JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يقدم هذا المقال بروتوكول تجريبي باستخدام تقنية المسح الضوئي ثلاثي الأبعاد التي تربط بين مقياسين مكانيين: المقياس المكاني العياني للتشريح في الدماغ الكامل الذي صوره التصوير بالرنين المغناطيسي في > 100 ميكرومتر والمقياس المكاني المجهري لتوزيع الخلايا العصبية باستخدام تلطيخ الكيمياء المناعية ونظام صفيف متعدد الأقطاب وطرق أخرى (~ 10 درجة مئوية).

Abstract

الدماغ البشري، كونه نظام متعدد الدرجات، على حد سواء إشارات كهربائية مجهرية، تتدفق على الصعيد العالمي على طول حزم الألياف البيضاء سميكة، والمسامير العصبية المجهرية، ونشر على طول المحاور وdendrites. ويكمل كلا الجدولين جوانب مختلفة من الوظائف المعرفية والسلوكية البشرية. على المستوى العياني، كان التصوير بالرنين المغناطيسي هو تكنولوجيا التصوير القياسية الحالية، حيث أصغر دقة مكانية، حجم voxel، هو 0.1-1 مم3. أيضا، على المستوى المجهري، كانت الدراسات الفسيولوجية السابقة على بينة من البنى العصبية غير موحدة داخل هذه voxels. تطور هذه الدراسة طريقة قوية لدمج البيانات المجهرية بدقة في خريطة مجهرية من خلال ربط البحث العلمي البيولوجي مع التقدم التكنولوجي في تكنولوجيا المسح الضوئي ثلاثي الأبعاد. منذ 3D تكنولوجيا المسح الضوئي وقد استخدمت في الغالب للهندسة والتصميم الصناعي حتى الآن، يتم إعادة استخدامها لأول مرة لتضمين microconnectomes في الدماغ كله مع الحفاظ على الصنبور الطبيعي في خلايا الدماغ الحية. من أجل تحقيق هذا الغرض، أولا، قمنا بإنشاء بروتوكول المسح الضوئي للحصول على صور دقيقة 3D من الكائنات الحية الحية التي تشكل تحديا بطبيعتها للصورة بسبب الأسطح الرطبة والعاكسة. ثانيا، تدربنا على الحفاظ على السرعة لمنع تدهور أنسجة الدماغ الحية، وهو عامل رئيسي في الحفاظ على ظروف أفضل وتسجيل المزيد من المسامير العصبية الطبيعية من الخلايا العصبية النشطة في أنسجة الدماغ. تظهر صورتان على سطح القشرية، تم استخراجهما بشكل مستقل من وحدتين مختلفتين للتصوير، وهما التصوير بالرنين المغناطيسي والصور السطحية للماسح الضوئي ثلاثي الأبعاد، خطأ ً في المسافة لا يتجاوز 50 ميكرومتر كقيمة وضع للرسم البياني. هذه الدقة قابلة للمقارنة من حيث الحجم إلى القرار المجهري للمسافات بين الخلايا؛ أيضا، فمن مستقر بين الفئران الفردية المختلفة. هذا البروتوكول الجديد، و3D الجديدة تضمين بروتوكول متداخلة (3D-NEO)، والجسور مستويات العيان ية والمجهرية المستمدة من هذا البروتوكول التكاملي وتسريع النتائج العلمية الجديدة لدراسة بنيات الاتصال الشامل (أي، microconnectome).

Introduction

عادة ما توجد البنى متعددة الدرجات غير الموحدة في مختلف المنظمات الفيزيائية والبيولوجية1،2. الدماغ هو أيضا منظمة شبكة غير موحدة جدا ومتعددة النطاق3،4. يتم ترميز الوظائف المعرفية المختلفة في مثل هذه المنظمات الشبكة، وعقد التغيرات الزمنية لأنماط ارتفاع الكهربائية من السكان الخلايا العصبية في القرارات الزمنية submillisecond. تاريخيا، لوحظت الشبكات المعقدة بين الخلايا العصبية هيكليا بالتفصيل باستخدام تقنيات تلطيخ من قبل سانتياغو رامون y Cajal من أكثر من 150 عاما مضت5. لمراقبة السلوكيات الجماعية للخلايا العصبية النشطة، طور الباحثون تقنيات تسجيل مختلفة6و7و8، وقد مكنتنا التطورات الهامة الأخيرة من هذه التقنيات من تسجيل الأنشطة الكهربائية من أعداد كبيرة من الخلايا العصبية في وقت واحد. وعلاوة على ذلك، من هذه الأنشطة الوظيفية، نجح العلماء في إعادة بناء شبكات من التفاعلات السببية بين أعداد كبيرة من الخلايا العصبية وأعلنوا الهندسة الطوبوغرافية لتفاعلاتهم المعقدة 'microconnectome'9 . كما تسمح الملاحظات العيانية للدماغ باعتبار الدماغ بأكمله منظمة للشبكة لأن العديد من مناطق الدماغ متصلة بحزم ألياف متعددة. إن إدماج الكُمَكَمّات الدقيقة في خريطة الدماغ العالمية لا يزال له حدود واضحة ضمن التطورات التكنولوجية الحالية، وهذا هو السبب في أن بروتوكول التضمين هذا مهم جداً. ومع ذلك، هناك العديد من التحديات لتطوير بروتوكول التضمين. على سبيل المثال، من أجل مراقبة أنشطة الدوائر العصبية المحلية الحية في مناطق الدماغ المعزولة بحتة، تحتاج شرائح الدماغ إلى إنتاج للتسجيلات في المختبر. بالإضافة إلى ذلك، لا تزال التسجيلات من شرائح الدماغ للتسجيلات في المختبر خياراً هاماً لسببين على الأقل. أولا، لا يزال من غير السهل مراقبة أنشطة العديد من الخلايا العصبية الفردية الحية في وقت واحد من مناطق الدماغ أعمق من ~ 1.5 ملم وفي دقة زمنية عالية (<1 مللي ثانية). ثانيا، عندما نأمل أن نعرف البنية الداخلية للدائرة العصبية المحلية، ونحن بحاجة إلى وقف جميع المدخلات القادمة من مناطق الدماغ الخارجية للقضاء على العوامل المربكة. من أجل تحديد الاتجاهات والمواقف من شرائح الدماغ المنتجة، سيكون من الضروري كذلك لدمج المواقف المكانية لهذه شرائح الدماغ المنتجة باستخدام الإحداثيات. هناك، ومع ذلك، هناك عدد قليل من الطرق المنهجية وموثوق بها لجعل شرائح الدماغ بطريقة منظمة10،11. هنا، يتم إدخال بروتوكول جديد للتسجيل المشترك، باستخدام تقنية المسح الضوئي ثلاثي الأبعاد للبحث العلمي العصبي من أجل توفير بروتوكول تكاملي. يعمل هذا البروتوكول على تنسيق المقاييس الدقيقة والكلية وتضمين مجموعة متعددة الأقطاب (MEA) microdata12و13 وتلطيخ البيانات على مساحة التصوير بالرنين المغناطيسي العياني من خلال أسطح المسح الضوئي ثلاثية الأبعاد للعقول المستخرجة، وكذلك من العقول المسجلة غير الغازية. ومن المستغرب، وهذا أظهر خطأ المسافة من ~ فقط 50 ميكرومتر كقيمة وضع الرسم البياني. ونتيجة لذلك، كانت قيم وضع الحد الأدنى للمسافات بين سطح التصوير بالرنين المغناطيسي وسطح 3D الممسوحة ضوئيا ً حوالي 50 ميكرومتر لجميع الفئران الستة، وهو رقم مناسب عند التحقق من القواسم المشتركة بين الأفراد. وكان عرض شريحة نموذجية نشاط ارتفاع مسجل من حوالي 300 ميكرومتر.

Protocol

وقد وافقت لجنة رعاية الحيوانات بجامعة كيوتو على جميع الإجراءات التجريبية الموصوفة هنا.

1. الحيوانات (اليوم 1)

  1. إعداد الإناث C57BL/6J الفئران (ن = 6، الذين تتراوح أعمارهم بين 3-5 أسابيع).
    ملاحظة: ينطبق هذا البروتوكول على جميع أنواع القوارض.

2. إعدادات التصوير بالرنين المغناطيسي (اليوم 1)

  1. وضع الماوس في مربع التخدير الاكريليك وضعت على حصيرة سخان تعديلها إلى 37 درجة مئوية باستخدام وحدة تحكم حصيرة سخان.
  2. تخدير الماوس مع 2٪ isoflurane في الهواء تتدفق من خلال مربع بمعدل تدفق 1.4 L / دقيقة باستخدام نظام التخدير، والذي يتكون من المرذاذ isoflurane، ومقياس تدفق الهواء، وضاغط الهواء.
  3. بعد تحريض التخدير، ضع الماوس في مهد متوافق مع التصوير بالرنين المغناطيسي في وضع عرضة للإصابة. تحقق مما إذا كان التخدير كافياً عن طريق قص اصبع القدم من الماوس مع ملاقط لمعرفة ما إذا كان لا يشعر بالألم.
  4. إصلاح رأس الماوس مع شريط الأسنان وقناع الوجه مجهزة مهد. ثم، الحفاظ على التخدير مع 1٪ - 1.5٪ isoflurane في الهواء في 1.4 L / دقيقة عن طريق قناع الوجه.
  5. أدخل مسبار درجة حرارة الثيرمستور في المستقيم من الماوس ووضع جهاز استشعار التنفس حساسة للضغط على الجزء الخلفي من الماوس.
  6. نقل المهد إلى تتحمل مغناطيس التصوير بالرنين المغناطيسي. اضبط تركيز الأيسوفلوران إلى حوالي 1% −1.5% لضمان عمق التخدير المستقر والقابل للتكرار. مراقبة ما إذا كان يتم التحكم في درجة حرارة الجسم بين 33-35 درجة مئوية ومعدل التنفس بين 0.5-1.3 هرتز خلال الفترة الكاملة من تجارب التصوير بالرنين المغناطيسي، وذلك باستخدام نظام الرصد (جدولالمواد)للمعلمات الفسيولوجية للالحيوانات الصغيرة مع برامج مخصصة (جدولالمواد).
  7. باستخدام القيمة المقاسة لدرجة حرارة المستقيم، وتنظيم درجة حرارة الجسم عن طريق التحكم في درجة حرارة الهواء الدافئ الموردة في تتحمل المغناطيس من نظام سخان مجهزة في نظام الرصد.

3. عمليات الشراء بالرنين المغناطيسي (اليوم الأول)

  1. الاستعدادات لفحص التصوير بالرنين المغناطيسي 3D المرجحة T2 عالية الدقة
    1. احصل على ثلاث صور بالرنين المغناطيسي (MR) في ثلاث طائرات متعامدة (محورية وإكليلية ومترهلة) من أجل التحقق من موضع الماوس.
    2. في إشارة إلى هذه الصور، ضبط موقف الماوس عن طريق تحريك المهد بحيث يتم وضع مركز الدماغ الماوس في مركز الرنانة وكذلك في مركز لفائف التدرج في اتجاه محوري.
    3. ضبط نظام التصوير بالرنين المغناطيسي عن طريق ضبط الرنانة، وضبط تجانس المجال المغناطيسي الثابت (الالمعة) والتردد الأساسي، ومعايرة قوة التردد الراديوي (RF).
    4. احصل على صور ذات دقة منخفضة ذات 2D متعددة الشرائح T2 المرجحة (T2W) مع التوجهات الإكليلية والمترهلة. استنادًا إلى هذه الصور، حدد مجال العرض (FOV) لإجراء مسح بالرنين المغناطيسي T2W ثلاثي الأبعاد عالي الدقة.
    5. قم بإجراء التمعص المترجم باستخدام خوارزمية الشيم التلقائي FASTMAP. بالنسبة لبروتوكول FASTMAP، حدد منطقة مستطيلة تغطي الدماغ بأكمله. بعد الانتهاء من التمعّد الموضعي، تأكد من عدم تجانس الحقل B0 داخل منطقة الدماغ بواسطة طيف موضعي 1H باستخدام التحليل الطيفي (PRESS) الذي تم حله بنقطة.
    6. احصل على صور T2W ثلاثية الأبعاد منخفضة الدقة للتأكد من أن إعدادات المسح الضوئي للتصوير بالرنين المغناطيسي T2W ثلاثي الأبعاد عالية الدقة مناسبة من خلال التحقق من الموضع المناسب لـ FOV، وعدم وجود قطع أثرية ملتفة (الأسماء المستعارة)، وقمع إشارات الدهون بكفاءة.
  2. تصوير تسلسل النبض
    1. بعد الاستعدادات الموضحة أعلاه، الحصول على صور T2W عالية الدقة من الدماغ الماوس كله، وذلك باستخدام اكتساب سريع مع تعزيز الاسترخاء (RARE) تسلسل.
      ملاحظة: في هذه المقالة، أجريت تجارب التصوير بالرنين المغناطيسي على 7 T، 210 ملم تتحمل الأفقي، الماسح الضوئي قبل السريرية، ومجهزة نظام التدرج من 440 متى / م في وقت المنحدر 100 ميكروس. وقد استخدم صدى حجم رباعي يبلغ قطره الداخلي 35 مم للإثارة الراديوية واستقبال الإشارات. تم الحصول على بيانات التصوير بالرنين المغناطيسي باستخدام برنامج تشغيل مخصص. ويرد في الجدول 1موجز لبارامترات الاقتناء لتسلسل النبض النادر ثلاثي الجوانب المستخدم في هذه الدراسة.

4. إعداد الحلول التجريبية (اليوم 2)

  1. إعداد 500 مل من محلول قطع الجليد الباردة (2.5 مليون متر قدم ككل، 1.25 مل NaH2PO4،7 M M MgCl2،15 مل الجلوكوز، 25 مل NaHCO3،0.5 مليون متر CaCl2،11.6 MM أسكوربات الصوديوم، 3.1 مليون متر الصوديوم بيروفات، و 100 مليون متر كلوريد الكولين، فقاعة مع 95٪ O2 و 5٪ CO2). ضبط الـ pH إلى 7.3−7.4.
  2. إعداد 1 لتر من السائل الدماغي الشوكي الاصطناعي (ACSF؛ 127 مل حمض المتردد، 2.5 ملككل، 1.25 مليون متر شمال شرق 2 بو4،1 مليون متر من ملغ كل2،15 مليون متر من الجلوكوز، 25 مليون متر ناهكو3،و 2 مليون متر من الكلس2،فقاعة مع 95٪ س2 و 5٪ CO2). ضبط الـ pH إلى 7.3-7.4.

5. إعداد المعدات (اليوم 2)

  1. إعداد 6.6 سم2 مربع، 0.5 سم سميكة المغناطيس "حلقة"، أولا، وضع الشريط الأسود، وثانيا، الشريط الجراحي على الحلبة (الشكل1C-2). لاحظ أن هذه المادة تسمى قاعدة كتلة الدماغ (BBB)، والحفاظ عليها الباردة على كتل من الجليد.
    ملاحظة: في وقت لاحق، سيتم إرفاق الأشرطة إلى محطة تشريح مع كتل الدماغ لتهتز. يتم استخدام الحلقة المربعة كقاعدة سفلية لBBB لتلبية غرضين، وهما ترحيل كتل الدماغ بسلاسة من محطة المسح الضوئي ثلاثي الأبعاد إلى الاهتزاز وقياس بدقة ارتفاعات كتل الدماغ في خطوة المسح الضوئي.
  2. إعداد BBB مع القرص الدوار التلقائي. قم بتشغيل الماسح الضوئي والقرص الدوار. بدء تشغيل برنامج معالجة الصور.
  3. قبل جميع التجارب، إجراء معايرة الكاميرات والقرص الدوار المتصل لإسقاط الضوء المنظم والماسح الضوئي ثلاثي الأبعاد من نوع سطح المكتب.
    1. قم بتشغيل جهاز العرض المركزي والكاميرات والقرص الدوار. ثم افتح البرنامج. في البرنامج، انقر فوق الإعداد البصري وحدد منطقة الصورة كـ 100 × 80 وأرقام الشبكة 100 × 100. ثم تبدأ معايرة الكاميرا وفقًا للخطوات الأربع التالية.
      1. لإعداد جهاز العرض، ضع ورقة المعايرة على المكتب ووضع لوحة المعايرة على ورقة المعايرة لضبط نقطة التثبيت لمنطقة القياس إلى مركز الورقة والاتجاه إلى الأمام. ضبط المسافة بين جهاز العرض والمجلس إلى حوالي 200 ملم. ثم انقر فوق سهم للانتقال إلى الخطوة التالية.
      2. لتوجيه الكاميرات، تخفيف مسامير إصلاح الكاميرات اثنين أنفسهم ونقل المواقف والتناوب لتتداخل مع خط الوسط على لوحة المعايرة، والخط الرأسي، والصليب الأصفر المتوقع من جهاز العرض. إصلاح الكاميرات، وانقر فوق سهم مرة أخرى. ثم، سوف تصبح الشاشة مظلمة.
      3. لتركيز الكاميرات، بعد تخفيف مسامير تثبيت المقابض، وزيادة حساسية الضوء وضبط التركيز مرة أخرى. ثم انقر فوق سهم للانتقال إلى الخطوة التالية.
      4. بالنسبة لقيمة F ودرجة التعرض (للكاميرا)، اضبط حساسية الضوء مرة أخرى إلى ما دون المكان الذي تختفي فيه المنطقة الحمراء. ثم انقر فوق سهم مرة أخرى، وانقر فوق بدء المعايرة، واختر نعم إذا طُلب منك إنهاء الإعداد البصري؟
    2. انقر فوق تهيئة المعايرة، وتحقق مما إذا كان يتم تطبيع قيم البكسل بين 0-255. ثم انقر فوق متابعة.
    3. من خلال اتباع المواقف المقترحة، تسجيل الصور من تسع زوايا نسبية مختلفة من الماسح الضوئي ولوحة المعايرة، والانتهاء بعد تأكيد عملية المعايرة، وأخيرا، انقر فوق تحديث المعايرة.
    4. تبادل لوحة المعايرة للالقرص الدوار، وانقر على معايرة القرص الدوار.
      ملاحظة: الآن، يتم الانتهاء من جميع المعايرة.

6. مسح سطح الدماغ، تشريح، وتسجيل MEA (اليوم 2)

  1. قم بالتخدير للفأر بنسبة 1%−1.5% من الإيسوفيلوران وقطع رأس الماوس. استخدام مشرط لفتح الجلد وفضح الجمجمة.
  2. قطع فروة الرأس من الماوس التخدير على طول خياطة sagittal باستخدام سكين الجراحية، وقطع الجمجمة في اتجاهات قطري من نقطة لامدا إلى نقطة قليلا أمام بريجما باستخدام مقص الجراحية. ثم، قشر بلطف قبالة الجمجمة من الدماغ باستخدام ملاقط منحنية.
  3. استخدام ملعقة لرفع الدماغ ونقله إلى طبق بيتري (100 مم × 20 مم) مع حل قطع الجليد الباردة (أعدت في الخطوة 4.1). تدفق الهواء الذي يحتوي على 95٪ O2 و 5٪ CO2 من قنبلة غاز خارجية مع سرعة دوارة تسيطر عليها من المضخة (~ 4.0 دورة في الدقيقة) لتوليد فقاعات صغيرة في حل قطع الجليد الباردة (الشكل1a).
  4. بعد 1-2 دقيقة، ضع الدماغ على قطعة قماش من الألياف الدقيقة التي يغطي سطحها قليلا من قبل غربال الدقيق، ومسح السوائل من سطح الدماغ، وبلطف باستخدام قطعة قماش ستوكات (الشكل1ب).
  5. وضع الدماغ مع الجانب الظهري حتى على موقف عينة على BBB، وأيضا وضع BBB في مركز القرص الدوار التلقائي.
  6. قم بتعتيم الغرفة أثناء الفحص ثلاثي الدُعد وأجري فحصًا ثلاثي الدُعد على القرص الدوار. لاختبار ما إذا كان المسح الضوئي ثلاثي الدمن يعمل بشكل جيد، انقر فوق المسح الضوئي ثلاثي الدّيّس عن طريق تحديد الزاوية بين طلقتين كـ 22.5، وزاوية البداية كـ 0، والزاوية النهائية كـ 360 (الشكل1c-1).
  7. نقل الدماغ إلى طبق بيتري، وفقاعة الدماغ في حل القطع لمدة 10 ق تقريبا.
  8. قطع الدماغ إلى كتلتين في منتصف الطائرة الإكليلية باستخدام سكين الجراحية، ونقل كتل الدماغ اثنين بلطف إلى السطح المسطح باستخدام ملعقة الجراحية.
  9. قم بإرفاق كتل الدماغ من BBB باستخدام الغراء الفوري، ومسح السائل بهدوء وبعناية من سطح الدماغ في غضون 1-2 دقيقة، وذلك باستخدام قطعة قماش ستوكات مرة أخرى. ثم، إجراء فحص ثلاثي الدّي مرة أخرى (الشكل1c-2).
  10. إرفاق الشريط الأسود الذي يغطي مركز BBB إلى وسط مرحلة القطع لتهتز (الشكل1D).
  11. صب حل القطع في مرحلة القطع وتعيين مرحلة القطع على الاهتزاز. ضبط سرعة القطع والسعة. اصنع 2-5 شرائح إكليلية (سمكها 300 ميكرومتر) من كتلتي الدماغ. الحفاظ على الحل في مرحلة القطع محتدما إذا كان ذلك ممكنا (الشكل1e).
  12. قم بإرفاق شفرة بحامل شفرة الاهتزاز وتحسين سرعة القطع والتردد واتساع الاهتزاز في النظام عن طريق تعيينها على أنها 12.7 مم/دقيقة للسرعة، و87-88 هرتز للتردد، و0.8-1.0 مم لعرض التأرجح. عندما يكون القطع الدقيق ضروريًا، قم بإبطاء السرعة إلى المستوى 2-3.
  13. أثناء قطع شرائح الدماغ، سجل إحداثيات المقطع ة في الشكل، بما في ذلك الإحداثيات الأمامية الخلفية، نصف الكرة الأرضية، وغيرها من الظروف (الشكل2ج).
  14. نقل بلطف شرائح الدماغ إلى كوب مليئة prewarmed (~ 34 درجة مئوية) ACSF باستخدام ماصة بلاستيكية سميكة، واحتضانها في الكأس في ~ 34 درجة مئوية ل ~ 1 ساعة. خلال هذا الوقت، إجراء مسح ثلاثي الدمن من كتل الدماغ المتبقية على مرحلة القطع (الشكل1c-2).
  15. تعيين رقاقة MEA على وحدة تسجيل. قم بتوصيل الرقاقة بمضخة تمعجية باستخدام أنبوبين. استخدام أنبوب واحد لتوجيه نفس ACSF في رقاقة الشرق الأوسط وأفريقيا وأنبوب آخر لتوجيه ACSF للخروج من رقاقة الشرق الأوسط وأفريقيا.
  16. إرفاق اثنين من الإبر (0.60 مم × 19 مم)، متصلة في نصائح من الأنابيب اثنين، إلى الجزء العلوي من جدار رقاقة MEA، وإصلاح مواقفهم مع نصائحهم بعد الجدار الداخلي للرقاقة MEA. تعيين معدل تدفق ACSF إلى 4.1 دورة في الدقيقة.
  17. بعد 1 ساعة قد مرت، حرك شريحة على رقاقة باستخدام ماصة بلاستيكية سميكة، وتعيين الموقف باستخدام فرشاة لينة. ثم، بدء عملية تسجيل الأنشطةالعصبية (الشكل2-د).

7. تلطيخ الكيمياء المناعية (اليومين 3 و 4)

  1. بعد الانتهاء من تسجيل MEA، نقل الشرائح إلى أنابيب 1.5 مل مليئة 4٪ بارافورمالهايد (PFA) في محلول الفوسفات المخزنة المالحة (PBS). احتضانهم بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية. ثم، قم بإزالة محلول PFA 4٪، واغسل الشرائح 3x مع PBS لمدة 5 دقائق في المجموع.
    ملاحظة: إذا لزم الأمر، تضمين شرائح في 20٪ الجيلاتين / PBS واستئصال شريحة لجعلها أرق من 50 م، وذلك باستخدام الاهتزاز.
  2. إعداد محلول استرداد مستضد (10 MM سيترات الصوديوم، درجة الحموضة 6.0). إزالة PBS من الغسيل الأخير وإضافة حل استرداد مستضد.
  3. يُغلى الماء في وعاء حراري كهربائي ويحتضن الأنابيب مع الشرائح لمدة 20 دقيقة عند درجة حرارة تُعنى بـ 95-98 درجة مئوية تقريبًا في الوعاء، يليه التبريد الطبيعي.
  4. إعداد 50 m تريس المخزنة مؤقتا المالحة وإضافة 1٪ Na bisulfite (1٪ Na bisulfite-Tris الحل). ضبط الوظيفة الهيدروجينية إلى 7.5. ثم، اغسل الشرائح بمحلول Na bisulfite-Tris لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (حوالي 20-25 درجة مئوية).
  5. إعداد حل حجب عن طريق إضافة 4٪ مصل الماعز العادي و 0.5٪ أوتيلفينول ethoxylate إلى 1٪ Na bisulfite-Tris الحل.
  6. إزالة 1٪ Na bisulfite-Tris الحل من الأنابيب مع شرائح وإضافة حل حظر. الحضانة لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  7. إعداد الحل الأساسي للجسم المضاد عن طريق إضافة 1٪ مصل الماعز العادي و 0.5٪ تريتون X-100 إلى 1٪ Na bisulfite-Tris الحل والتخفيف الأجسام المضادة الأولية. استخدام التركيزات التالية من الأجسام المضادة الأولية: 1:800 من الماوس المضادة للGAD67 و 1:500 من الأرنب المضادة للNeuN.
  8. إزالة 1٪ Na bisulfite-Tris الحل من الأنابيب مع شرائح وإضافة الحل الأساسي الأجسام المضادة. احتضانه بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
  9. إعداد 50 مل تريس المخزنة مؤقتاً المالحة وإضافة 8.5 غرام / لتر حمض الكل (حل تريس-NaCl). Titrate درجة الحموضة إلى 7.5. ثم، اغسل الشرائح 3x مع حل Tris-NaCl (~ 20-25 درجة مئوية) لمدة 5 دقائق في المجموع.
  10. إعداد الحل الثاني الأجسام المضادة عن طريق إضافة 3٪ مصل الماعز العادي و 0.3٪ تريتون X-100 إلى حل تريس-NaCl والتخفيف الأجسام المضادة الثانوية. استخدام التركيزات التالية من الأجسام المضادة الثانوية: 1:500 من الماعز المضادة للماوس و 1:500 من الماعز المضادة للأرنب.
  11. إزالة الحل Tris-NaCl من الأنابيب مع شرائح وإضافة حل الأجسام المضادة الثانوية. احتضانه لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة. ثم، اغسل الشرائح 3x مع حل Tris-NaCl لمدة 5 دقائق في المجموع.
  12. ضع الشرائح على الشريحة باستخدام فرشاة صغيرة وتطبيق وسائط التركيب وغطاء. فحص الشرائح باستخدام مجهر بؤري. التقاط صور لسطح شريحة(الشكل 2ه).

8. التصوير بالرنين المغناطيسي معالجة البيانات لاستخراج وحدات التخزين القشرية

  1. تثبيت البرمجيات الحرة FSL (https://fsl.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fslwiki/FslInstallation). إعداد صور التصوير بالرنين المغناطيسي التي تم الحصول عليها في القسم 3.
  2. تغيير تنسيق الصورة باستخدام الأمر fslchfiletype NIFTI_PAIR_GZ. توسيع صورة الدماغ لجعلها كبيرة مثل الدماغ البشري باستخدام الأمر fslcreatehd، وإذا لزم الأمر، تغيير الاتجاه باستخدام fslorient مع الخيار -setqformcode 1. بعد ذلك، استرداد تنسيق الملف الأصلي باستخدام fslchfiletype NIFTI_GZ. الأمر الدقيق كما يلي.
    fslchfiletype NFTI_PAIR [صورة الإدخال].nii.gz
    fslcreatehd 144 196 160 1 0.95 0.6 1.15 0 0 0 0 0 4 [صورة الإدخال].hdr.gz
    fslorient -setqformmcode 1 [صورة الإدخال].hdr.gz
    fslchfiletype NIFTI_GZ [صورة الإدخال]
  3. اكتب fsl لفتح برنامج FSL. استخراج العقول باستخدام الأمر الرهان من واجهة المستخدم الرسومية (GUI)، ولكن لا قشر أكثر من اللازم. ثم، والسيطرة على عتبات كثافة كسور، ... تختلف القيم المثلى للبيانات الفردية.
  4. تغيير حجم صورة الدماغ إلى حجم الدماغ الماوس الأصلي، وذلك باستخدام نفس الإجراء كما هو الحال في الخطوة 8.2. الأمر الدقيق هو كما يلي:
    fslchfiletype NFTI_PAIR [صورة الإدخال].nii.gz
    fslcreatehd 144 196 180 1 0.1 0.1 0.08 0 0 0 0 0 0 4 [صورة الإدخال].hdr.gz
    fslorient -setqformmcode 1 [صورة الإدخال].hdr.gz
    fslchfiletype NIFTI_GZ [صورة الإدخال]
  5. Coregistrate جميع الصور الدماغ باستخدام الأمر المغازلة، وإنتاج صورة الدماغ متوسط باستخدام الخيار -add والخيار -div من الأمر fslmaths.
    fslmaths [صورة الدماغ 1] – إضافة ... -إضافة [صورة الدماغ N] –div N [متوسط اسم الصورة] – أودت تعويم
  6. جعل متوسط نظافة الدماغ باستخدام الخيار -thr من الأمر fslmaths. ثم حدد قيمة عتبة الأمثل التكيف مع الحالات الفردية.
    fslmaths [متوسط اسم الصورة] -thr [قيمة thr، على سبيل المثال، 5000] [صورة متوسط عتبة]
  7. وأخيرا، إعادة تشكيل صورة الدماغ متوسط في إحداثيات الفرد باستخدام الأمر المغازلة مرة أخرى. ثم، وإعداد القشرة المستخرجة نظيفة إلى حد ما (الشكل2أ).
    ملاحظة: لسوء الحظ، لن تكون لمبة الشم والمخيخ مثالية في سطح الدماغ المعاد بناؤها من وحدات التصوير بالرنين المغناطيسي بسبب القيود الأساسية لبرنامج FSL على جلجلة جميع أجزاء الدماغ بما في ذلك لمبة الشم والمخيخ.

9. التصوير بالرنين المغناطيسي معالجة الصور إلى الأسطح القشرية الشريطية

  1. تحميل آخر البرمجيات الحرة، 3D تقطيع اللحم (https://download.slicer.org/).
  2. افتح صور MR للدماغ المستخرج (انقر فوق ملف وحدد إضافةبيانات) التي تم إنتاجها وفقًا للقسم 8، باستخدام وحدات عرض وحدة التخزين والمحرر في تقطيع اللحم ثلاثي الأبعاد.
  3. تغيير الوضع من محرر إلى عرض مستوى الصوت، وانقر على زر الهدف لجعل صورة الدماغ تأتي إلى وسط الشاشة.
  4. حدد وضع MR-T2-brain وضبط العتبة عن طريق تحريك شريط Shift. ثم قم بالانتقال مرة أخرى من عرض وحدة التخزين إلى محرر ثم انقر فوق الزر تأثير عتبة.
  5. تطبيق التسمية 41. القشرة الدماغية وحفظ البيانات سطح الدماغ كملف .stl. ثم قم بتغيير تنسيق الملف من .vtk إلى .stlثم قم بحفظ الملف عن طريق التحقق من النموذج.

10. المعالجة المسبقة لبيانات المسح الضوئي ثلاثي الدناجي

  1. إجراء تسجيل مشترك تلقائي بين 8 أو 16 صورة مأخوذة من 8 أو 16 زاوية مختلفة ضمن تسلسل من المسح الضوئي لتصحيح حالات عدم تطابق صغيرة فيما بينها بالنقر فوق التسجيل العالمي المضمن في خيار المحاذاة ودمجها. تكرار المسح الضوئي من زوايا مختلفة للحصول على سطح الدماغ كله (الشكل2ب).
    1. إذا لم يكن التكامل بين الصور الممسوحة ضوئيًا من زوايا مختلفة ناجحاً، انقر فوق محاذاة يدويوحدد زوجًا من صورة ثابتة وصورة متحركة.
    2. انقر فوق ابدأ لبدء المحاذاة اليدوية للصور عن طريق تحديد ثلاث أو أربع نقاط شائعة في صور مختلفة. ثم انقر فوق موافق. خوارزمية التحسين هي خوارزمية أقرب نقطة تكرارية (ICP)10. وهو لا يتضمن تشوه غير خطي.
  2. إنشاء شبكة من جميع الصور المحاذية (أي مجموعات بيانات النقاط) عن طريق تحديد جميع الصور وعن طريق النقر على زر إنشاء الشبكة. ثم حدد الخيار كائن فني صغير للحصول على شبكة كأعلى دقة. ثم احفظ الصورة كثنائي .stl أو بتنسيق ASCII.

11. التسجيل المشترك لسطح التصوير بالرنين المغناطيسي وسطح المسح الضوئي ثلاثي الدُعد

  1. افتح سطح التصوير بالرنين المغناطيسي وادمجه مع سطح المسح الضوئي ثلاثي الدُعد باستخدام برنامج معالجة السطح. ثم قم بإجراء عملية محاذاة يدوية باستخدام نفس الإجراء كما هو موضح في الخطوتين 10.1.1 و 10.1.2. ثم احفظ هذه الصور السطحية المسجلة مرة أخرى (الشكل 2أ، ب).
    1. إذا لزم الأمر، قم بتنظيف البيانات السطحية الفردية، على سبيل المثال، عن طريق محو الضوضاء الصغيرة المحيطة بمنطقة الدماغ، وخاصة في حالة بيانات التصوير بالرنين المغناطيسي، وعن طريق ملء الثقوب إن وجدت، وخاصة في حالة بيانات المسح الضوئي ثلاثي الدودية.
  2. وأخيراً، افتح البيانات السطحية باستخدام برنامج تحليل البيانات، على سبيل المثال، MATLAB، وأنجز ويقيّم الرسوم البيانية للمسافات الدنيا بين السطحين.

النتائج

قمنا بتقييم المسافات بين الأسطح القشرية، التي تنتجها تجريد حجم التصوير بالرنين المغناطيسي، والأسطح التي تم الحصول عليها من المسح الضوئي 3D من العقول المستخرجة. قيم وضع الرسم البياني للمسافات هي فقط 55 ميكرومتر (الشكل3a). بالإضافة إلى ذلك، عند تراكم الرسم ال...

Discussion

وقد طورنا بروتوكولا جديدا يسمى بروتوكول الـ 3D-NEO لسد المقاييس المكانية العيانية والمجهرية عن طريق تداخل سطحين من أسطح الدماغ بدقة أكبر من ذي قبل. في الأصل، كان هناك تحديان في إنشاء هذا البروتوكول الذي جعل من الممكن التداخل الدقيق لصورتين سطح الدماغ وتسجيل الأنشطة العصبية الصحية من الكائن?...

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تشعر الأستاذة بالامتنان للدعم الذي تقدمه جميع الموظفين في دورة هندسة المعلومات الطبية في كلية الدراسات العليا للطب وكلية الطب، وترغب في شكر البروفيسور تيتسويا تاكاكوا، والبروفيسور نوبوكاتسو ساواموتو، ودوريس زاكيان على ما قدموه من مساعدة تعليقات. وقد تم دعم هذه الدراسة من قبل منحة في المعونة لتحدي البحوث الاستكشافية والمبادرة الرائدة للباحثين الشباب الممتاز (LEADER) برنامج إلى M.S. من MEXT (وزارة التعليم والثقافة والرياضة والعلوم والتكنولوجيا). وقد أجريت تجارب التصوير بالرنين المغناطيسي في هذا العمل في شعبة التصوير بالرنين المغناطيسي للحيوانية الصغيرة، ومركز دعم البحوث الطبية، وكلية الدراسات العليا للطب، جامعة كيوتو، اليابان.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Air compressorKimura MedicalKA-100Animal preparation for MRI
All-in-one fluorescence microscopeKEYENCEBZ-X710
Anesthesia boxBio Research CenterRIC-01Animal preparation for MRI
Anesthesia systemACOMA Medical IndustryNS-5000AAnimal preparation for MRI
Anti-GAD67, clone 1G10.2Merk MilliporeMAB5406For immunostaining
Calcium Chrolidenacalai tesque06729-55aCSF
Choline Chloridenacalai tesque08809-45aCSF
Curved blunt forceps
Disposal scalpelKai10
D-PBS(-) without Ca and Mg, liquid (10x)nacalai tesqueFor immunostaining
D(+)-GlucoseWako049-31165aCSF
Gelatinnacalai tesque16605-42re-secctioning
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488InvitrogenA32723For immunostaining
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555InvitrogenA32732For immunostaining
Heater matBio Research CenterHM-10Animal preparation for MRI
Heater mat controllerBio Research CenterBWT-100AAnimal preparation for MRI
Heater systemSA InstrumentsMR-compatible Small Animal Heating SystemAnimal preparation for MRI
IsofluraneAbbVieAnimal preparation for MRI
Isoflurane vaporizerACOMA Medical IndustryMKIIIaiAnimal preparation for MRI
Linear SlicerDOSAKANeo Linear Slicer MT
L(+)-Ascorbic Acid Sodium SaltWako196-01252aCSF
Magnesium Chrolide HexahydrateWako135-00165aCSF
MaxOne Single-Well MEAMaxWell Biosystems
Metal Spatula
Monitoring systemSA InstrumentsModel 1025Animal preparation for MRI
Monitoring softwareSA InstrumentsPC-SAM V.5.12Animal preparation for MRI
MRI compatible cradleBruker BioSpinT12812Animal preparation for MRI
MRI coilBruker BioSpinT9988For MRI
MRI operation softwareBruker BioSpinParaVision 5.1For MRI
Neo LinearSlicer MTD.S.K.NLS-MT
NeuN (D4G40) XP Rabbit mAbCell Signaling24307For immunostaining
Normal Goat SerumWako143-06561For immunostaining
Potassium ChlorideWako163-03545aCSF
Polyethylene Glycol Mono-p-isooctylphenyl Ethernacalai tesque12967-45For immunostaining
Pressure-sensitive respiration sensorSA InstrumentsRS-301Animal preparation for MRI
Preclinical MRI scannerBruker BioSpinBioSpec 70/20 USRFor MRI
Pyruvic Acid Sodium Saltnacalai tesque29806-54aCSF
SCAN in a BOXOpen Technologies srl
Scissors
Sieve bottleTIGERCROWN81For 3D scan
SlowFade Gold Antifade MountantInvitrogenS36937For immunostaining
Sodium ChlorideWako191-01665aCSF
Sodium DihydrogenphosphateWako197-09705aCSF
Sodium Hydrogen CarbonateWako191-01305aCSF
Sodium Hydrogensulfitenacalai tesque31220-15For immunostaining
Thermistor temperature probeSA InstrumentsRTP-101-B, PLTPC-300Animal preparation for MRI
Tooth barBruker BioSpinT10146Animal preparation for MRI
Winged intravenous needleTERUMOSV-23CLKFor perfusion
1 mol/l-Tris-HCl Buffer Solutionnacalai tesque35436-01For immunostaining
1 mol/l-Hydrochloric Acidnacalai tesque37314-15For pH adjustment of solution
16%-Paraformaldehyde Aqueous SolutionElectron Microscopy Sciences15710For immunostaining

References

  1. Vogelsberger, M., et al. Properties of galaxies reproduced by a hydrodynamic simulation. Nature. 509 (7499), 177-182 (2014).
  2. Zhang, B., et al. Integrated systems approach identifies genetic nodes and networks in late-onset Alzheimer’s disease. Cell. 153 (3), 707-720 (2013).
  3. Sporns, O., Chialvo, D. R., Kaiser, M., Hilgetag, C. C. Organization, development and function of complex brain networks. Trends in Cognitive Sciences. 8 (9), 418-425 (2004).
  4. Shimono, M. Non-uniformity of cell density and networks in the monkey brain. Scientific Reports. 3, 2541 (2013).
  5. DeFelipe, J., Jones, E. G. . Cajal on the Cerebral Cortex: An Annotated Translation of the Complete Wrings. , (1988).
  6. Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M. . Principles of Neural Science. , (2013).
  7. Pine, J., Taketani, M., Baudry, M. A history of MEA development. Advances in Network Electrophysiology. , 3-23 (2006).
  8. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
  9. Shimono, M., Beggs, J. M. Functional clusters, hubs, and communities in the cortical microconnectome. Cerebral Cortex. 25 (10), 3743-3757 (2014).
  10. Amunts, K., et al. BigBrain: An Ultrahigh-Resolution 3D Human Brain Model. Science. 340, 1472-1475 (2013).
  11. Ali, S., et al. Rigid and non-rigid registration of polarized light imaging data for 3D reconstruction of the temporal lobe of the human brain at micrometer resolution. NeuroImage. 181, 235-251 (2018).
  12. Kozai, T. D. Y., et al. Ultrasmall implantable composite microelectrodes with bioactive surfaces for chronic neural interfaces. Nature Materials. 11, 1065-1073 (2012).
  13. Kampasi, K., et al. Dual color optogenetic control of neural populations using low-noise, multishank optoelectrodes. Microsystems & Nanoengineering. 4 (1), 10 (2018).
  14. Hellwig, B. A quantitative analysis of the local connectivity between pyramidal neurons in layers 2/3 of the rat visual cortex. Biological Cybernetics. 82 (2), 111-121 (2000).
  15. Bezgin, G., Reid, A. T., Schubert, D., Kötter, R. Matching spatial with ontological brain regions using Java tools for visualization, database access, and integrated data analysis. Neuroinformatics. 7 (1), 7-22 (2009).
  16. Holmgren, C., Harkany, T., Svennenfors, B., Zilberter, Y. Pyramidal cell communication within local networks in layer 2/3 of rat neocortex. The Journal of Physiology. 551 (1), 139-153 (2003).
  17. Boucsein, C., Nawrot, M., Schnepel, P., Aertsen, A. Beyond the cortical column: abundance and physiology of horizontal connections imply a strong role for inputs from the surround. Frontiers in Neuroscience. 5 (32), 1-13 (2011).
  18. Edelsbrunner, H., Aronov, J. P. B., Basu, S., Sharir, M. Surface reconstruction by wrapping finite point sets in space. Discrete and Computational Geometry - The Goodman-Pollack Festschrift. , 379-404 (2003).
  19. Roland, P. E., et al. Human brain atlas: For high‐resolution functional and anatomical mapping. Human Brain Mapping. 1 (3), 173-184 (1994).
  20. Johnson, G. A., et al. Waxholm space: an image-based reference for coordinating mouse brain research. NeuroImage. 53 (2), 365-372 (2010).
  21. Evans, A. C., Janke, A. L., Collins, D. L., Baillet, S. Brain templates and atlases. NeuroImage. 62 (2), 911-922 (2012).
  22. Okabe, S. Brain/MINDS–a new program for comprehensive analyses of the brain. Microscopy. 64 (1), 3-4 (2015).
  23. Shimono, M., Hatano, N. Efficient communication dynamics on macro-connectome, and the propagation speed. Scientific Reports. 8 (1), 2510 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

147 MRI connectomics

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved