichen, wurde mit einer verzögerten Rückkehr normaler Funktionen in Verbindung gebracht. Darüber hinaus potenziert Analgesie die Wirkung von Anästhetika (Tabelle 3)³⁴.
2. Anurans
   1. Sobald X. laevis wie in Schritt 1.5.1 beschrieben betäuben wurde, positionieren Sie das Tier in dorsaler Rekonnuscy (Abbildung 10A,C).
   2. Bereiten Sie das chirurgische Feld aseptisch durch Wischen feuchte sterile Gaze mit verdünnter Povidon-Jod-Lösung (1/10) an der Stelle für 10-15 s oder 0,75% Chlorhexidin-Lösung auf der chirurgischen Stelle für mindestens 10 min vor der Operation³⁵.
   3. Machen Sie einen 3 mm paramedianen Hautschnitt im mittleren Coelom (zwischen den Schultern und der Kloake) mit einem kräftigen Strich, der einen sauberen Schnitt mit einem Skalpell Nr. 15 oder Nr. 11 hinterlässt.
      HINWEIS: Man kann einen Diodenlaser auch für Hauteinschnitte verwenden.
   4. Elevate die Bauchmembran, machen und inziszieren und seziert sorgfältig mit einem Skalpell Nr. 15 oder Nr. 11. (Abbildung 10B,D).
   5. Ziehen Sie die koelomischen Einschnitte mit Augenlid-Retraktoren (oder einer geeigneten Ausrüstung) zurück.
   6. Verbrauchen Sie eine Portion Eimasse, ohne Blutgefäße zu ligieren.
   7. Für eine vollständige Ovariektomie, kauterisieren umgebende Blutgefäße durch Elektrokauterie oder Laserdiode (Abbildung 11).
   8. Schließen Sie mit Monofilament-Nähten den Celiotomie-Schnitt mit einem unterbrochenen, immerwährenden Nahtmuster.
3. Caudates
   1. Einmal A. mexicanum wurde betäuben, legen Sie es in der rechten seitlichen Recumbency, mit dem linken Becken Glied einfach gegen die Schwanzbasis platziert.
   2. Bereiten Sie das Operationsfeld aseptisch vor, indem Sie feuchte sterile Gaze mit verdünnter Povidon-Jod-Lösung (1:10) auf der Stelle für 10-15 s. Alternativ verwenden Sie sterile Gaze in 0,75% Chlorhexidin-Lösung getränkt und auf der chirurgischen Stelle für mindestens 10 min vor der Operation (Abbildung 12A)^36,37 .
   3. Zeichnen Sie eine Linie zwischen der Schulter und den Hinterbeinen, um den Körper in drei gleiche Teile zu teilen (Abbildung 12B).
   4. Machen Sie die Einschnittstelle zwischen dem zweiten und dritten Teil.
   5. Greifen Sie den zugrunde liegenden Muskel und heben Sie sich von der koelomischen Viszera ab.
   6. Zwingen Sie kleine Hämostate sanft durch die koelomische Muskulatur und in die koelomische Höhle.
   7. Ziehen Sie die koelomischen Einschnitte mit Augenlid-Retraktoren (oder einem geeigneten Material) zurück (Abbildung 12C).
   8. Für eine vollständige Ovariektomie, kauterisieren umgebende Blutgefäße durch Elektrokauter oder Laserdiode (Abbildung 12D).
   9. Schließen Sie mit Monofilament-Nähten den Celiotomie-Schnitt mit einem unterbrochenen, immerwährenden Nahtmuster.

Ergebnisse

Morphometrie und Reproduktion

Die Visualisierung des weiblichen Fortpflanzungsstatus bei Amphibien variiert je nach Art. Die effektivste Methode ist Ultraschall; einige Arten können jedoch unterschiedliche Transparenzen ihrer Haut aufweisen (Abbildung 13A,B,C). Die visuelle Inspektion kann oft die Unterschiede zwischen einem gravid und nicht gravid Weibchen deutlich veranschaulichen, wenn die Haut halbtransluzent ist, wie in N. alabamensis und N. maculosus beobachtet (Abbildung 13A,B); oder transluzent, wie durch den Glasfrosch illustriert (Abbildung 13C). Die dunkel gefleckte Hautfärbung am Bauch von N. beyeri verbietet diese Beurteilung. In R. muscosaist die Haut nicht lichtdurchlässig, aber spürbare Unterschiede können zwischen Weibchen festgestellt werden, die gravid sind, verglichen mit denen, die vor kurzem oviposited haben, weil die Haut schlaff ist, und das Tier sieht dünner (gelbe Linie) im Vergleich zu einer weiblich, das gravid ist (blaue Linie) (Abbildung 13D). Mit Erfahrung kann sich der Handler mit dem Unterschied zwischen einem großen Weibchen und einem gravid vertraut machen, aber die Bestätigung des Gravid-Stadiums erfordert Ultraschall. Körpermassenindizes in Amphibien können mit einer Reihe von Formeln berechnet werden, aber ihre Anwendung als Prädiktor für die Reproduktion ist fraglich. Im Fall von R. muscosableibt die Korrelation zwischen Fultons Index, Gesundheit und Fortpflanzungsstatus unklar.

Fortpflanzungsverhalten und Ultraschall

Unsere Ergebnisse zeigen, wie man reproduktives Verhalten in R. muscosa für die Vorhersage der Oviposition charakterisiert (Abbildung 4). Mehrere Stadien von ein paar Stunden bis mehrere Wochen dauern gehören, umzuwerben, wo ein Männchen aktiv jagt ein Weibchen (Abbildung 4A), die männlichen Reittiere und fest auf dem Rücken des Weibchens, als Amplexus bezeichnet (Abbildung 4B). Einmal amplexed, kann das Paar in Amplexus für 1 - 5 Wochen bleiben und das Paar wird andere Verhaltensweisen zusätzlich zu Amplexus zeigen. Amplexus ist ein sehr aktives Verhalten, das das männliche Drücken des Weibchens in einer weichen Pump-Manier umfasst (Abbildung 4C); das Weibchen, das sich bewegt und beginnt, zeitweise Handstandverhalten anzuzeigen (Abbildung 4D,E); und näher an der Zeit der Eileiter, wird das Weibchen, in einem Hand-Stand, an Oberflächen lehnen, die sie Eier aufkleben kann, während das Männchen ihren Bauch kräftig pumpt (in diesem Fall ist es auch möglich, das Weibchen zu beobachten, wie sie ihren Bauch von unten nach unten reiben. Ihr Arm rast in Richtung der Kloake. Dies kann ein mechanischer Weg sein, mit dem Eier die Eileiter nach unten drücken) (Abbildung 4F,G).

Diese Studie zeigt, wie Ultraschall Informationen liefern kann, mit denen der Fortpflanzungsstatus bei weiblichen R. Muscosa und Necturus festgestellt werden kann. Vier Entwicklungsstufen sind in R. muscosa (Abbildung 5C, D,E,F) dargestellt und in Necturus⁴ (Abbildung6A,B,C ) ähnlich charakterisiert. Darüber hinaus können Resteier nicht ausgewiesen werden, was zur Eibindung führt (Abbildung 5G, Abbildung 15A,B). Stufe 1 zeigt einen Eierstock direkt nach der Eileiter, wo Follikel schwer zu visualisieren sind (Abbildung 5C). Stufe 2 wird durch das Auftreten von echogenen Punkten (weiße Flecken) dargestellt, die über den Eierstock verteilt sind (Abbildung 5D). Stufe 2 und 3 werden durch größere, abgerundete echogene Punkte mit dunklen Zentren dargestellt, die gejochte mittlere bis große Follikel darstellen (Abbildung 5E,F). Von 2013 bis 2017 wurden die gefangenen Weibchen Necturus monatlich mit Ultraschall untersucht. Während jeder Prüfung wurde den Personen eine Notennote nach den für die Gattung festgelegten Reproduktionskriterien zugewiesen (Tabelle 2). Der Anteil der Weibchen, die jedes Jahr neue Eier entwickeln, betrug durchschnittlich 88,2 bis 3,01 % (Tabelle5). Während die Eientwicklung hoch war, war die Oviposition nicht gewährleistet (Abbildung16). Die Mehrheit der Weibchen, die Oviposition unterzogen ablagerungen die volle Ergänzung der Eier, während einige Personen nur einen Bruchteil der Eier, die entwickelt. Die R. muscosa und Necturus Weibchen mit zurückgehaltenen Eiern gleichzeitig mit Flüssigkeitsgewinn in der Körperhöhle wurden nach außen optisch mit roten Flecken auf der Haut entsprechend geplatzten Blutgefäßen vergrößert (Abbildung14A,B ) . Der Grad der Flüssigkeitsretention konnte weiter mittels Ultraschall beurteilt werden (Abbildung 15B). Bei beiden Arten wurden zurückgehaltene Eier atresien oder erhielten ein echogenes aussehendes Aussehen (Abbildung14C, D, Abbildung 15A).

Hormon-Administration

Je nach Tiefe der Injektionsart variieren Winkel und Tiefe der Nadel. Für die meisten Injektionen muss die Tiefe der Nadel bei der Arbeit mit Arten wie R. muscosa nicht mehr als 1 -2 mm tief sein, sondern variiert im Eindringwinkel. Prostaglandin-Injektionen erforderten eine intramuskuläre (im) Nadeleinfügung um 90°, in das Hinterbein von R. muscosa, während intraperitoneale (ip) Injektionen mit einer ähnlichen Tiefe wie intramuskuläre Injektionen im Bereich der koelomische Kavität bei 45° (Abbildung 10). Die Verabreichung von Amphiplex hatte keine signifikante Auswirkung auf die Erhöhung der Anzahl der von hormonbehandelten Weibchen abgelagerten Eier im Vergleich zu Kontrollen (P = 0,547), noch gab es Unterschiede in der Anzahl der Embryonen, die spalteten (P = 0,673) oder überlebten kauern (P = 0.629) (Tabelle 4). Im Allgemeinen ging der Anteil der weiblichen Ovipositing von 80 % im Jahr 2011 auf 28 % im Jahr 2014 zurück. Die Zahl der weiblichen Ovipositing im Jahr 2015 war deutlich höher als 2013 (P = 0,0002), 2013 (P = 0,0001) und 2014 (P = 0,0026), aber nicht 2011 (P = 0,0885), was die Idee bestätigt, dass Weibchen dieser Art nicht jährlich brüten dürfen und dass hormonelle Protokolle refi nement. Bei R. Muscosa-Weibchen mit Anzeichen einer Eiretention hatten intramuskuläre Injektionen von PGF_{2 eine} Erfolgsrate von 60 % bei der Induktion der Vertreibung von degenerierenden Eiern. Bei einem der 5 injizierten Weibchen reichte PGF_{2 jedoch} nicht aus, um eine vollständige Ausweisung zu verursachen, und einige Eier blieben bis zur folgenden Brutzeit im Weibchen. Siebzehn Necturus-Weibchen erhielten LHRH/(GnRH) und 13 erhielten eine Scheininjektion von sterilem Wasser, um als Kontrolle dienen zu können (Tabelle 5). Insgesamt wurden sieben weibliche Necturus (n = 4 Alabamensis, n = 2 beyeri, n = 1 maculosus) elf volle Kupplungen, die sowohl gnRH behandelten (n = 6) als auch Kontrollpersonen (n = 5) zugeschrieben wurden, oviposit. Drei Weibchen (n = 2 beyeri, n = 1 maculosus) oviposited fünf Teilkupplungen (Abbildung 13). Dieses Phänomen schien nicht mit einer exogenen Hormonbehandlung in Verbindung gebracht zu werden, da drei Kontrollweibchen in ähnlicher Weise Teilkupplungen ablagerten (Tabelle 5). Die Oviposition erfolgte über einen Zeitraum von 37 Tagen (3/31-5/7) über einen Zeitraum von fünf Jahren (Tabelle5). Es gab keinen Unterschied (P = 0,194) bei den Ovipositionsraten zwischen den behandelten LHRH/GnRH (41 x 13,08 %, Bereich 17-67%) und Steuerung (66,75 bis 11,79 %, Bereich 50-100%) Frauen. LHRH/GnRH behandelte Weibchen legten Eier durchschnittlich 7,44 bis 1,41 (Bereich 3-13) Tage nach der Injektion ab. Angesichts der vollständig aquatischen Natur der Art und der Unfähigkeit, sich manuell ohne Anästhesie zurückzuhalten, war es notwendig, vor der Durchführung von IP-Hormoninjektionen ein angemessenes Sedierungsniveau zu gewährleisten (siehe Abschnitt 3.2 für Anweisungen zur Anästhesie).

Blutentnahme, Anästhesie und Chirurgie

Die Blutentnahmetechnik in diesem Artikel wurde von Forzan et al. 2013¹⁰ genommen und hat sich als eine effektive Möglichkeit erwiesen, Blut von R. muscosa mit minimaler Invasivität und Stress zu sammeln. Mit Mikrohämatokrit-Röhrchen können ca. 35-45 l Plasma oder Serum pro 70 l Vollblut gesammelt werden (Abbildung 7). Das maximale Sammelvolumen in R. muscosa betrug 1 vollständiges Mikrohematokritrohr pro 10 g Frosch, bis zu 4 Tuben pro Frosch für Frösche 40 g und größer. Dies war ein konservatives Sammelvolumen von 0,7 ml pro 100 g, 70% der maximalen Empfehlung von 1,0 ml pro 100 g (angepasst von Allender und Fry, 2008)¹³.

Anästhesie und Chirurgie bei Amphibien werden selten berichtet, aber es ist wichtig zu beachten, dass Dosen und Wirksamkeit in einer artspezifischen Weise variieren. In Bombina orientalis zum Beispiel hat MS222 eine sehr geringe Wirkung, auch bei hohen Dosen (1 g/L), während bei Boreal-Kröten Anaxyrus boreasboreas, 1 g/L schnell (Materie von Minuten) und langlebig (3+ h) (Calatayud, persönliche Beobachtung). In R. muscosa, Anästhesie erfordert Dosen für A. boreas boreas gemeldet und hat ähnliche Wirkung und Erholungszeiten. Fasten von Amphibien vor der Anästhesie ist in der Regel nicht erforderlich, da ihr Kehlkopf auch unter Vollnarkose fest verschlossen bleibt. Wenn dies jedoch für notwendig erachtet wird, insbesondere wenn das Anästhesieverfahren eine celomische Operation umfassen soll, können die Tiere 24 h vor der Anästhesie gefastet werden.

Während der Operation ist der Rechtereflex der primäre Indikator dafür, dass das Tier beästhetisiert wurde. Der Rechtereflex ist die Fähigkeit und der Grad der Leichtigkeit, mit der ein Tier in eine aufrechte Position zurückkehren kann, nachdem es auf dem Rücken platziert wurde. Der Verlust des Reflexes deutet auf ein leichtes Stadium der Anästhesie hin. Eine chirurgische Ebene wird durch verlustbaren Entzugsreflex angezeigt, der ein leichtes Ziehen an der Gliedmaße beinhaltet, um es zu begradigen, und das Tier kann es nicht mehr einziehen⁷. Die Fortpflanzungschirurgie hat keine überwältigenden Hindernisse und Amphibienpatienten heilen überwiegend gut tolerierenden Blutverlust mehr als höhere Wirbeltiere. Die Operation sollte schnell und etwa 15 Minuten von Anfang bis Ende dauern. Die Schritte sollten ungefähr wie folgt getimt werden: <1 Minute für den anfänglichen Schnitt und <2 Minuten für Celiotomie und Retraktoreinfügung, < 2-3 Minuten für die Isolierung pro Eierstock und <1 Minute für Gefäßnaht oder Kauterisierung und Hautnaht < 4 Minuten. Die gesamte Erholungszeit nach der Operation mit MS222-Protokollen beträgt ca. 45 Minuten, kann aber artspezifisch sein. In A. boreas boreas und R. muscosa können die Erholungszeiten länger sein, bis zu 1 – 2 h. Bei der Durchführung der Operation ist darauf zu achten, dass die Lunge, der Magen-Darm-Trakt oder eine verdorrende Blase nicht durchkreuzt werden und nicht die makrokopischen Drüsen, Lymphherzen und Blutgefäße, insbesondere die mittelventrale Vene, beschädigen. Je nach Jahreszeit kann das Vorhandensein großer Fettkörper die Visualisierung anderer Organe erschweren. Einmal sichtbar wach, werden die Reaktionen eines Tieres auf die Gliedmaßenstimulation, wie z. B. Widerstand gegen eine sanfte Dehnung einer Hinterbein oder blinkend, wenn der Bereich um das Auge stimuliert wird (persönliche Beobachtung), als Entzugsreaktionen klassifiziert. Der Richtigereflex zusammen mit anderen Erholungsindikatoren, einschließlich, die Rückzugsreflexe und gular Bewegungen, sind wichtige Indikatoren für die Erholung.

					verwaltung
Allgemeiner Name	Spezies	hormon	verfahren	Grundiermasse	Priming-Dosis gemeldet	Anzahl der Grundierungsdosen	Timing (Hhr vor der eikutorischen Dosis)	Verbindung(en) zur endgültigen Ovulatorium/Oviposition verabreicht	Dosen	verweis
Puerto Rican Crested Kröte	Peltophryne-Lemur	GnRH & hCG	Ip	Hcg	1.5 I.E./g	2	hCG - 48	GnRH; hCG; GnRHa + hCG	0,2 g; 4 I.E.; 0,5 g + 4 I.E.	Calatayud et al. unveröffentlicht
Berggelbbeinfrosch	Rana muscosa	Amphiplex	Ip	GnRHa (des-Gly10, D- Ala6, Pro-NHEt9-GnRH)	0,4 g/g	1	24	GnRH + MET	1 x 0,4 g/g + 10 g/g	Calatayud et al., 2018
		PGF2	IM	PGF2	5 ng/g	1	48	PGF2	5 ng/g
Südliche Rocky Mountain boreal Kröte	Anaxyrus boreas boreas	hCG, GnRH	Ip	Hcg	3.7 I.E./g	2	96, 24	hCG + GnRHa	13,5 I.E./g + 0,4 g/g	Calatayud et al., 2015
Nördlicher Cricketfrosch	Acris crepitan	Amphiplex	Wasser (10 ml)	nichts	nichts	0	Na	GnRH + MET	0,17 g + 0,42 sg / l	Snyder et al., 2012
Nördlicher Leopardenfrosch	Lithobates pipiens	Amphiplex	Ip	nichts	nichts	0	24	GnRH + MET	1 x 0,4 g/g + 10 g/g	Trudeau et al., 2010
Argentinischer Hornfrosch	Ceratophyrs ornata	Amphiplex	Ip	nichts	nichts	0	24	GnRH + MET	1 x 0,4 g/g + 10 g/g
Cranwells gehörnter Frosch	Ceratophrys cranwelli	Amphiplex	Ip	nichts	nichts	0	24	GnRH + MET	1 x 0,4 g/g + 10 g/g
Amerikanischer Bodenfrosch	Odontophrynus americanus	Amphiplex	Ip	nichts	nichts	0	24	GnRH + MET	1 x 0,4 g/g + 10 g/g
Dusky Gopher Frosch	Rana sevosa	hCG, GnRH	Ip	Hcg	3.7 I.E./g	2	96 , 24	GnRH + hCG	1 x 0,4 g/g + 13,5 I.E./g	Graham et al., 2018
Gemeinsame Coqui	Eleutherodactylus coqui	Fische, Vogelarten, Säugetiere & GnRH (D-Ala, des-Gly, eth LHRH), hCG	Sc	mLHRH;  aLHR; fLHRH; GnrHa; Hcg	nichts	0	Na	mLHRH;  aLHR; fLHRH; GnrHa; Hcg	7 g, 33 g; 28 g; 7 g, 20 g; 5, 10, 15, 20 g; 165 I	Michael et al 2004
Gunthers Kröte	Pseudophryne guentheri	GnRH		Gnrha	0,4 g/g	1	26	GnRHa mit oder ohne Primzahl	0,4 g/g	Silla 2010
Corroboree Frosch	Pseudophryne corroboree	Lucrin	Sc	Lucrin	1 g	1	26	Lucrin	5 g	Byrne & Silla, 2010
Nördlicher Corroboree-Frosch	Pseudophryne pengilleyi	GnRHa GnRH (D-Ala, des-Gly, eth LHRH)	danke	nichts	nichts	0	Na	Gnrha	0,5 -2,0 g/g	Silla et al., 2017
Gulf Coast Waterdog	Necturus beyeri	[des-Gly10, D- Ala6]-LhRH-RH Ethylamidacetat Salzhydrat	Ip	nichts	nichts	0	Na	LHRH	100 g / 500 l	Stoops et al., 2014
Südlicher Glockenfrosch / knurrender Grasfrosch	Litoria raniformis	des-Gly10, D- Ala6-[LHRH]	Sc	nichts	nichts	0	Na	des-Gly10, D- Ala6-[LHRH]	50 g	Mann et al., 2010
Fowler-Kröte	Anaxyrus fowleri	GnRH, hCG, P4	Ip	Hcg	3.7 I.E./g					Browne et al., 2006
Axolotl (Mexikanischesalamander)	Ambystoma mexicanum	Follikel-stimulierende Hormone	IM	nichts	nichts	0	Na	Fsh	400IU	Trottier und Armstrong, 1974
Afrikanischer Krallenfrosch	Xenopus laevis	hCG & P4	zugesetztes Wasser; Ip	PMSG, hCG						Marcec , 2016
Tigersalamander	Ambystoma tigrinum	hCG, LH
Wyoming Kröte	Anaxyrus baxteri	hCG, GnRHa, P4	Ip	hCG + GnRHa	100 I.E. + 0,8 g	1	72	hCG + GnRHa	100 I.E. + 0,8 g	Browne et al., 2006
Nördlicher Leopardenfrosch	Lithobates pipiens	Pituitary-Extrakt (PE), P4, Testosteron (T), Corticosteron [C], Amphiplex, Domperidon (D)	SC, IP	nichts	nichts	0	Na	PE, PE+T, PE+P4, PE+C; Amphiplex, GnRH + D	100 I.E. (LHRH) in 1 ml; PE+0,002 g/l; PE+0,01mg/50ml; PE+0,1mg/50 ml; 0,4 g/g + 10 g/g;  0,4 g/g + D	Wright, 1961; Fort, 2000; Trudeau et al., 2013
Gemahlener Frosch	Lymnodynastes tasmeniensis	Hypophysenextrakte, hCG, GnRHa, PZ	Ip	Gnrha	0,9-1,2 g/g + PZ 10 g/g	1	20	PE; PE + hCG; GnRH + PZ	PE vol; PE vol + 100 I.E. hCG; GnRH (0,9-1,2 g/g) + PZ (10 g/g)	Clulow et al., 2018
Grüner und Goldener Glockenfrosch	Litoia aurea	GnRH	Ip	Gnrha	10 g	1	72	GnRHa + hCG	20 g + 300 I.E.	Clulow et al., 2018
Great Barred Frosch	Mixophyes fasciolatus	hCG & PMSG	Sc	PMSG, hCG	50 I.E. & 25 I.E.; 1x100 I.E.	2; 2	PMSG-144 & 96;  hCG-24	Hcg	100IU	Clulow et al., 2012
Weitere Hormonprotokolle und Arten finden Sie unter Wright und Whitaker, 2001

Tabelle 1: Amphibienarten und einige der auf ihnen getesteten exogenen Hormone, wie in der Literatur berichtet. Humanes Choriongonadotropin (hCG); Gonadotropin-Releasing-Hormon (GnRH); Lutenizing Hormon-releasing Hormon (LHRH); die Buchstaben m, a und f "Säugetier", "Vogel" und "Fisch" darstellen; schwangere Stute Serum Gonadotropin (PMSG); Progesteron (P4); Follikel-stimulierendes Hormon FSH); Hypophysenextrakt (PE); Testosteron (T); Corticosteron (C). Dopamin-Antagonisten aufgeführt sind: Domperidon (D); Pimozid (P); Metoclopramid (MET). Amphiplex ist der Name einer Verbindung, die aus GnRH und Metoclopramid27 besteht. Lucrin ist ein kommerziell erhältlicher GnRH-Agonist mit dem Wirkstoff Leuprorelinacetat. ^{4 , 7 , 17 , 18 , 19 , 20 , 26 , 27 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 , 44 , 45}

grad	Reproduktionsstatus	beschreibung
0	Nicht gravid	Keine Eier sichtbar.
1	Frühe Gravid	Eier sichtbar (1-2mm in der Größe) keine deutliche echogene Linie mit Ei verbunden.
2	Mid gravid	Eier 2-3mm in der Größe, verschiedene echogene Linie(n) mit jedem Ei verbunden.
3	Späte Gravitation	Eier 4-5mm groß, echogene Linien noch sichtbar, deutliche Zunahme des anechoischen Aussehens des Eis.
4	Zurückgehaltene Eier	Unterschiedliche Grade von echogenem Material in der inneren Eistruktur vorhanden, nehmen amorphe Form an. Einige können sehr echogen werden und mit Flüssigkeitsretention in der Körperhöhle verbunden.

Tabelle 2: Benotungssystem zur Bewertung des Fortpflanzungszustands von Rana muscosa durch Ultraschall.

medikament	Dosierung und Route	Kommentare - Referenz
Buprenorphin	50 mg/Kg (intracelomisch)	Experimentelle Studie in einem östlichen rotfleckigen Newt (Notophthalmus viridescens). Analgesie sollte vor der Operation gegeben werden. (Koeller, 2009)
Butorphanol	1 – 10 mg/Kg (IM oder intracelomisch)	Es gibt verschiedene spezifische Verantwortliche. Es wird empfohlen, bei 1 mg/kg zu beginnen.
Butorphanol	0,5 mg/L (Bad)	Experimentelle Studie in einem östlichen rotfleckigen Newt (Notophthalmus viridescens). (Koeller, 2009)
Fentanyl	1 mg/kg	Analgesia > 4 h, antagonisiert von Naltrexon (Stevens, 1997)
Meloxicam	0,1 bis 0,2 mg/kg (IM)	(Minter, 2011)

Tabelle 3: Protokolle für Analgesie bei Amphibien.

	Rana muscosa
jahr	2014	2015
Nr. ♀	18	18
Eierentwicklung	61%	94%
Kontrolle ♀	4	6
Amphiplex ♀	4	7
Durchschnittlicher Tag nach Amphiplex zu oviposit	10,5	10,9
Ovipositionsrate (Amphiplex)	22,20%	33,33%
Ovipositionsrate (Steuerung)	22,20%	38,88%

Tabelle 4: Vergleich der Reproduktionsparameter zwischen amphiplex behandelten Rana muscosa 2014 und 2015.

Necturus sp.
jahr	1	2	3	4	5
Nr. ♀	6*	7	7*	7*	7*
Eierentwicklung	83%	100%	86%	86%	86%
LHRH ♀	3	5	3	6	0
Kontrolle ♀	2	2	3	0	6
Tag nach dem LHRH nach Oviposit	5	7	5.5 (Bereich 3 - 8)	13	k.A.
Ovipositionsrate (LHRH)	60%	20%	67%	17%	k.A.
Ovipositionsrate (Steuerung)	50%	50%	100%	k.A.	67%
* n=1 ♀ keine Eientwicklung

Tabelle 5: Vergleich der Reproduktionsparameter zwischen LHRH (GnRH) -behandelt und kontrolliert (steriles Wasser) gefangenes Weibchen Necturus von drei Arten über einen Zeitraum von 5 Jahren (2012-2017).

Abbildung 1: Drei Methoden zum Halten eines Frosches. (A) Verfahren 1. (B) Verfahren 2. (C) Verfahren 3. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Morphometrische Bewertungen. (A, B) SVL/SUL (C, D). in R. muscosa und D. Necturus. (E). Größenmessung mit Bremssätteln. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Sexueller Dimorphismus zeichnet sich durch nuptiale Daumenpolster bei erwachsenen R. Muscosa-Männchen im Vergleich zu Frauen aus. (A) Weiblich (B) Männlich. Das untere Panel zeigt die Länge von männlich gegen weiblich. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Charakterisierung des Fortpflanzungsverhaltens, das zu einer Oviposition in R. muscosa führt (A) Umwerben. (B) Amplexus. (C) Männliche quetschende Hündin, während in Amplexus. (D, E) Amplexierte Hündin in einem Handstand. (F, G) Bauchkontraktionen und Eileiter. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Ultraschall an R. muscosa A-B mit Fortpflanzungsstatus nach Entwicklungsstadium⁴durchgeführt. (A, B) Ultraschall auf Rana muscosa. (C) Besoldungsgruppe 0. (D) Besoldungsgruppe 1. (E) Besoldungsgruppe 2. (F) Grad 3. (G) Grad 4 (eigepfte und zurückgehaltene Eier) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Ultraschallbilder von Necturus. (A) Besoldungsgruppe 1. (B) Besoldungsgruppe 2. (C) Eier der Klasse 3. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 7: Blutentnahme in R. muscosa. (A) Blutentnahme durch Punktieren der Vena orbitalis hinter der Gesichtsvene knapp über der Kieferlinie in der Mitte der Umlaufbahn. (B, C) Blut wird auf die Hautoberfläche freigesetzt und mit einem heparinisierten Kapillarrohr gesammelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 8: Injektionsmethoden bei Amphibien. Je nach Tiefe der Injektionsart variieren Winkel und Tiefe der Nadel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 9: Hormonelle Injektion in R. muscosa. Induktion der Oviposition durch hormonelle Behandlung bei Rana Muscosa-Weibchen mit Amphiplex intraperitoneal injiziert. Eierstöcke finden Sie in der koelomischen Höhle Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 10: Vorbereitung vor der Operation. (A) Aseptische Vorbereitung des Operationsbereichs mit verdünnter Povidon-Jod-Lösung (1/10), Trachycephalus resinifictrix. (B) Sauberer Skalpellschnitt in einem Xenopus laevis oder ,( C) Laserdiodenhautschnitt, Lithobates catesbeianus. (D) Vermeiden Sie eine Beschädigung der mittelventralen Vene Trachycephalus resinifictrix. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 11: Ovariektomie in Xenopus laevis. (A) Große Fettkörper aussetzen und bewegen, um die Eimasse aufzudecken. (B) Verbrauchen Sie einen Teil der Eimasse, ohne Blutgefäße zu ligieren. (C) Kauterisieren umgebender Blutgefäße durch Elektrokauterie für vollständige Ovariektomie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 12: Präoperative Präparation und Ovariektomie in A. mexicanum. (A) Sterile Gaze eingeweicht, 0,75% Chlorhexidin-Lösung auf die chirurgische Stelle aufgetragen (B). Eine Linie zwischen schulter- und hinterden Gliedmaßen teilt das Tier in drei gleiche Teile und der blaue Fleck markiert die Stelle beim Einschnitt. (C) Ziehen Sie die koelomischen Einschnitte mit Augenlid-Retraktoren zurück. (D) Für eine vollständige Eialisierung die umgebenden Blutgefäße durch Elektrokauterie kauterisieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 13: Visuelle Bewertung der Fortpflanzungsstadien. (A, B) Visuelle Beurteilungen des Fortpflanzungsstadiums durch halbtransluzente Haut, Necturus. (C) Transluzente Haut, Hyalinobatrachium (Glasfrosch). (D) Visuelle Bewertung von R. muscosa vor (rechts, blaue Linie) und nach der Oviposition (linke - gelbe Linie). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 14: Eibindung. (A, B) Weibliche Rana Muscosa mit schwerem Fall der Eiretention. (C) Ultraschall zeigt alte degenerierende, Eier (oben) und größere Eier (Mittel- und Bodenplatte), die im Coelom eialiert und gefangen sind. (D) Zurückgehaltene Eier, die durch manuelles Abisolieren abgerufen werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 15: Ultraschallbilder von zurückgehaltenen Eiern in Necturus, die (A) im Aussehen (Kreis) echogen wurden und mit (B) Flüssigkeitsretention in der Körperhöhle (Pfeil) assoziiert waren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 16: Prozentsatz der in Gefangenschaft gehaltenen weiblichen Necturus, die vollständige oder teilweise Kupplungen (2013-2017) im Vergleich zu denen, die nicht oviposit. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Direkte Handhabung, visuelle Beobachtung und morphometrische Maßnahmen bieten nicht-invasive Techniken und sind die ersten Bewertungskriterien zur Bestimmung des weiblichen Fortpflanzungsstadiums. Diese Studie zeigt jedoch, dass gravid Eierstöcke nicht immer zuverlässig durch Palpation identifiziert werden können. Je nach Art können Gravid-Eierstöcke manchmal visuell durch halbtransluzente (Abbildung 13A, B) oder vollständig transluzente Haut auf der ventralen Seite des Tieres ( Abbildung 13C ) erkannt werden ( Abbildung13C). Weibchen, die oviposition abgeschlossen haben, können offensichtliche Veränderungen ihres Aussehens im Vergleich zu gravid Weibchen zeigen (z. B. lose Haut und Verlust von bis zu 30% ihrer Körpermasse, Abbildung 13D). Während der Zucht zeigen Männchen und Weibchen bestimmte Verhaltensweisen, die Informationen über die Nähe zum Eisprung und die Eisprungposition liefern. Im Fall von R. muscosa Hinweise darauf, dass ein Weibchen in der Nähe von Eileiter n. Chr. beginnt mit dem Weiblichen in Handhaltung.

Die Anwendung der Ultraschalltechnologie auf Anurans und Caudates ermöglicht die Diagnose des Vorhandenseins oder Fehlens von Eiern und ob die Oviposition mit einer vollständigen oder teilweisen Freisetzung von entwickelten Eiern verbunden war. Somit bietet diese Methode eine vollständigere und genauere Bewertung des Fortpflanzungsstatus, ohne sich auf die Bestimmung des Gravid/Nicht-Gravid-Status durch eine Visualisierungstechnik zu beschränken, die durch die Transparenz der Bauchhaut oder die epidermale Konsistenz unter den die verschiedenen Amphibienarten. Ultraschall kann mit relativer Leichtigkeit und mit wenig Stress für die Tiere durchgeführt werden (Abbildung 5 und Abbildung 13) und kann verwendet werden, um Fortpflanzungszyklen zu charakterisieren und den Fortpflanzungsstatus 4 zu bestimmen. Es ist wichtig, sich mit der Art vertraut zu machen; Diese Studie zeigte jedoch, dass Necturus und R. muscosa gemeinsame Entwicklungssymptome in ihren Fortpflanzungsmustern aufweisen, was eine ähnliche Klassifizierung des Fortpflanzungsstadiums ermöglicht (Abbildung 5). Durch diese Technologie gibt es nun Beweise dafür, dass die Eientwicklung in Den gefangenen Necturus und R. muscosa hoch ist und dass beide Arten einem saisonalen Muster folgen. Obwohl die Gründe für diese Phänomene unbekannt sind und weitere Untersuchungen erfordern, ohne den Einsatz von Ultraschall, wären mehrere Bereiche der Eierstockdysfunktion, wie Eiretention und partielle Eibildung, unentdeckt geblieben. Zukünftige Anwendungen dieser Technik werden verwendet, um zu bestimmen, ob Weibchen für die Zucht in einem bestimmten Jahr ausgewählt werden sollten und ob die Oviposition vollständig ist.

Ein Blutentnahmeprotokoll, wie es in R. muscosavorgestellt wird, das sowohl wirksam ist als auch dem Tier minimale Bedrängnis bereitet, ist optimal, um Hormonprofile bei gefangenen und wild gefangenen Anurans zu untersuchen (Calatayud, unveröffentlicht). Bis heute gibt es keine Informationen über die jährlichen Hormonprofile von R. muscosa in Gefangenschaft und daher keine Erkenntnisse darüber, wie Hormone ihre Gesundheit und Fortpflanzung beeinflussen. Darüber hinaus wird das Hormonprofiling eine weitere Methode zur Verfolgung von Eierstockzyklen sein, da es sich bei den Weibchen dieser Art möglicherweise nicht um jährliche Züchter handelt. Zusammen mit Ultraschall kann die Hormonanalyse zu einer besseren Vorhersage führen, was Frauen für die Eileiter bereit sein werden. Darüber hinaus wurden im vergangenen Jahr zwei Fälle von Intersexuellen in der gefangenen R. muscosa-Population dokumentiert. Darüber hinaus wurde die Entwicklung von Daumenpolstern auf einige der älteren Gründungsweibchen festgestellt. Gründe dafür werden derzeit untersucht, aber erste Ergebnisse deuten darauf hin, dass es sich auf Veränderungen des Testosteronspiegels beziehen kann (Calatayud, unveröffentlicht). Die Unterscheidung von hormonellen Zyklen bei Frauen unterschiedlichen Alters wird uns helfen zu verstehen, warum Frauen männlich-assoziierte sekundäre Geschlechtsmerkmale entwickeln können und ob dies in einer alternden Bevölkerung zu erwarten ist.

Exogene Hormontherapie wurde verwendet, um reproduktive Dysfunktionen häufig in gefangenen Amphibien auftreten zu überwinden. Sowohl bei r. muscosa als auch bei necturus wurden in dieser Studie jedoch über einen Zeitraum von 2 bzw. 5 Jahren keine signifikanten Unterschiede in der Eioposition zwischen hormonbehandelten und kontrollierbaren Frauen festgestellt. Dies kann darauf hindeuten, dass Hormon-Verwaltungsprotokoll, Dosen, Grundierung und Hormon-Kombination verwendet war nicht ausreichend für die Art. Eine genauere Analyse der einzelnen weiblichen Fortpflanzungsgeschichten legt nahe, dass R. muscosa möglicherweise keine jährliche Züchtung erfahren, was auch für den Mangel an hormonaler Wirkung bei behandelten Weibchen verantwortlich sein könnte. Da ein bestimmter Prozentsatz der Weibchen die Zucht jedes Jahr konsequent übersprungen hat, kann das Verständnis der Natürlichen Geschichte der Art helfen festzustellen, ob ein Bedarf an exogenen Hormonen besteht und wann sie am effektivsten sein können. Die in diesem Artikel beschriebenen Verfahren können auf eine Reihe von Arten angewendet werden (Tabelle 1) und sind für Anurans zwischen 5 g und 150 g; größere Tiere können unterschiedliche Spritzen und Nadelmessgeräte benötigen. Die Lage der Injektion variiert mit einigen Hormonen, die intramuskuläre, intraperitoneale, subkutane oder intradermale Injektion erfordern (Abbildung 7).

Chirurgie zum Zweck der Ovariektomie ist eine gängige Methode, die in verschiedenen Amphibienarten verwendet wird, um Eizellen für embryologische Studien zu erhalten. Ovariektomie kann auch für die Bevölkerungskontrolle und medizinische Fragen wie Eiretention angezeigt werden. Bei partiellen Eizellen, bei denen die Eizellenernte zu Forschungszwecken durchgeführt wird, muss die Operation sicherstellen, dass das Tier reproduktiv bleibt. Die Verabreichung von PGF_{2 hat} einige Versprechen bei der Lösung der Eiretention bei der weiblichen R. muscosagezeigt. Bei mehreren Personen, PGF_2- entlockte vollständige Ablagerung von zuvor zurückgehaltenen Eiern, aber in anderen nur teilweise Ablagerung aufgetreten erfordern manuelle, um alle Eier zu entfernen. Während PGF_2' als Alternative zur Operation zur Eiretention in R. muscosadienen kann, erfordert seine Fähigkeit, ähnliche pathologische Erkrankungen bei anderen Amphibien zu beheben, eine artspezifische Validierung. Wenn ein chirurgischer Eingriff für den Anuran- oder Caudate-Patienten vorgeschrieben ist, ist es notwendig, eine angemessene Anästhesieebene sicherzustellen, bevor Schnitte vorgenommen werden. Für die Bewertung und Überwachung der normativen Induktions- und Rückforderungsreaktionen, wie in dieser Studie für jede Taxa beschrieben, sind kluge Beobachtungsfähigkeiten erforderlich. Sobald man mit der spezifischen Anatomie, einem geeigneten chirurgischen Ansatz, Hämostase, sanfter Gewebemanipulation und einem angemessenen postoperativen Management vertraut ist, stellen reproduktive Operationen keine überwältigenden Hindernisse dar.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
GE logiq Book XP and 8C-RS probe 4e10 MHz GE Medical Systems	GE medical systems	GE logiq Book XP	Ultrasound
Aloka 500 7.5mHz linear or IBEX multi-frequency (10-6mHz) micro-convex	GE medical systems	8C-RS (10 MHz)	Ultrasound probe
BD disposable U-100 insulin syringe (28-29 G needle)	Mettler Electronics Corp CA	Sonigel	Ultrasound gel (water soluble, salt-free)
Hormone
Gonadotropin releasing hormone	BACHEM	4012028	synonym: [Des-Gly10, D-Ala6, Pro-NHEt9]-GnRH acetate abbreviation: GnRH
Lutenizing hormone releasing hormone	BACHEM, Sigma-Aldrich	4033013;     L1898	synonym: Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 acetate salt; [D-Ala6}-LHRH acetate salt hydrate abbreviation: LHRH
Human chorionic gonadotropin	BACHEM, Sigma-Aldrich	4030270, 4018894; C1063, CG5, CG10	synonym: Chorionic gonadotropin-β (109-145)(109-119); Choriogonin, HCG (2,500IU, 5,000IU, 10,000IU) abbreviation: hCG
Prostaglandin 2α	Sigma-Aldrich	P40424;	synonym: (5Z,9α,11α,13E,15S)-9,11,15-Trihydroxyprosta-5,13-dienoic acid tris salt, PGF2α−Tris; abbreviation: PGF2α
Follicle-stimulating hormone	Sigma-Aldrich	F4021, F8174	synonym: porcine, sheep abbreviation: FSH
Progesterone	Sigma-Aldrich	46665;      P7556	synonym: Vetranal; P4 water soluble abbreviation: P4
Pituitary extract	na		synonym: Check papers for amphibian species derivation abbreviation: PE
Pregnant Mare Serum Gonadotropin	Prospec;       Lee Biosolutions; Sigma-Aldrich	HOR-272;    493-10; 9002-70-4	synonym: Pregnant Mare Serum Gonadotropin abbreviation: PMSG
Metaclopromide	Sigma-Aldrich	M0763	synonym: 4-Amino-5-chloro-N-[2-(diethylamino)ethyl]-2-methoxybenzamide, Methoxychloroprocainamide abbreviation: MET
Lucrin	BACHEM; Sigma-Aldrich	4033014;   L0399	synonym: Leuprorelin acetate abbreviation: Lucrin
Lutalyse	Pfizer		synonym: PGF2α - Dinoprost tromethamine abbreviation: Lut
Pimozide	Sigma-Aldrich	P1793	synonym: 1-[1-[4,4-bis(4-Fluorophenyl)butyl]-4-piperidinyl]-1,3-dihydro-2H-benzimidazol-2-one abbreviation: PZ
Amphiplex	see above		synonym: Gonadotropin releasing hormone + metoclopramide abbreviation: GnRH + MET
Ovopel	Ovopel	na	synonym: GnRHa + dopamine receptor antagonist (administered 1 pellet/ kg) abbreviation: Ovo
Ovaprim	Pentair aquatic eco-systems	Ova10	synonym: Salmon gonadotropin + domperidone abbreviation: Ova
Domperidone	Sigma-Aldrich	D122	synonym: 4-(5-Chloro-2-oxo-1-benzimidazolinyl)-1-[3-(2-oxobenzimidazolinyl)propyl]piperidine abbreviation: DOM