3D-Scanning-Technologie Überbrückung von Mikroschaltungen und Makroskalen-Gehirnbildern in 3D-Neuartigem Einbetten von Überlappungsprotokollen

Zusammenfassung

Dieser Artikel stellt ein experimentelles Protokoll vor, das die 3D-Scanning-Technologie verwendet, die zwei räumliche Skalen überbrückt: die makroskopische räumliche Skala der Anatomie des gesamten Gehirns, die durch die MRT auf >100 m abgebildet wird, und die mikroskopische räumliche Skala neuronaler Verteilungen unter Verwendung von immunhistochemische Färbung und ein Multielektroden-Array-System und andere Methoden (ca. 10 m).

Zusammenfassung

Das menschliche Gehirn, ein Multiskalensystem, hat sowohl makroskopische elektrische Signale, die global entlang dicker weißer Faserbündel fließen, als auch mikroskopische neuronale Spitzen, die sich entlang axons und dendriten ausbreiten. Beide Skalen ergänzen verschiedene Aspekte der menschlichen kognitiven und Verhaltensfunktionen. Auf makroskopischer Ebene ist die MRT die aktuelle Standard-Bildgebungstechnologie, bei der die kleinste räumliche Auflösung, die Voxelgröße, 0,1–1 mm³beträgt. Auch auf mikroskopischer Ebene waren sich frühere physiologische Studien ungleichmäßiger neuronaler Architekturen innerhalb solcher Voxel bewusst. Diese Studie entwickelt eine leistungsstarke Möglichkeit, mikroskopische Daten genau in eine makroskopische Karte einzubetten, indem biologische wissenschaftliche Forschung mit technologischen Fortschritten in der 3D-Scanning-Technologie in Verbindung gebracht wird. Da die 3D-Scanning-Technologie bisher vor allem für Engineering und Industriedesign eingesetzt wurde, wird sie erstmals umfunktioniert, um Mikroconnectome in das gesamte Gehirn einzubetten und dabei das natürliche Spiking in lebenden Gehirnzellen zu erhalten. Um diesen Zweck zu erreichen, haben wir zunächst ein Scanprotokoll erstellt, um genaue 3D-Bilder von lebenden Bioorganismen zu erhalten, die aufgrund feuchter und reflektierender Oberflächen von Natur aus eine Herausforderung für das Bild darstellen. Zweitens haben wir trainiert, um die Geschwindigkeit zu halten, um den Abbau von lebendem Hirngewebe zu verhindern, was ein Schlüsselfaktor für die Beibehaltung besserer Bedingungen und die Aufzeichnung natürlicherer neuronaler Spitzen aus aktiven Neuronen im Gehirngewebe ist. Zwei kortikale Oberflächenbilder, die unabhängig voneinander aus zwei verschiedenen Bildgebungsmodulen extrahiert werden, nämlich MRT- und 3D-Scanner-Oberflächenbilder, zeigen überraschenderweise einen Entfernungsfehler von nur 50 m als Moduswert des Histogramms. Diese Genauigkeit ist in der Skala mit der mikroskopischen Auflösung interzellulärer Entfernungen vergleichbar; auch, Es ist stabil unter verschiedenen einzelnen Mäusen. Dieses neue Protokoll, das 3D-Roman-Einbettungsprotokoll (3D-NEO), überbrückt makroskopische und mikroskopische Ebenen, die durch dieses integrative Protokoll abgeleitet werden, und beschleunigt neue wissenschaftliche Erkenntnisse, um umfassende Konnektivitätsarchitekturen zu untersuchen (d. h. Mikroconnectom).

Einleitung

Uneinheitliche multiskalen Architekturen in verschiedenen physikalischen und biologischen Organisationen sind häufig gefunden^1,2. Das Gehirn ist auch eine sehr uneinheitliche und multiskalige Netzwerkorganisation^3,4. Verschiedene kognitive Funktionen sind in solchen Netzwerkorganisationen kodiert, die zeitliche Veränderungen der elektrischen Spitzenmuster neuronaler Populationen in submillisekundenzeitlichen Auflösungen halten. Historisch gesehen wurden die komplexen Netzwerke zwischen Neuronen strukturell detailliert beobachtet, indem man die Färbetechniken von Santiago Ramon y Cajal von vor über 150 Jahren^{verwendete 5}. Um das Gruppenverhalten aktiver Neuronen zu beobachten, haben forscher verschiedene Aufzeichnungstechnologien entwickelt^6,7,8, und die jüngsten bedeutenden Entwicklungen solcher Technologien haben es uns ermöglicht, elektrische Aktivitäten von einer großen Anzahl von Neuronen gleichzeitig. Darüber hinaus ist es Wissenschaftlern aus solchen funktionellen Aktivitäten gelungen, Netzwerke kausaler Wechselwirkungen zwischen einer großen Anzahl von Neuronen zu rekonstruieren und die topologische Architektur ihrer komplexen Wechselwirkungen als "Mikroconnectom" bezeichnet zu haben⁹ . Makroskopische Beobachtungen des Gehirns ermöglichen auch die Bezug auf ein ganzes Gehirn als Netzwerkorganisation, da viele Hirnregionen durch mehrere Faserbündel verbunden sind. Die Einbettung von Mikroconnectomen in die globale Hirnkarte hat immer noch klare Grenzen innerhalb des aktuellen technologischen Fortschritts, weshalb dieses Einbettungsprotokoll so wichtig ist. Die Entwicklung des Einbettungsprotokolls stellt jedoch viele Herausforderungen dar. Um beispielsweise Aktivitäten lebender lokaler neuronaler Schaltkreise in rein isolierten Hirnregionen zu beobachten, müssen Hirnscheiben für In-vitro-Aufnahmen produziert werden. Darüber hinaus sind Aufnahmen von Gehirnscheiben für In-vitro-Aufnahmen aus mindestens zwei Gründen immer noch eine wichtige Wahl. Erstens ist es immer noch nicht einfach, Aktivitäten vieler lebender einzelner Neuronen gleichzeitig aus Hirnregionen zu beobachten, die tiefer als 1,5 mm und in hoher zeitlicher Auflösung (<1 ms) liegen. Zweitens, wenn wir hoffen, die interne Architektur eines lokalen neuronalen Schaltkreises zu kennen, müssen wir alle Eingaben aus externen Gehirnregionen stoppen, um verwirrende Faktoren zu beseitigen. Um die Richtungen und Positionen der produzierten Hirnscheiben zu identifizieren, wird es weiterhin notwendig sein, die räumlichen Positionen dieser produzierten Gehirnscheiben mithilfe von Koordinaten zu integrieren. Es gibt jedoch ein paar systematische und zuverlässige Möglichkeiten, Gehirnscheiben in organisierter Weise zu machen^10,11. Hier wird ein neues Co-Registrierungsprotokoll eingeführt, das 3D-Scanning-Technologie für die neurowissenschaftliche Forschung nutzt, um ein integratives Protokoll zu liefern. Dieses Protokoll dient der Koordination von Mikro- und Makroskalen und der Einbettung von Multielektroden-Array (MEA)-Mikrodaten^12,13 und Der Färbung von Daten auf einen makroskopischen MRT-Raum durch 3D-Scan-Oberflächen von extrahierten Gehirnen sowie nicht invasiv aufgezeichnete Gehirne. Überraschenderweise zeigte dies einen Entfernungsfehler von nur 50 m als Moduswert des Histogramms. Infolgedessen lagen die Moduswerte der Mindestabstände zwischen zwei Oberflächen zwischen der MRT-Oberfläche und der gescannten 3D-Oberfläche für alle sechs Mäuse bei fast 50 m, was bei der Überprüfung auf Gemeinsamkeit unter Individuen eine geeignete Zahl darstellt. Die typische Schnittbreite hatte eine aufgezeichnete Spitzenaktivität von ca. 300 m.

Protokoll

Alle hier beschriebenen experimentellen Verfahren wurden vom Ausschuss für Tierpflege der Universität Kyoto genehmigt.

1. Tiere (Tag 1)

1. Bereiten Sie weibliche C57BL/6J-Mäuse vor(n = 6, im Alter von 3 bis 5 Wochen).
   HINWEIS: Dieses Protokoll gilt für alle Nagetierarten.

2. MRT-Einstellungen (Tag 1)

1. Legen Sie die Maus in eine Acrylanästhesie-Box auf einer Heizmatte auf 37 °C eingestellt mit einem Heizmatt-Controller.
2. Anästhesisieren Sie die Maus mit 2% Isofluran in Luft, die mit einer Durchflussrate von 1,4 l/min durch die Box fließt, mit einem Anästhesiesystem, das aus einem Isofluran-Verdampfer, einem Luftdurchflussmesser und einem Luftkompressor besteht.
3. Legen Sie die Maus nach der Induktion der Anästhesie in eine MRT-kompatible Wiege in die anfällige Position. Prüfen Sie, ob die Anästhesie ausreicht, indem Sie eine Zeh der Maus mit einer Pinzette schneiden, um zu sehen, ob sie keine Schmerzen anfühlt.
4. Befestigen Sie den Kopf der Maus mit der Zahnstange und der Gesichtsmaske, die mit der Wiege ausgestattet sind. Halten Sie dann die Anästhesie mit 1%-1,5% Isofluran in der Luft bei 1,4 l/min über die Gesichtsmaske.
5. Setzen Sie einen Thermistor-Temperaturfühler in das Rektum der Maus ein und legen Sie einen druckempfindlichen Atmungssensor auf die Rückseite der Maus.
6. Übertragen Sie die Wiege auf die Bohrung eines MRT-Magneten. Passen Sie die Isoflurankonzentration auf etwa 1%-1,5% an, um eine stabile und reproduzierbare Anästhesietiefe zu gewährleisten. Überwachen Sie, ob die Körpertemperatur zwischen 33 °C und die Atmungsrate zwischen 0,5 und 1,3 Hz während des gesamten Zeitraums der MRT-Experimente gesteuert wird, wobei ein Überwachungssystem (Materialtabelle) für die physiologischen Parameter von Kleintieren mit dedizierte Software (Materialtabelle).
7. Mit Dem Gemessenen Wert der Rektaltemperatur können Sie die Körpertemperatur regulieren, indem Sie die Temperatur der in der Magnetbohrung zugeführten Warmluft aus einem im Überwachungssystem ausgestatteten Heizsystem steuern.

3. MRT-Akquisitionen (Tag 1)

1. Vorbereitungen für den hochauflösenden 3D T2-gewichteten MRT-Scan
   1. Erfassen Sie drei Magnetresonanzbilder (MR) in drei orthogonalen (axialen, koronaren und sagittalen) Ebenen, um die Position der Maus zu überprüfen.
   2. Unter Bezugnahme auf diese Bilder, passen Sie die Position der Maus, indem Sie die Wiege so bewegen, dass die Mitte des Mausgehirns in der Mitte des Resonators sowie in der Mitte der Gradientenspulen in axialer Richtung positioniert ist.
   3. Passen Sie das MRT-System an, indem Sie den Resonator einstellen, die homogenität des statischen Magnetfeldes (Shimming) und die Grundfrequenz anpassen und die Hochfrequenzleistung (RF) kalibrieren.
   4. Erfassen Sie 2D-Multislice-T2-gewichtende (T2W) Bilder mit niedriger Auflösung mit koronaren und sagittalen Ausrichtungen. Anhand dieser Bilder wird das Sichtfeld (FOV) für einen hochauflösenden 3D-T2W-MRT-Scan ermittelt.
   5. Führen Sie lokalisiertes Shimming mit einem automatischen FASTMAP-Shim-Algorithmus durch. Wählen Sie für das FASTMAP-Protokoll einen rechteckigen Bereich aus, der das gesamte Gehirn abdeckt. Bestätigen Sie nach Abschluss des lokalisierten Shimmings die B 0-Feldinhomogenität innerhalb der Hirnregion durch ein lokalisiertes ¹H-Spektrum mittels punktaufgelöster Spektroskopie (PRESS).
   6. Erfassen Sie 3D-T2W-Bilder mit niedriger Auflösung, um sicherzustellen, dass die Scaneinstellungen für hochauflösende s2W-MRT-Werte geeignet sind, indem Sie die entsprechende Position des FOV, das Fehlen von Wraparound-Artefakten (Aliasing) und die effiziente Unterdrückung von Fettsignalen überprüfen.
2. Bildgebende Pulssequenz
   1. Erwerben Sie nach den oben beschriebenen Präparaten hochauflösende 3D-T2W-Bilder des gesamten Gehirns der Maus, wobei sie eine schnelle Erfassung mit Entspannungsverstärkungssequenz (RARE) verwenden.
      HINWEIS: In diesem Artikel wurden MRT-Experimente an einer 7 T, 210 mm horizontalen Bohrung, präklinischem Scanner, durchgeführt, der mit einem Gradientensystem von 440 mT/m bei einer Rampenzeit von 100 s ausgestattet war. Für die HF-Erregung und den Signalempfang wurde ein Quadraturvolumenresonator mit einem Innendurchmesser von 35 mm verwendet. MRT-Daten wurden mit einer speziellen Betriebssoftware erfasst. Die erfassungsparameter der in dieser Studie verwendeten 3D RARE Pulssequenz sind in Tabelle 1zusammengefasst.

4. Vorbereitung experimenteller Lösungen (Tag 2)

1. 500 ml einer eiskalten Schneidlösung vorbereiten (2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH₂PO₄, 7 mM MgCl₂, 15 mM Glukose, 25 mM NaHCO₃, 0,5 mM CaCl₂, 11,6 mM Natriumascorbat, 3,1 mM Natriumpyruvat und 100 mM Cholinchlorid, Sprudel, mit 95% O2 und 5% CO₂). Stellen Sie den pH-Wert auf 7,3 bis 7,4 ein.
2. Bereiten Sie 1 L der künstlichen Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF; 127 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH₂PO₄, 1 mM MgCl₂, 15 mM Glukose, 25 mM NaHCO₃und 2 mM CaCl₂, geblasen mit 95% O₂ und 5% CO₂) vor. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,3–7,4 ein.

5. Vorbereitung der Ausrüstung (Tag 2)

1. Bereiten Sie einen 6,6 cm² quadratischen, 0,5 cm dicken Magneten "Ring" vor und legen Sie zum einen schwarzes Klebeband und zweitens chirurgisches Klebeband auf den Ring (Abbildung 1c-2). Beachten Sie, dass dieses Material eine Gehirnblockbasis (BBB) genannt wird, und halten Sie es kalt auf Eisblöcken.
   HINWEIS: Später werden die Bänder mit Hirnblöcken für das Vibratom an der Schneidstation befestigt. Der quadratische Ring wird als bodenluntere Basis des BBB verwendet, um zwei Zwecke zu erfüllen, nämlich Gehirnblöcke reibungslos von der 3D-Scanstation zu einem Vibratom zu migrieren und die Höhe der Gehirnblöcke im Scanschritt genau zu messen.
2. Richten Sie die BBB mit einem automatischen Drehteller ein. Schalten Sie den Scanner und den Plattenspieler ein. Starten Sie die Bildverarbeitungssoftware.
3. Führen Sie vor allen Experimenten Kalibrierungen der Kameras und des angeschlossenen Drehtischs einer strukturierten Lichtprojektion und eines Desktop-3D-Scanners durch.
   1. Schalten Sie den Mittleren Projektor, die beiden Kameras und den Drehteller ein. Öffnen Sie dann die Software. Klicken Sie in der Software auf Optischeeinrichtung und wählen Sie den Bildbereich als 100 x 80 und die Rasternummern als 100 x 100 aus. Anschließend beginnt die Kamerakalibrierung gemäß den folgenden vier Schritten.
      1. Legen Sie für die Projektoreinrichtung das Kalibrierblatt auf den Schreibtisch und legen Sie die Kalibrierplatine auf das Kalibrierblatt, um den Fixpunkt des Messbereichs in der Mitte des Bogens und die Ausrichtung nach vorne einzustellen. Stellen Sie den Abstand zwischen Projektor und Platine auf ca. 200 mm ein. Lösen Sie die Schrauben, die die beiden Knöpfe fixieren, und drehen Sie die Knöpfe, um die Lichtempfindlichkeit und den Fokus der beiden Kameras einzustellen. Klicken Sie dann auf Pfeil, um zum nächsten Schritt zu wechseln.
      2. Um die Kameras zu orientieren, lösen Sie die Schrauben, die die beiden Kameras selbst fixieren, und verschieben Sie die Positionen und Drehungen, um sich mit der Mittellinie auf der Kalibrierplatine, der vertikalen Linie und dem vom Projektor projizierten gelben Kreuz zu überlappen. Korrigieren Sie die Kameras, und klicken Sie erneut auf Pfeil. Dann wird der Bildschirm dunkel.
      3. Um die Kameras zu fokussieren, nach dem Lösen der Befestigungsschrauben der Knöpfe, erhöhen Sie die Lichtempfindlichkeit und stimmen Sie den Fokus wieder. Klicken Sie dann auf Pfeil, um zum nächsten Schritt zu wechseln.
      4. Passen Sie für den F-Wert und den Belichtungsgrad (der Kamera) die Lichtempfindlichkeit erneut an, wo der rote Bereich verschwindet. Klicken Sie dann erneut auf Pfeil, und klicken Sie auf Kalibrierungsstart, und wählen Sie Ja, wenn Sie gefragt wurden, ob Sie die optische Einstellung abgeschlossen haben?
   2. Klicken Sie auf Kalibrierung initialisieren, und überprüfen Sie, ob die Pixelwerte zwischen 0–255 normalisiert sind. Klicken Sie dann auf Weiter.
   3. Zeichnen Sie anhand der vorgeschlagenen Positionen Bilder von neun verschiedenen relativen Winkeln des Scanners und der Kalibrierplatine auf und enden Sie nach der Bestätigung des Kalibrierungsvorgangs, und klicken Sie schließlich auf Aktualisieren der Kalibrierung.
   4. Tauschen Sie die Kalibrierplatine gegen den Plattenspieler aus, und klicken Sie auf die Drehtischkalibrierung.
      HINWEIS: Jetzt sind alle Kalibrierungen abgeschlossen.

6. Brain Surface Scan, Slicing und MEA Recording (Tag 2)

1. Anästhetisieren Sie eine Maus mit 1%-1,5% Isofluran und enthaupten Sie die Maus. Verwenden Sie ein Skalpell, um die Haut zu öffnen und den Schädel freizulegen.
2. Schneiden Sie die Kopfhaut der anästhesierten Maus entlang der sagittalen Naht mit einem chirurgischen Messer, und schneiden Sie den Schädel in diagonalen Richtungen von der Lambda-Punkt zu einem Punkt ein wenig vor der Bregma mit chirurgischen Schere. Dann schälen Sie den Schädel vorsichtig aus dem Gehirn mit gekrümmten Pinzette.
3. Verwenden Sie einen Spachtel, um das Gehirn zu heben und auf eine Petrischale (100 mm x 20 mm) mit eiskalter Schneidlösung (in Schritt 4.1) zu übertragen. Durchflussluft, die 95% O2 und 5% CO2 aus einer externen Gasbombe mit einer kontrollierten Drehgeschwindigkeit der Pumpe (ca. 4,0 Rpm) enthält, um kleine Blasen in der eiskalten Schneidlösung zu erzeugen (Abbildung 1a).
4. Nach 1–2 min, legen Sie das Gehirn auf ein Mikrofasertuch, dessen Oberfläche leicht von einem Mehlsieb bedeckt ist, und wischen Sie Flüssigkeit von der Gehirnoberfläche, sanft mit dem Mikrofasertuch (Abbildung 1b).
5. Setzen Sie das Gehirn mit seinem dorsalen Aspekt auf den Probenständer auf dem BBB, und stellen Sie auch die BBB in die Mitte der automatischen Drehscheibe.
6. Verdunkeln Sie den Raum während des 3D-Scans und führen Sie einen 3D-Scan auf dem Plattenspieler durch. Um zu testen, ob der 3D-Scan gut funktioniert, klicken Sie auf 3D-Scan, indem Sie den Winkel zwischen zwei Aufnahmen als 22,5, den Startwinkel als 0 und den letzten Winkel als 360 (Abbildung1c-1) auswählen.
7. Bewegen Sie das Gehirn zu einer Petrischale, und Blasen Sie das Gehirn in der Schneidlösung für etwa 10 s.
8. Schneiden Sie das Gehirn in zwei Blöcke in der Mitte der koronalen Ebene mit einem chirurgischen Messer, und bewegen Sie die beiden Gehirnblöcke sanft auf die flache Oberfläche mit einem chirurgischen Spachtel.
9. Befestigen Sie die Gehirnblöcke des BBB mit Instantkleber und wischen Sie die Flüssigkeit innerhalb von 1–2 min mit einem Mikrofasertuch vorsichtig und vorsichtig von der Gehirnoberfläche ab. Führen Sie dann erneut einen 3D-Scan durch (Abbildung 1c-2).
10. Befestigen Sie das schwarze Klebeband, das die Mitte des BBB bedeckt, an der Mitte der Schnittbühne für ein Vibramme (Abbildung 1d).
11. Schneidlösung in die Schneidstufe gießen und die Schnittstufe auf das Vibratome stellen. Passen Sie die Schnittgeschwindigkeit und Amplitude an. Machen Sie 2–5 koronale Scheiben (300 m dick) aus den beiden Gehirnblöcken. Halten Sie die Lösung in der Schneidebühne sprudeln, wenn möglich (Abbildung 1e).
12. Befestigen Sie eine Klinge am Klingenhalter des Vibratom und optimieren Sie die Schnittgeschwindigkeit, Frequenz und Vibrationsamplitude des Systems, indem Sie sie als 12,7 mm/min für die Geschwindigkeit, 87–88 Hz für die Frequenz und 0,8–1,0 mm für die Schwingbreite einstellen. Wenn sorgfältiges Schneiden erforderlich ist, verlangsamen Sie die Geschwindigkeit auf Stufe 2-3.
13. Zeichnen Sie beim Schneiden der Gehirnscheiben die geschnittene Koordinate im Format auf, einschließlich der vorderen hinteren Koordinate, der Hemisphäre und anderer Bedingungen (Abbildung 2c).
14. Übertragen Sie die Gehirnscheiben vorsichtig mit einer dicken Plastikpipette auf einen Becher, der mit vorgewärmten (ca. 34 °C) ACSF gefüllt ist, und bebrüte sie im Becherbeifall bei 34 °C für 1 h. Führen Sie während dieser Zeit einen 3D-Scan der verbleibenden Gehirnblöcke auf der Schnittstufe durch (Abbildung 1c-2).
15. Stellen Sie einen MEA-Chip auf eine Aufnahmeeinheit ein. Schließen Sie den Chip mit zwei Rohren an eine peristaltische Pumpe an. Verwenden Sie ein Rohr, um den gleichen ACSF in den MEA-Chip zu führen, und das andere Rohr, um ACSF aus dem MEA-Chip zu führen.
16. Befestigen Sie zwei Nadeln (0,60 mm x 19 mm), die an den Spitzen der beiden Rohre verbunden sind, an der Oberseite der Wand des MEA-Chips an, und fixieren Sie ihre Positionen mit ihren Spitzen nach der Innenwand des MEA-Chips. Stellen Sie den Durchfluss des ACSF auf 4,1 Rpm ein.
17. Nachdem 1 h vergangen ist, bewegen Sie eine Scheibe auf dem Chip mit einer dicken Kunststoffpipette, und stellen Sie die Position mit einem weichen Pinsel. Beginnen Sie dann den Aufzeichnungsprozess neuronaler Aktivitäten (Abbildung 2-d).

7. Immunohistochemie Färbung (Tage 3 und 4)

1. Nach Abschluss der MEA-Aufnahme die Scheiben in 1,5 ml-Rohre übertragen, die mit 4% Paraformaldehyd (PFA) in phosphatgepufferter Saline (PBS) gefüllt sind. Inkubieren Sie sie über Nacht bei 4 °C. Entfernen Sie dann die 4% PFA-Lösung, und waschen Sie die Scheiben 3x mit PBS für insgesamt 5 min.
   HINWEIS: Falls erforderlich, betten Sie die Scheiben in 20% Gelatine/PBS ein und resektionieren Sie die Scheibe, um sie mit dem Vibratome dünner als 50 m zu machen.
2. Bereiten Sie Antigen-Retrieval-Lösung (10 mM Natriumcitrat, pH 6.0). Entfernen Sie die PBS von der letzten Wäsche und fügen Sie die Antigen-Retrieval-Lösung hinzu.
3. Kochen Sie Wasser in einem elektrischen Thermostopf und inkubieren Sie die Rohre mit den Scheiben für 20 min bei 95–98 °C im Topf, gefolgt von natürlicher Kühlung.
4. 50 mM Tris-gepufferte Salin vorbereiten und 1% Na-Bisulfit (1% Na-Bisulfit-Tris-Lösung) hinzufügen. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,5 ein. Dann die Scheiben mit 1% Na Bisulfit-Tris Lösung für 5 min bei Raumtemperatur (ca. 20–25 °C) waschen.
5. Bereiten Sie die Blockierlösung vor, indem Sie der 1% Na-Bisulfit-Tris-Lösung 4% normales Ziegenserum und 0,5% Octylphenolethoxylat hinzufügen.
6. Entfernen Sie die 1% Na Bisulfit-Tris Lösung aus den Rohren mit den Scheiben und fügen Sie blockende Lösung hinzu. 2 h bei Raumtemperatur inkubieren.
7. Bereiten Sie die primäre Antikörperlösung vor, indem Sie 1% normales Ziegenserum und 0,5% Triton X-100 zur 1% Na Bisulfit-Tris-Lösung hinzufügen und primär Antikörper verdünnen. Verwenden Sie die folgenden Konzentrationen von primären Antikörpern: 1:800 von Maus anti-GAD67 und 1:500 von Kaninchen Anti-NeuN.
8. Entfernen Sie die 1% Na Bisulfit-Tris Lösung aus den Rohren mit den Scheiben und fügen Sie die primäre Antikörperlösung hinzu. Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
9. 50 mM Tris-gepufferte Salin vorbereiten und 8,5 g/L NaCl (Tris-NaCl-Lösung) hinzufügen. Den pH-Wert auf 7,5 titieren. Dann die Scheiben 3x mit der Tris-NaCl-Lösung (ca. 20–25 °C) insgesamt 5 min waschen.
10. Bereiten Sie die zweite Antikörperlösung vor, indem Sie der Tris-NaCl-Lösung 3 % normales Ziegenserum und 0,3 % Triton X-100 hinzufügen und sekundäre Antikörper verdünnen. Verwenden Sie die folgenden Konzentrationen von sekundären Antikörpern: 1:500 von Ziegenanti-Maus und 1:500 von Ziege Anti-Kaninchen.
11. Entfernen Sie die Tris-NaCl-Lösung mit den Scheiben aus den Rohren und fügen Sie die sekundäre Antikörperlösung hinzu. Inkubieren Sie es für 2 h bei Raumtemperatur. Dann die Scheiben 3x mit der Tris-NaCl Lösung insgesamt 5 min waschen.
12. Legen Sie die Scheiben mit einem kleinen Pinsel auf die Folie und tragen Sie Montagemedien und einen Deckelbeschlag auf. Untersuchen Sie die Dias mit einem konfokalen Mikroskop. Nehmen Sie Bilder von der Oberfläche eines Segments auf (Abbildung 2e).

8. MRT-Datenverarbeitung zur Extraktion kortikaler Volumina

1. Installieren Sie die kostenlose Software FSL (https://fsl.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fslwiki/FslInstallation). Bereiten Sie die in Abschnitt 3 aufgenommenen MRT-Bilder vor.
2. Ändern Sie das Bildformat mit dem Befehl fslchfiletype NIFTI_PAIR_GZ. Erweitern Sie das Gehirnbild, um es mit dem Befehl fslcreatehd so groß wie ein menschliches Gehirn zu machen, und ändern Sie bei Bedarf die Ausrichtung mit fslorient mit der Option -setqformcode 1. Danach stellen Sie das ursprüngliche Dateiformat mit fslchfiletype NIFTI_GZwieder her. Der genaue Befehl ist wie folgt.
   fslchfiletype NFTI_PAIR [Eingabebild].nii.gz
   fslcreatehd 144 196 160 1 0.95 0.6 1.15 0 0 0 0 4 [Eingangsbild].hdr.gz
   fslorient –setqformmcode 1 [Eingangsbild].hdr.gz
   fslchfiletype NIFTI_GZ [Eingabebild]
3. Geben Sie fsl ein, um die FSL-Software zu öffnen. Extrahieren Sie Gehirne mit dem Befehl bet aus der grafischen Benutzeroberfläche (GUI), aber schälen Sie nicht zu viel. Dann, steuern Sie die Fractional Intensität Schwellen, ... und Koordinaten des Zentrums der ersten Gehirnoberfläche Kugel sorgfältig. Die optimalen Werte unterscheiden sich für einzelne Daten.
4. Ändern Sie die Größe des Gehirnbildes auf die ursprüngliche Maus-Gehirngröße, mit dem gleichen Verfahren wie in Schritt 8.2. Der genaue Befehl ist wie folgt:
   fslchfiletype NFTI_PAIR [Eingabebild].nii.gz
   fslcreatehd 144 196 180 1 0.1 0.1 0.08 0 0 0 4 [Eingangsbild].hdr.gz
   fslorient –setqformmcode 1 [Eingangsbild].hdr.gz
   fslchfiletype NIFTI_GZ [Eingabebild]
5. Entkernen Sie alle Gehirnbilder mit dem Flirtbefehl und erzeugen Sie ein gemitteltes Gehirnbild mit der Option -add und der Option -div des Befehls fslmaths.
   fslmaths [Gehirnbild 1] –hinzufügen ... –hinzufügen [Gehirnbild N] –div N [durchschnittlicher Bildname] –odt float
6. Machen Sie den gemittelten Gehirnreiniger mit der Option -thr des Befehls fslmaths. Wählen Sie dann einen optimalen Schwellenwert aus, der an einzelne Fälle angepasst ist.
   fslmaths [durchschnittlicher Bildname] –thr [thr-Wert, z. B. 5000] [Schwellenwert-Durchschnittsbild]
7. Schließlich formen Sie das gemittelte Gehirnbild mithilfe des Flirtbefehls erneut in die Koordinaten eines Individuums um. Dann bereiten Sie ziemlich sauber extrahierte Kortexe (Abbildung 2a).
   HINWEIS: Leider werden die Olfaktor-Glühbirne und das Kleinhirn in der rekonstruierten Gehirnoberfläche aus den MRT-Volumen nicht perfekt sein, da die FSL-Software wesentliche Einschränkungen hat, um alle Gehirnteile, einschließlich der Olfaktor-Lampe und des Kleinhirns, zu zaudern.

9. MRT-Bildverarbeitung zu kortikalen Streifenoberflächen

1. Laden Sie eine weitere kostenlose Software, 3D Slicer (https://download.slicer.org/) herunter.
2. Öffnen Sie die MR-Bilder der extrahierten Gehirne (klicken Sie auf Datei und wählen Sie Daten hinzufügen), die gemäß Abschnitt 8 erstellt wurden, mit den Modulen Volume Rendering und Editor in 3D Slicer.
3. Ändern Sie den Modus von Editor in Volume Rendering, und klicken Sie auf eine Zielschaltfläche, damit das Bild des Gehirns in die Mitte des Bildschirms kommt.
4. Wählen Sie den MR-T2-Gehirnmodus aus und stimmen Sie den Schwellenwert ab, indem Sie die Shift-Leiste bewegen. Wechseln Sie dann vom Volume-Rendering zum Editor zurück, und klicken Sie auf die Schaltfläche Schwellenwerteffekt.
5. Tragen Sie das Label 41 auf. Zerebralparese und speichern Sie die Daten der Gehirnoberfläche als .stl-Datei. Ändern Sie dann das Dateiformat von .vtk in .stl, und speichern Sie die Datei, indem Sie das Formular überprüfen.

10. Vorverarbeitung für 3D-Scandaten

1. Führen Sie eine automatische Koregistrierung zwischen 8 oder 16 Bildern aus 8 oder 16 verschiedenen Winkeln innerhalb einer Sequenz eines Scans durch, um kleine Diskrepanzen zwischen ihnen zu korrigieren, indem Sie auf Die globale Registrierung klicken, die in der Option Ausrichtung enthalten ist, und integrieren Sie sie. Wiederholen Sie Scans aus verschiedenen Winkeln, um die Gesamtehirnoberfläche zu erhalten (Abbildung 2b).
   1. Wenn die Integration zwischen Bildern, die aus verschiedenen Winkeln gescannt wurden, nicht erfolgreich war, klicken Sie auf Manuelle Ausrichtung, und wählen Sie ein Paar aus einem festen und einem bewegten Bildaus.
   2. Klicken Sie auf Start, um die manuelle Ausrichtung der Bilder zu starten, indem Sie drei oder vier gemeinsame Punkte in verschiedenen Bildern auswählen. Klicken Sie dann auf OK. Der Optimierungsalgorithmus ist der iterative nächstgelegene Punkt (ICP) Algorithmus¹⁰. Eine nichtlineare Verformung ist nicht enthalten.
2. Erstellen Sie ein Netz aller ausgerichteten Bilder (d. h. der Dots-Datensätze), indem Sie alle Bilder auswählen und auf die Schaltfläche Netzgenerierung klicken. Wählen Sie dann die Option Kleines künstlerisches Objekt aus, um das Netz als höchste Auflösung zu erhalten. Speichern Sie dann das Bild als .stl-Binärdatei oder im ASCII-Format.

11. Mitregistrierung der MRT-Oberfläche und der 3D-Scan-Oberfläche

1. Öffnen Sie die MRT-Oberfläche und verschmelzen Sie sie mit der 3D-Scanfläche mit der Oberflächenverarbeitungssoftware. Führen Sie dann einen manuellen Ausrichtungsprozess mit demselben Verfahren aus, das in den Schritten 10.1.1 und 10.1.2 beschrieben wird. Speichern Sie dann diese mitregistrierten Oberflächenbilder erneut (Abbildung 2a,b).
   1. Reinigen Sie bei Bedarf die einzelnen Oberflächendaten, z. B. durch Löschen kleiner Geräusche rund um den Hirnbereich, insbesondere bei den MRT-Daten, und durch Füllen von Löchern, falls vorhanden, insbesondere bei den 3D-Scandaten.
2. Öffnen Sie schließlich die Oberflächendaten mit einer Datenanalysesoftware, z. B. MATLAB, und führen und bewerten Sie die Histogramme der Mindestabstände zwischen den beiden Flächen.

Ergebnisse

Wir untersuchten Abstände zwischen kortikalen Oberflächen, die durch Abisolieren des MRT-Volumens erzeugt wurden, und Oberflächen, die aus 3D-Scans extrahierter Gehirne gewonnen wurden. Die Moduswerte des Histogramms der Abstände betragen nur 55 m (Abbildung 3a). Wenn das Histogramm von dem Punkt, an dem der Abstand gleich Null ist, akkumuliert wird, erreicht der akkumulierte Wert 90 % der gesamten Stichprobenzahlen bei 300 m (Abbildung

Diskussion

Wir haben ein neues Protokoll namens 3D-NEO-Protokoll entwickelt, um makroskopische und mikroskopische räumliche Skalen zu überbrücken, indem zwei Gehirnoberflächen genauer als zuvor überlappen. Ursprünglich gab es zwei Herausforderungen bei der Erstellung dieses Protokolls, das die genaue Überlappung zweier Gehirnoberflächenbilder ermöglichte und gesunde neuronale Aktivitäten von lebenden Organismen aufzeichnete. Erstens war es notwendig, die Schneidlösung, die das extrahierte Gehirn umgibt, effektiv abzuwisc...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Air compressor	Kimura Medical	KA-100	Animal preparation for MRI
All-in-one fluorescence microscope	KEYENCE	BZ-X710
Anesthesia box	Bio Research Center	RIC-01	Animal preparation for MRI
Anesthesia system	ACOMA Medical Industry	NS-5000A	Animal preparation for MRI
Anti-GAD67, clone 1G10.2	Merk Millipore	MAB5406	For immunostaining
Calcium Chrolide	nacalai tesque	06729-55	aCSF
Choline Chloride	nacalai tesque	08809-45	aCSF
Curved blunt forceps
Disposal scalpel	Kai	10
D-PBS(-) without Ca and Mg, liquid (10x)	nacalai tesque		For immunostaining
D(+)-Glucose	Wako	049-31165	aCSF
Gelatin	nacalai tesque	16605-42	re-secctioning
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488	Invitrogen	A32723	For immunostaining
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555	Invitrogen	A32732	For immunostaining
Heater mat	Bio Research Center	HM-10	Animal preparation for MRI
Heater mat controller	Bio Research Center	BWT-100A	Animal preparation for MRI
Heater system	SA Instruments	MR-compatible Small Animal Heating System	Animal preparation for MRI
Isoflurane	AbbVie		Animal preparation for MRI
Isoflurane vaporizer	ACOMA Medical Industry	MKIIIai	Animal preparation for MRI
Linear Slicer	DOSAKA	Neo Linear Slicer MT
L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt	Wako	196-01252	aCSF
Magnesium Chrolide Hexahydrate	Wako	135-00165	aCSF
MaxOne Single-Well MEA	MaxWell Biosystems
Metal Spatula
Monitoring system	SA Instruments	Model 1025	Animal preparation for MRI
Monitoring software	SA Instruments	PC-SAM V.5.12	Animal preparation for MRI
MRI compatible cradle	Bruker BioSpin	T12812	Animal preparation for MRI
MRI coil	Bruker BioSpin	T9988	For MRI
MRI operation software	Bruker BioSpin	ParaVision 5.1	For MRI
Neo LinearSlicer MT	D.S.K.	NLS-MT
NeuN (D4G40) XP Rabbit mAb	Cell Signaling	24307	For immunostaining
Normal Goat Serum	Wako	143-06561	For immunostaining
Potassium Chloride	Wako	163-03545	aCSF
Polyethylene Glycol Mono-p-isooctylphenyl Ether	nacalai tesque	12967-45	For immunostaining
Pressure-sensitive respiration sensor	SA Instruments	RS-301	Animal preparation for MRI
Preclinical MRI scanner	Bruker BioSpin	BioSpec 70/20 USR	For MRI
Pyruvic Acid Sodium Salt	nacalai tesque	29806-54	aCSF
SCAN in a BOX	Open Technologies srl
Scissors
Sieve bottle	TIGERCROWN	81	For 3D scan
SlowFade Gold Antifade Mountant	Invitrogen	S36937	For immunostaining
Sodium Chloride	Wako	191-01665	aCSF
Sodium Dihydrogenphosphate	Wako	197-09705	aCSF
Sodium Hydrogen Carbonate	Wako	191-01305	aCSF
Sodium Hydrogensulfite	nacalai tesque	31220-15	For immunostaining
Thermistor temperature probe	SA Instruments	RTP-101-B, PLTPC-300	Animal preparation for MRI
Tooth bar	Bruker BioSpin	T10146	Animal preparation for MRI
Winged intravenous needle	TERUMO	SV-23CLK	For perfusion
1 mol/l-Tris-HCl Buffer Solution	nacalai tesque	35436-01	For immunostaining
1 mol/l-Hydrochloric Acid	nacalai tesque	37314-15	For pH adjustment of solution
16%-Paraformaldehyde Aqueous Solution	Electron Microscopy Sciences	15710	For immunostaining