3D-сканирование технологии преодоления микросхем и макромасштабных изображений мозга в 3D Роман встраиваясь перекрывающихся протокол

Резюме

В этой статье вводится экспериментальный протокол с использованием технологии 3D-сканирования, преодолевая две пространственные шкалы: макроскопическую пространственную шкалу анатомии всего мозга, изображенную МРТ на уровне 100 мкм, и микроскопическую пространственную шкалу нейронных распределений с использованием иммуногистохимии окрашивания и мультиэлектродной системы массива и других методов (10 мкм).

Аннотация

Человеческий мозг, будучи многоразмерной системой, имеет как макроскопические электрические сигналы, глобально течет вдоль толстых бело-материволоконных волоконных пучков, так и микроскопические нейронные шипы, распространяющиеся вдоль аксонов и дендритов. Обе шкалы дополняют различные аспекты когнитивных и поведенческих функций человека. На макроскопическом уровне МРТ является современной стандартной технологией визуализации, при которой наименьшее пространственноеразрешение, размер вокселя, составляет 0,1-1 мм 3. Кроме того, на микроскопическом уровне, предыдущие физиологические исследования были осведомлены о неравномерной нейронной архитектуры в таких voxels. Это исследование разрабатывает мощный способ точного встраивания микроскопических данных в макроскопическую карту путем сопутсь биологическим научным исследованиям с технологическими достижениями в технологии 3D-сканирования. Так как технология 3D-сканирования в основном использовалась для проектирования и промышленного дизайна до сих пор, она впервые перепрофилирована для встраивания микроконнектомов во весь мозг, сохраняя при этом естественный пик в живых клетках мозга. Для достижения этой цели, во-первых, мы построили протокол сканирования для получения точных 3D-изображений из живых биоорганизмов, по своей сути сложных для изображения из-за влажных и отражающих поверхностей. Во-вторых, мы обучены держать скорость, чтобы предотвратить деградацию живой ткани мозга, что является ключевым фактором в сохранении лучших условий и записи более естественных нейрональных шипов от активных нейронов в тканях мозга. Два корковых поверхностных изображения, независимо извлеченные из двух различных модулей изображения, а именно МРТ и 3D-изображения поверхности сканера, удивительно показывают ошибку расстояния всего 50 мкм в качестве значения режима гистограммы. Эта точность сопоставима по масштабу с микроскопическим разрешением межклеточных расстояний; кроме того, он стабилен среди различных отдельных мышей. Этот новый протокол, 3D-роман встраивания перекрывающихся (3D-NEO) протокол, мосты макроскопических и микроскопических уровней, полученных в этом интегративном протоколе и ускоряет новые научные выводы для изучения всеобъемлющих архитектур подключения (т.е., микроконнектом).

Введение

Неоднородные многомасштабные архитектуры в различных физических и биологических организациях обычно встречаются^1,2. Мозг также является очень неравномерной и многомасштабной сетевой организации^3,4. Различные когнитивные функции закодированы в таких сетевых организациях, удерживая временные изменения электрических шипов моделей нейронных популяций в субмиллисекундных временных разрешениях. Исторически сложилось так, что сложные сети среди нейронов были структурно наблюдались в деталях с использованием методов окрашивания Сантьяго Рамон у Cajal от более чем 150 лет назад⁵. Для наблюдения за групповым поведением активных нейронов исследователи разработали различные технологии записи^6,7,8,и последние значительные разработки таких технологий позволили нам зафиксировать электрической деятельности от огромного количества нейронов одновременно. Кроме того, благодаря такой функциональной деятельности ученым удалось реконструировать сети причинно-следственных связей между огромным числом нейронов и задекларировать топоологическую архитектуру своих сложных взаимодействий «микроконнектом»⁹ . Макроскопические наблюдения мозга также позволяют в отношении всего мозга, как сетевая организация, потому что многие области мозга связаны несколькими волокнами.ru. Встраивание микроконнектомов в глобальную карту мозга по-прежнему имеет явные ограничения в рамках текущих технологических достижений, поэтому этот протокол встраивания так важен. Однако перед разработкой протокола встраивания существует много проблем. Например, для того, чтобы наблюдать за активностью живых местных нейронных цепей в чисто изолированных областях мозга, мозг ломтики должны быть произведены для записи в пробирке. Кроме того, записи из ломтиков мозга для записи in vitro по-прежнему являются важным выбором по крайней мере по двум причинам. Во-первых, до сих пор нелегко наблюдать за активностью многих живых отдельных нейронов одновременно из областей мозга глубже, чем 1,5 мм, и в высоком височном разрешении (Злт;1 мс). Во-вторых, когда мы надеемся узнать внутреннюю архитектуру локальной нейронной цепи, мы должны остановить все входы, поступающие из внешних областей мозга, чтобы устранить смешанные факторы. Для того, чтобы определить направления и положения произведенных ломтиков мозга, будет дополнительно необходимо интегрировать пространственные позиции этих произведенных ломтиков мозга с помощью координат. Есть, однако, несколько систематических и надежных способов сделать мозг ломтиками в организованном порядке^10,11. Здесь вводится новый протокол корегистрации, использующий технологию 3D-сканирования для нейронаучных исследований, чтобы обеспечить интегративный протокол. Этот протокол действует для координации микро- и макромасштабов и встраивания мультиэлектродных массивов (МЭА) микроданных^12,13 и окрашивания данных на макроскопическое пространство МРТ через 3D-сканирование поверхностей извлеченных мозгов, а также неинвазивно записанный мозг. Удивительно, но это показало погрешность расстояния всего в 50 мкм в качестве значения режима гистограммы. В результате значения режима минимальных расстояний между двумя поверхностями между поверхностью МРТ и отсканированной 3D-поверхностью составляли почти 50 мкм для всех шести мышей, что является подходящим числом при проверке общности среди людей. Типичная ширина среза имела зарегистрированную активность шипа около 300 мкм.

протокол

Все экспериментальные процедуры, описанные здесь, были одобрены Комитетом по уходу за животными Киотского университета.

1. Звери (День 1)

1. Приготовьте самки c57BL/6J мышей(n No 6, в возрасте от 3 до 5 недель).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол применим ко всем видам грызунов.

2. Настройки МРТ (День 1)

1. Поместите мышь в акриловую коробку анестезии, помещенную на коврик для нагревателя, скорректированную до 37 градусов по Цельсию с помощью контроллера коврика для нагревателя.
2. Анестезия мыши с 2% изофлуран в воздухе, протекающей через коробку со скоростью потока 1,4 л/ мин с помощью системы анестезии, которая состоит из изофлуарана испаритель, измеритель воздушного потока, и воздушный компрессор.
3. После индукции анестезии поместите мышь в колыбель, совместимую с МРТ, в лежачем положении. Проверьте, достаточно ли анестезии, отсечения ног мыши пинцетом, чтобы увидеть, если он не чувствует боли.
4. Закрепите голову мыши зубной прутьем и маской для лица, оснащенной колыбелью. Затем, поддерживать анестезию с 1% -1,5% изофлуран в воздухе на 1,4 л / мин через маску для лица.
5. Вставьте зонд температуры термистора в прямую кишку мыши и поместите чувствительный к давлению датчик дыхания на задней части мыши.
6. Перенесите колыбель на отверстие магнита МРТ. Отрегулируйте концентрацию изофлюрани примерно до 1%-1,5%, чтобы обеспечить стабильную и воспроизводимую глубину анестезии. Мониторинг, если температура тела контролируется между 33-35 градусов по Цельсию и частота дыхания между 0,5-1,3 Гц в течение всего периода МРТ экспериментов, используя систему мониторинга (Таблица материалов) для физиологических параметров мелких животных с специальное программное обеспечение(Таблица материалов).
7. Используя измеренное значение ректальной температуры, регулировать температуру тела, контролируя температуру теплого воздуха, поставляемого в магнитную скважину из системы нагревателя, оборудованной в системе мониторинга.

3. МРТ Приобретения (День 1)

1. Подготовка к 3D-медерное МРТ высокого разрешения
   1. Приобретите три магнитно-резонансных (МР) изображения в трех ортогональных (осевых, корональных и сагиттальных) плоскостях, чтобы проверить положение мыши.
   2. Ссылаясь на эти изображения, отрегулируйте положение мыши, перемещая колыбель так, чтобы центр мозга мыши расположился в центре ресонатора, а также в центре градиентных катушек в осевом направлении.
   3. Отрегулируйте систему МРТ, настраивая резонатор, регулируя однородность статического магнитного поля (шимминг) и основную частоту, и калибруя мощность радиочастот (РЧ).
   4. Приобретите изображения с низким разрешением 2D-многослойного T2-взвешенного (T2W) с корональной и сагиттальной ориентацией. На основе этих изображений определите поле зрения (FOV) для МРТ высокого разрешения 3D T2W.
   5. Выполняйте локализованный shimming с помощью алгоритма автоматического ошиного хода FASTMAP. Для протокола FASTMAP выберите прямоугольную область, которая охватывает весь мозг. После завершения локализованного перебора, подтвердите неоднородность поля B₀ в области мозга локализованным спектром ¹H с помощью точечной спектроскопии (PRESS).
   6. Приобретите изображения с низким разрешением 3D T2W, чтобы убедиться, что настройки сканирования для 3D T2W МРТ высокого разрешения являются подходящими, проверяя соответствующее положение FOV, отсутствие артефактов обертывания (псевдоним) и эффективное подавление жировых сигналов.
2. Изображение последовательности импульса
   1. После подготовки, описанной выше, приобрести высокое разрешение 3D T2W изображения всего мозга мыши, используя быстрое приобретение с релаксации повышение (RARE) последовательность.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этой статье были проведены МРТ-эксперименты на 7 Т, 210 мм горизонтальной скважине, доклиническом сканере, оснащенном градиентной системой 440 мТ/м в рампе времен100. Для возбуждения ИП ИП и приема сигнала использовался резонатор объема четырехкратной разгрузки с внутренним диаметром 35 мм. Данные МРТ были получены с помощью специального программного обеспечения для работы. Параметры приобретения последовательности импульсов 3D RARE, используемые в данном исследовании, приведены в таблице 1.

4. Подготовка экспериментальных решений (День 2)

1. Приготовьте 500 мл раствора леденящей голой резки (2,5 мм КЛ, 1,25 мМ₂PO_4,7 мМ MgCl_2,15 мМ глюкозы, 25 мм NAHCO₃, 0,5 мм CaCl₂, 11,6 мм натрия ascorbate, 3,1 мм натрия пирут, и 100 мм пузырь хлопья, 100 мм пузырь хлопина, 100 мм пузырь хлопина, 11,6 мм натрия ascorbate, 3,1 мм натриевый пирупват, и 100 мм пузырь хлои, 100 м пузырь хлоид, 100 мм пузырь хлои, 100 мм пузырьхого хлоина, 100 мм пузырьхого хлопена, 100 мм пузырьх хлопина, 100 мм пузырь хлоид с 95% O₂ и 5% CO₂). Отрегулируйте рН до 7,3–7,4.
2. Подготовка 1 l искусственной спинномозговой жидкости (ACSF; 127 мм NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ₂PO₄, 1 мМ MgCl₂, 15 мм глюкозы, 25 мм NaHCO₃, и 2 мМ CaCl₂, пузырь с 95% O₂ и 5% CO₂). Отрегулируйте рН до 7,3-7,4.

5. Подготовка оборудования (День 2)

1. Приготовьте 6,6 см² квадрата, 0,5 см магнита "кольцо" и, во-первых, поместите черную ленту и, во-вторых, хирургическую ленту на кольцо (рис.1с-2). Обратите внимание, что этот материал называется мозг блок базы (BBB), и держать его холодным на блоках льда.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Позже ленты будут прикреплены к нарезной станции с мозговыми блоками для вибратом. Квадратное кольцо используется в качестве нижней базы BBB для удовлетворения двух целей, а именно для плавного переноса блоков мозга с 3D-станции сканирования на вибратом и для точного измерения высоты блоков мозга на этапе сканирования.
2. Настройка BBB с автоматическим проигрыватель. Включите сканер и поворотный круг. Запустите программное обеспечение для обработки изображений.
3. Предваряя все эксперименты, выполняйте калибровки камер и подключенный поворотный круг структурированной световой проекции и 3D-сканера настольного типа.
   1. Включите центральный проектор, две камеры и поворотный круг. Затем откройте программное обеспечение. В программном обеспечении нажмите Оптическая настройка и выберите область изображения как 100 x 80, а номера сетки — 100 x 100. Затем калибровка камеры начинается в соответствии со следующими четырьмя шагами.
      1. Для установки проектора положите калибровочный лист на стол и положите калибровочной доску на калибровочный лист, чтобы отрегулировать точку крепления измерительной зоны до центра листа и ориентацию на переднюю часть. Отрегулируйте расстояние между проектором и доской примерно до 200 мм. Освободьте винты, фиксирующие две ручки, и поверните ручки, чтобы отрегулировать светочувствительность и фокус двух камер. Затем нажмите Стрелка, чтобы перейти к следующему шагу.
      2. Чтобы сориентировать камеры, ослабить винты фиксации двух камер себя и переместить позиции и вращения перекрываться с центральной линией на калибровочной доске, вертикальная линия, и желтый крест проецируется от проектора. Исправьте камеры и нажмите «Стрелку» снова. Затем экран станет темным.
      3. Чтобы сфокусировать камеры, после ослабления крепления винтов ручек, увеличьте чувствительность к свету и снова настройте фокус. Затем нажмите Стрелка, чтобы перейти к следующему шагу.
      4. Для значения F и степени экспозиции (камеры), отрегулируйте чувствительность света снова чуть ниже, где красная область исчезает. Затем, нажмите Стрелка еще раз, и нажмите Калибровка начала, и выбрать Да, если спросил ивы закончить оптическую настройку?
   2. Нажмите Инициализовать калибровкуи проверьте, нормализуются ли значения пикселя между 0–255. Затем нажмите Продолжить.
   3. Следуя предложенным позициям, записывайте изображения девяти различных относительных углов сканера и калибровочной доски, и заканчивайте после подтверждения процесса калибровки и, наконец, нажмите «Обновление калибровки».
   4. Обменять калибровование платы на проигрыватель, и нажмите на калибровку Turntable.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Теперь все калибровки закончены.

6. Сканирование поверхности мозга, нарезка и запись MEA (День 2)

1. Анестезируйка мыши с изофлураном 1%-1,5% и обезглавить мышь. Используйте скальпель, чтобы открыть кожу и разоблачить череп.
2. Вырезать кожу головы обезболированной мыши вдоль sagittal шов с помощью хирургического ножа, и вырезать череп в диагонали направления от лямбда точки к точке немного перед bregma с помощью хирургических ножниц. Затем аккуратно снимите череп с мозга с помощью изогнутых пинцетов.
3. Используйте шпатель, чтобы поднять мозг и перенести его в чашку Петри (100 мм х 20 мм) с раствором ледяной резки (подготовлен в шаге 4.1). Поток воздуха, содержащего 95% O₂ и 5% CO₂ от внешней газовой бомбы с контролируемой вращающейся скоростью насоса (4,0 об/мин) для генерации небольших пузырьков в ледяном растворе резки (Рисунок 1a).
4. После 1-2 мин, положить мозг на ткань микроволокна, поверхность которой слегка покрыта мучной сито, и протрите жидкость с поверхности мозга, осторожно используя ткань микроволокна(рисунок 1b).
5. Положите мозг с его оборотным аспектом на примере стенда на BBB, а также положить BBB в центре автоматического проигрыватель.
6. Затемняйте помещение во время 3D-сканирования и выполняйте 3D-сканирование на вертушке. Чтобы проверить, работает ли 3D-сканирование хорошо, нажмите 3D-сканирование, выбрав угол между двумя выстрелами как 22,5, стартовый угол как 0, и окончательный угол как 360 (Рисунок 1c-1).
7. Переместите мозг в чашку Петри, и пузырь мозга в резки раствор около 10 с.
8. Разрежьте мозг на два блока в середине корональной плоскости с помощью хирургического ножа, и переместить два блока мозга мягко на плоскую поверхность с помощью хирургического шпателя.
9. Прикрепите блоки мозга BBB с помощью мгновенного клея, и мягко и осторожно протрите жидкость с поверхности мозга в течение 1-2 мин, используя ткань из микроволокна снова. Затем выполните 3D-сканирование снова(рисунок 1c-2).
10. Прикрепите черную ленту, закрывающую центр BBB, к центру сцены резки для вибратом(рисунок 1d).
11. Налейте резки раствора в резку этапе и установить резки этапе на вибратом. Отрегулируйте скорость резки и амплитуду. Сделать 2-5 корональных ломтиков (300 мкм толщиной) из двух блоков мозга. Держите раствор в стадии резки восходящей, если это возможно(Рисунок 1e).
12. Прикрепите лезвие к держателю лезвия вибратомии и оптимизировать скорость резки, частоту и амплитуду системы, установив их как 12,7 мм/мин для скорости, 87-88 Гц для частоты и 0,8-1,0 мм для ширины качели. При тщательной резки необходимо, замедлить скорость до уровня 2-3.
13. При резке ломтиков мозга, запись нарезанные координаты в формате, в том числе передней задней координат, полушария и других условий(Рисунок 2c).
14. Аккуратно перенесите ломтики мозга в стакан, наполненный предварительно разогретым (34 градусов по Цельсию) ACSF с помощью толстой пластиковой пипетки, и инкубировать их в стакане на 34 градусов по Цельсию для 1 ч. В течение этого времени, выполнить 3D-сканирование оставшихся блоков мозга на этапе резки(Рисунок 1c-2).
15. Установите чип MEA на блок записи. Подключите чип к перистальтике насоса с помощью двух труб. Используйте одну трубку, чтобы направлять тот же ACSF в чип MEA, а другую трубку, чтобы направлять ACSF из чипа MEA.
16. Прикрепите две иглы (0,60 мм х 19 мм), соединенные на кончиках двух труб, к верхней части стены чипа MEA, и зафиксировать их позиции с их кончиками после внутренней стенки чипа MEA. Установите скорость потока ACSF до 4,1 об/мин.
17. После 1 ч прошло, переместить ломтик на чип с помощью толстой пластиковой пипетки, и установить положение с помощью мягкой кисти. Затем начните процесс записи нейронной активности(рисунок 2-d).

7. Иммуногистохимия окрашивание (Дни 3 и 4)

1. После завершения записи MEA перенесите ломтики на 1,5 мл труб, наполненных 4% параформальдегидом (PFA) в фосфатно-буферный солен (PBS). Инкубировать их на ночь при 4 градусах Цельсия. Затем удалите 4% PFA раствор, и мыть ломтики 3x с PBS в течение 5 минут в общей сложности.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости вставьте ломтики в 20% желатина / PBS и резекции ломтик, чтобы сделать его тоньше, чем 50 мкм, используя вибратом.
2. Подготовка раствора для извлечения антигена (цитрат натрия 10 мМ, рН 6.0). Удалите PBS из последней стирки и добавьте раствор извлечения антигена.
3. Вскипятите воду в электрическом термосе и инкубировать трубки с ломтиками в течение 20 минут при 95-98 градусов по Цельсию в кастрюле, а затем естественное охлаждение.
4. Приготовьте 50 мМ трис-буферизированный солен и добавьте 1% Na bisulfite (1% Решение Na bisulfite-Tris). Отрегулируйте рН до 7,5. Затем промойте ломтики раствором Na bisulfite-Tris в течение 5 мин при комнатной температуре (20–25 градусов по Цельсию).
5. Приготовьте блокирующее решение, добавив 4% нормальной козьей сыворотки и 0,5% этикилат атэтиксилата октильфенола к 1% раствору Na bisulfite-Tris.
6. Удалите 1% Раствор Na bisulfite-Tris из трубок с ломтиками и добавьте блокирующий раствор. Инкубировать 2 ч при комнатной температуре.
7. Подготовьте основной антитело, добавив 1% нормальной сыворотки коз и 0,5% Triton X-100 к 1% Na bisulfite-Tris раствор и разбавления первичных антител. Используйте следующие концентрации первичных антител: 1:800 мыши анти-GAD67 и 1:500 кролика анти-NeuN.
8. Удалить 1% Na bisulfite-Tris раствор из труб с ломтиками и добавить основной раствор антитела. Инкубировать его на ночь при 4 градусах Цельсия.
9. Приготовьте 50 мМ трис-буферизированный солен и добавьте 8,5 г/л NaCl (раствор Tris-NaCl). Титрат рН до 7,5. Затем вымойте ломтики 3x раствором Tris-NaCl (20–25 градусов по Цельсию) в общей сложности на 5 минут.
10. Подготовьте второй антитело, добавив 3% нормальной козьей сыворотки и 0,3% Triton X-100 в раствор Tris-NaCl и разбавив вторичные антитела. Используйте следующие концентрации вторичных антител: 1:500 козла анти-мыш и 1:500 козла анти-кролика.
11. Удалите раствор Tris-NaCl из трубок с ломтиками и добавьте вторичный раствор антитела. Инкубировать его в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем вымойте ломтики 3x раствором Tris-NaCl в общей сложности 5 минут.
12. Поместите ломтики на слайд с помощью небольшой кисти и применить монтаж амносов и coverslip. Изучите слайды с помощью конфокального микроскопа. Сфотографировать поверхность ломтика(Рисунок 2e).

8. Обработка данных МРТ для извлечения кортикальных томов

1. Установите свободное программноеобеспечение FSL (https://fsl.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fslwiki/FslInstallation). Подготовьте МРТ-изображения, полученные в разделе 3.
2. Измените формат изображения с помощью команды fslchfiletype NIFTI-PAIR-G. Расширить изображение мозга, чтобы сделать его таким же большим, как человеческий мозг, используя команду fslcreatehd, и, при необходимости, изменить ориентацию с помощью fslorient с опцией -setqformcode 1. После этого восстановите исходный формат файла с помощью fslchfiletype NIFTI-G . Точная команда заключается в следующем.
   fslchfiletype NFTI-PAIR (ввхожное изображение).nii.gz
   fslcreatehd 144 196 160 1 0,95 0,6 1,15 0 0 0 4 (входное изображение).hdr.gz
   fslorient -setqformmcode 1 (ввхожёе изображение).hdr.gz
   fslchfiletype НИФТИЗГ (ввхожное изображение)
3. Введите fsl, чтобы открыть программное обеспечение FSL. Извлекайте мозги, используя команду ставок, из графического пользовательского интерфейса (GUI), но не чистить слишком много. Затем, контролировать фракционные пороги интенсивности, ... Оптимальные значения отличаются для отдельных данных.
4. Изобразите изображение мозга до исходного размера мозга мыши, используя ту же процедуру, что и в шаге 8.2. Точная команда, как следовать:
   fslchfiletype NFTI-PAIR (ввхожное изображение).nii.gz
   fslcreatehd 144 196 180 1 0,1 0,1 0,0 0 0 0 4 «входное изображение».hdr.gz
   fslorient -setqformmcode 1 (ввхожёе изображение).hdr.gz
   fslchfiletype НИФТИЗГ (ввхожное изображение)
5. Coregistrate все изображения мозга с помощью команды флирта, и производить усредненный образ мозга, используя -добавить вариант и -div вариант fslmaths команды.
   fslmaths «изображение мозга 1» -добавить ...
6. Сделайте усредненку мозга чище, используя опцию -thr команды fslmaths. Затем выберите оптимальное пороговое значение, адаптивное к отдельным случаям.
   fslmaths (среднее имя изображения) - thr (thr значение, например, 5000) «пороговое среднее изображение»
7. Наконец, изменить усредненство изображение мозга в координаты человека с помощью команды флирта снова. Затем, подготовить довольно чистые извлеченные коры головного мозга(рисунок 2a).
   ПРИМЕЧАНИЕ: К сожалению, обонятельная лампа и мозжечок не будет совершенным в реконструированных поверхности мозга от объемов МРТ из-за существенных ограничений FSL программного обеспечения, чтобы покорить все части мозга, включая обонятельную луковицу и мозжечок.

9. Обработка изображений МРТ для полоски кортикальных поверхностей

1. Скачать другое бесплатное программное обеспечение, 3D Slicer(https://download.slicer.org/).
2. Откройте MR изображения извлеченных мозгов (нажмите файл и выберите Добавить данные),произведенные в соответствии с разделом 8, используя объем Рендеринга и редактора модулей в 3D Slicer.
3. Измените режим от редактора к рендерингу томаи нажмите кнопку-мишень, чтобы изображение мозга пришло к центру экрана.
4. Выберите режим MR-T2-мозга и настройте порог, переместив панель Shift. Затем отойдите от рендеринга тома к редактору и нажмите кнопку эффекта Порога.
5. Примените этикетку 41. Кора головного мозга и сохранить данные поверхности мозга, как .stl файл. Затем измените формат файла с .vtk на .stlи сохраните файл, проверив форму.

10. Предварительная обработка данных 3D-сканирования

1. Выполните автоматическую корегистрацию среди 8 или 16 изображений, сделанных с 8 или 16 различных углов в последовательности сканирования, чтобы исправить небольшие несоответствия между ними, нажав Глобальную регистрацию, включенную в опцию выравнивания, и интегрировать их. Повторите сканирование с разных углов, чтобы получить всю поверхность мозга(рисунок 2b).
   1. Если интеграция между изображениями, отсканированными под разными углами, не увенчалась успехом, нажмите выравнивание руководства и выберите пару фиксированного изображения и движущегосяизображения.
   2. Нажмите "Начать", чтобы начать ручное выравнивание изображений, выбрав три или четыре точки общего на разных изображениях. Затем нажмите OK. Алгоритм оптимизации — это итеративный алгоритм ближайшей точки (ICP)¹⁰. Он не включает нелинейную деформацию.
2. Сделайте сетку всех выровненных изображений (т.е. наборов данных точек), выбрав все изображения и нажав кнопку генерации сетки. Затем выберите вариант Малый художественный объект, чтобы получить сетку в качестве самого высокого разрешения. Затем сохраните изображение как двоичное .stl или в формате ASCII.

11. Корегистрация МРТ поверхности и 3D-сканирования поверхности

1. Откройте поверхность МРТ и сваите ее с 3D-сканированием поверхности с помощью программного обеспечения для обработки поверхности. Затем выполните процесс ручного выравнивания, используя ту же процедуру, что описано в шагах 10.1.1 и 10.1.2. Затем снова сохраните эти скоорвенные изображения поверхности (рисунок 2a,b).
   1. При необходимости очищайте данные о отдельных поверхностях, например, стирая небольшие шумы, окружающие область мозга, особенно в случае данных МРТ, и заполняя отверстия, если таковые имеются, особенно в случае данных 3D-сканирования.
2. Наконец, откройте данные поверхности с помощью программного обеспечения для анализа данных, например, MATLAB, и выполните и оцените гистограммы минимальных расстояний между двумя поверхностями.

Результаты

Мы оценивали расстояния между корковыми поверхностями, получаемыми путем зачистки объема МРТ, и поверхностями, полученными в виде 3D-сканирования извлеченных мозгов. Значения режима гистограммы расстояний составляют всего 55 мкм(рисунок 3а). Кроме того,...

Обсуждение

Мы разработали новый протокол под названием 3D-NEO протокол для преодоления макроскопических и микроскопических пространственных масштабах путем перекрытия двух поверхностей мозга более точно, чем раньше. Первоначально, было две проблемы в создании этого протокола, который сделал возм...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Air compressor	Kimura Medical	KA-100	Animal preparation for MRI
All-in-one fluorescence microscope	KEYENCE	BZ-X710
Anesthesia box	Bio Research Center	RIC-01	Animal preparation for MRI
Anesthesia system	ACOMA Medical Industry	NS-5000A	Animal preparation for MRI
Anti-GAD67, clone 1G10.2	Merk Millipore	MAB5406	For immunostaining
Calcium Chrolide	nacalai tesque	06729-55	aCSF
Choline Chloride	nacalai tesque	08809-45	aCSF
Curved blunt forceps
Disposal scalpel	Kai	10
D-PBS(-) without Ca and Mg, liquid (10x)	nacalai tesque		For immunostaining
D(+)-Glucose	Wako	049-31165	aCSF
Gelatin	nacalai tesque	16605-42	re-secctioning
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488	Invitrogen	A32723	For immunostaining
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555	Invitrogen	A32732	For immunostaining
Heater mat	Bio Research Center	HM-10	Animal preparation for MRI
Heater mat controller	Bio Research Center	BWT-100A	Animal preparation for MRI
Heater system	SA Instruments	MR-compatible Small Animal Heating System	Animal preparation for MRI
Isoflurane	AbbVie		Animal preparation for MRI
Isoflurane vaporizer	ACOMA Medical Industry	MKIIIai	Animal preparation for MRI
Linear Slicer	DOSAKA	Neo Linear Slicer MT
L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt	Wako	196-01252	aCSF
Magnesium Chrolide Hexahydrate	Wako	135-00165	aCSF
MaxOne Single-Well MEA	MaxWell Biosystems
Metal Spatula
Monitoring system	SA Instruments	Model 1025	Animal preparation for MRI
Monitoring software	SA Instruments	PC-SAM V.5.12	Animal preparation for MRI
MRI compatible cradle	Bruker BioSpin	T12812	Animal preparation for MRI
MRI coil	Bruker BioSpin	T9988	For MRI
MRI operation software	Bruker BioSpin	ParaVision 5.1	For MRI
Neo LinearSlicer MT	D.S.K.	NLS-MT
NeuN (D4G40) XP Rabbit mAb	Cell Signaling	24307	For immunostaining
Normal Goat Serum	Wako	143-06561	For immunostaining
Potassium Chloride	Wako	163-03545	aCSF
Polyethylene Glycol Mono-p-isooctylphenyl Ether	nacalai tesque	12967-45	For immunostaining
Pressure-sensitive respiration sensor	SA Instruments	RS-301	Animal preparation for MRI
Preclinical MRI scanner	Bruker BioSpin	BioSpec 70/20 USR	For MRI
Pyruvic Acid Sodium Salt	nacalai tesque	29806-54	aCSF
SCAN in a BOX	Open Technologies srl
Scissors
Sieve bottle	TIGERCROWN	81	For 3D scan
SlowFade Gold Antifade Mountant	Invitrogen	S36937	For immunostaining
Sodium Chloride	Wako	191-01665	aCSF
Sodium Dihydrogenphosphate	Wako	197-09705	aCSF
Sodium Hydrogen Carbonate	Wako	191-01305	aCSF
Sodium Hydrogensulfite	nacalai tesque	31220-15	For immunostaining
Thermistor temperature probe	SA Instruments	RTP-101-B, PLTPC-300	Animal preparation for MRI
Tooth bar	Bruker BioSpin	T10146	Animal preparation for MRI
Winged intravenous needle	TERUMO	SV-23CLK	For perfusion
1 mol/l-Tris-HCl Buffer Solution	nacalai tesque	35436-01	For immunostaining
1 mol/l-Hydrochloric Acid	nacalai tesque	37314-15	For pH adjustment of solution
16%-Paraformaldehyde Aqueous Solution	Electron Microscopy Sciences	15710	For immunostaining