Tecnologia de digitalização 3D Bridging microcircuitos e imagens cerebrais Macroscale em 3D Novel incorporação de protocolo de sobreposição

Resumo

Este artigo introduz um protocolo experimental utilizando tecnologia de digitalização 3D que constrói duas escalas espaciais: a escala espacial macroscópica da anatomia do cérebro inteiro imaged por RM a > 100 μm e a escala espacial microscópica de distribuições neuronais utilizando Coloração imuno-histoquímica e um sistema de arranjo multieletrodo e outros métodos (~ 10 μm).

Resumo

O cérebro humano, sendo um sistema multidimensionado, tem sinais elétricos macroscópicos, fluindo globalmente ao longo de feixes de fibras de matéria branca grossas, e picos neuronais microscópicos, propagando-se ao longo de axônios e dendritos. Ambas as escalas complementam diferentes aspectos das funções cognitivas e comportamentais humanas. No nível macroscópico, a RM tem sido a atual tecnologia de imagem padrão, na qual a menor resolução espacial, tamanho de VOXEL, é de 0,1 – 1 mm³. Também, no nível microscópico, os estudos fisiológicos precedentes estavam cientes de arquiteturas neuronal não uniforme dentro de tais voxels. Este estudo desenvolve uma maneira poderosa de incorporar com precisão dados microscópicos em um mapa macroscópico por meio da interface de pesquisa científica biológica com avanços tecnológicos na tecnologia de digitalização 3D. Desde que a tecnologia da exploração 3D tem sido usada na maior parte para a engenharia e o projeto industrial até agora, reaproveitado para a primeira vez incorporar microconnectomes no cérebro inteiro ao preservar o spiking natural em pilhas de cérebro vivas. A fim alcançar esta finalidade, primeiramente, nós construímos um protocolo da exploração para obter imagens 3D exatas dos bio-organismos vivos que desafiam inerentemente à imagem devido às superfícies húmidas e reflexivas. Em segundo, nós treinamos para manter a velocidade para impedir a degradação do tecido vivo do cérebro, que é um factor chave em reter melhores condições e em registrar uns pontos neuronal mais naturais dos neurônios ativos no tecido de cérebro. Duas imagens de superfície corticais, independentemente extraídas de dois módulos de imagem diferentes, ou seja, ressonância magnética e imagens de superfície do scanner 3D, surpreendentemente mostram um erro de distância de apenas 50 μm como valor de modo do histograma. Esta exatidão é comparável na escala à definição microscópica de distâncias intercelular; também, é estável entre diferentes camundongos individuais. Este novo protocolo, o romance 3D incorporando sobreposição (3D-NEO) protocolo, pontes macroscópicas e microscópicos níveis derivados por este protocolo integrativo e acelera novos achados científicos para estudar arquiteturas de conectividade abrangentes (ou seja, microconnectome).

Introdução

Arquiteturas multiescala não uniformes em várias organizações físicas e biológicas são comumente encontradas^1,2. O cérebro também é uma organização de rede muito não uniforme e multiescala^3,4. As várias funções cognitivas são codificadas em tais organizações da rede, prendendo mudanças temporais de testes padrões elétricos do ponto de populações neuronal em resoluções temporais do de. Historicamente, as complexas redes entre os neurônios foram estruturalmente observadas em detalhes usando as técnicas de coloração por Santiago Ramón y Cajal de mais de 150 anos atrás⁵. Para observar os comportamentos de grupo de neurônios ativos, pesquisadores desenvolveram várias tecnologias de gravação^6,7,8, e os recentes desenvolvimentos significativos de tais tecnologias permitiram-nos gravar atividades elétricas de um grande número de neurônios simultaneamente. Além disso, a partir de tais atividades funcionais, os cientistas conseguiram reconstruir redes de interações causais entre um grande número de neurônios e declararam a arquitetura topológica de suas interações complexas ' microconnectome '⁹ . As observações macroscópicas do cérebro também permitem a respeito de um cérebro inteiro como uma organização de rede porque muitas regiões cerebrais são conectadas por múltiplos feixes de fibra. A incorporação de microconnectomes no mapa global do cérebro ainda tem limitações claras dentro dos avanços tecnológicos atuais, e é por isso que esse protocolo de incorporação é tão importante. No entanto, há muitos desafios para o desenvolvimento do protocolo de incorporação. Por exemplo, a fim observar atividades de circuitos neuronal locais vivos em regiões puramente isoladas do cérebro, as fatias do cérebro precisam de ser produzidas para gravações in vitro. Além disso, as gravações de fatias cerebrais para gravações in vitro ainda são uma escolha importante por pelo menos duas razões. Em primeiro lugar, ainda não é fácil observar as atividades de muitos neurônios individuais vivos simultaneamente de regiões cerebrais mais profundas do que ~ 1,5 mm e em alta resolução temporal (< 1 ms). Em segundo lugar, quando esperamos conhecer a arquitetura interna de um circuito neuronal local, precisamos parar todas as entradas provenientes de regiões cerebrais externas para eliminar fatores de confundimento. A fim de identificar as direções e posições das fatias cerebrais produzidas, será ainda necessário integrar as posições espaciais dessas fatias cerebrais produzidas usando coordenadas. Há, entretanto, algumas maneiras sistemáticas e confiáveis de fazer fatias do cérebro em uma maneira organizada^10,11. Aqui, um novo protocolo de coregistração é introduzido, usando a tecnologia de digitalização 3D para pesquisa neurocientífica, a fim de fornecer um protocolo integrativo. Este protocolo atua para coordenar micro e macroscales e incorporar microdados de matriz multieletrodo (mea)^12,13 e dados de coloração em um espaço de ressonância magnética macroscópica através de superfícies de digitalização 3D de cérebros extraídos, bem como de cérebros não invasivamente gravados. Surpreendentemente, isso mostrou um erro de distância de apenas ~ 50 μm como o valor de modo do histograma. Como resultado, os valores de modo de distâncias mínimas entre duas superfícies entre a superfície de ressonância magnética e a superfície 3D digitalizada foram quase 50 μm para todos os seis camundongos, o que é um número adequado quando se verifica a semelhança entre os indivíduos. A largura típica da fatia tinha uma atividade de espiga gravada de cerca de 300 μm.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de cuidados com animais da Universidade de Kyoto.

1. animais (dia 1)

1. Prepare camundongos fêmeas C57BL/6J (n = 6, com idades entre 3 − 5 semanas).
   Nota: Este protocolo é aplicável a todas as espécies de roedores.

2. ajustes de MRI (dia 1)

1. Põr o rato em uma caixa acrílica da anestesia coloc em uma esteira do calefator ajustada a 37 ° c usando um controlador da esteira do calefator.
2. Anestesiar o rato com isoflurano a 2% em fluxo aéreo através da caixa a uma vazão de 1,4 L/min utilizando um sistema de anestesia, que é composto por um vaporizador isoflurano, medidor de fluxo de ar e compressor de ar.
3. Após a indução da anestesia, coloque o mouse em um berço compatível com RM na posição prona. Verifique se a anestesia é suficiente, cortando um dedo do mouse com pinças para ver se ele não sente dor.
4. Fixe a cabeça do rato com a barra de dentes e a máscara protectora equipada com o suporte. Em seguida, manter a anestesia com 1% − 1,5% de isoflurano no ar a 1,4 L/min através da máscara facial.
5. Insira uma sonda de temperatura de termistor no reto do mouse e coloque um sensor de respiração sensível à pressão na parte de trás do mouse.
6. Transfira o berço para o furo de um ímã de ressonância magnética. Ajuste a concentração de isoflurano para cerca de 1% − 1,5% para garantir uma profundidade de anestesia estável e reprodutível. Monitore se a temperatura corporal é controlada entre 33 − 35 ° c e a taxa de respiração entre 0,5 − 1,3 Hz durante todo o período de experimentos de RM, usando um sistema de monitoramento (tabela de materiais) para os parâmetros fisiológicos de pequenos animais com software dedicado (tabela de materiais).
7. Usando o valor medido da temperatura rectal, regule a temperatura de corpo controlando a temperatura do ar morno fornecido no furo do ímã de um sistema do calefator equipado no sistema de monitoração.

3. aquisições de RM (dia 1)

1. Preparações para a alta resolução 3D T2-weighted MRI scan
   1. Adquira três imagens de ressonância magnética (RM) em três planos ortogonais (axial, coronal e sagital) para verificar a posição do mouse.
   2. Referindo-se a essas imagens, ajuste a posição do mouse movendo o berço para que o centro do cérebro do mouse é posicionado no centro do ressonador, bem como no centro das bobinas de gradiente em direção axial.
   3. Ajuste o sistema de ressonância magnética ajustando o ressonador, regulando a homogeneidade estática do campo magnético (shimming) e a frequência básica, e calibrando a potência de radiofrequência (RF).
   4. Adquira imagens 2D ponderadas em T2 de baixa resolução (T2W) com orientações coronal e sagital. Com base nessas imagens, determine o campo de visão (FOV) para uma varredura 3D T2W MRI de alta resolução.
   5. Execute a shimming localizada usando um algoritmo de correção automática FASTMAP. Para o protocolo FASTMAP, selecione uma região retangular que cubra todo o cérebro. Após a conclusão do shimming localizado, confirme a inhomogeneidade do campo de B₀ dentro da região do cérebro por um espectro localizado de ¹H usando a espectroscopia ponto-resolvida (imprensa).
   6. Adquira imagens 3D T2W de baixa resolução para garantir que as configurações de digitalização para 3D T2W MRI de alta resolução sejam apropriadas verificando a posição apropriada do FOV, a ausência de artefatos envolvente (aliasing) e a eficiente supressão de sinais de gordura.
2. Sequência de impulsos de imagem
   1. Após as preparações descritas acima, adquira imagens 3D T2W de alta resolução do cérebro inteiro do mouse, usando uma rápida aquisição com a sequência de realce de relaxamento (RARE).
      Nota: Neste artigo, os experimentos de RM foram conduzidos em um furo horizontal de 7 T, 210 mm, scanner pré-clínico, equipado com um sistema de gradiente de 440 mT/m no tempo de rampa de 100 μs. Um ressonador do volume da quadratura com um diâmetro interno de 35 milímetros foi usado para a excitação do RF e A recepção do sinal. Os dados de MRI foram adquiridos com um software dedicado da operação. Os parâmetros de aquisição da sequência de pulsos 3D RARE utilizados neste estudo estão resumidos na tabela 1.

4. preparação de soluções experimentais (dia 2)

1. Prepare 500 mL de uma solução de corte gelada (2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH₂po₄, 7 mm MgCl₂, 15 mm glicose, 25 mM NaHCO₃, 0,5 mm CAcl₂, 11,6 mm ascorbato de sódio, 3,1 mm piruvato de sódio, e 100 mm cloreto de colina, borbulhou com 95% O₂ e 5% co₂). Ajuste o pH a 7.3 − 7.4.
2. Prepare 1 L do líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF; 127 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH₂po₄, 1 mm MgCl₂, 15 mm glicose, 25 mM NaHCO₃e 2 mM CAcl₂, BORBULHOU com 95% O₂ e 5% co₂). Ajuste o pH para 7.3 – 7.4.

5. preparação do equipamento (dia 2)

1. Prepare uma 6,6 cm² quadrado, 0,5 cm de espessura ímã "anel" e, primeiro, coloque a fita preta e, em segundo lugar, a fita cirúrgica no anel (Figura 1C-2). Note-se que este material é nomeado um cérebro-bloco base (BBB), e mantê-lo frio em blocos de gelo.
   Nota: Mais tarde, as fitas serão anexadas à estação de fatiamento com blocos cerebrais para o vibratome. O anel quadrado é usado como a base inferior do BBB para satisfazer duas finalidades, a saber migrar blocos do cérebro lisamente da estação da varredura 3D a um do e medir exatamente as alturas dos blocos do cérebro na etapa da exploração.
2. Configure o BBB com uma mesa giratória automática. Ligue o scanner e a mesa giratória. Inicie o software de processamento de imagem.
3. Precedendo todos os experimentos, realize calibrações das câmeras e a plataforma giratória conectada de uma projeção de luz estruturada e um scanner 3D tipo desktop.
   1. Ligue o projetor central, as duas câmeras e a plataforma giratória. Em seguida, abra o software. No software, clique em configuração óptica e selecione a área de imagem como 100 x 80 e os números de grade como 100 x 100. Em seguida, a calibração da câmera começa de acordo com as quatro etapas a seguir.
      1. Para a configuração do projetor, coloque a folha de calibração na mesa e colocar a placa de calibração na folha de calibração para ajustar o ponto de fixação da área de medição para o centro da folha e a orientação para a frente. Ajuste a distância entre o projetor e a placa para cerca de 200 mm. Solte os parafusos que fixam os dois botões e gire os botões para ajustar a sensibilidade à luz e o foco das duas câmeras. Em seguida, clique em seta para ir para a próxima etapa.
      2. Para orientar as câmeras, solte os parafusos que fixam as duas câmeras e mova as posições e as rotações para se sobrepor à linha central na placa de calibração, na linha vertical e na Cruz amarela projetada do projetor. Corrija as câmeras e clique em seta novamente. Em seguida, a tela se tornará escura.
      3. Para focar as câmeras, depois de afrouxar os parafusos de fixação dos botões, aumente a sensibilidade à luz e sintonize o foco novamente. Em seguida, clique em seta para ir para a próxima etapa.
      4. Para o valor de F e o grau de exposição (da câmera), ajuste a sensibilidade de luz novamente para apenas abaixo onde a região vermelha desaparece. Em seguida, clique em seta novamente e clique em início de calibraçãoe escolha Sim se perguntado você terminou a configuração óptica?
   2. Clique em inicializar a calibraçãoe verifique se os valores de pixel são normalizados entre 0 – 255. Em seguida, clique em continuar.
   3. Seguindo as posições sugeridas, registre imagens de nove ângulos relativos diferentes do varredor e da placa da calibração, e termine-o após ter confirmado o processo da calibração, e, finalmente, clique a actualização da calibração.
   4. Troque a placa de calibração para a mesa giratória e clique na calibração da mesa giratória.
      Nota: Agora, todas as calibrações estão terminadas.

6. digitalização de superfície cerebral, fatiamento e gravação MEA (dia 2)

1. Anestesiar um rato com 1% − 1,5% de isoflurano e decapitar o rato. Use um bisturi para abrir a pele e expor o crânio.
2. Corte o couro cabeludo do rato anestesiado ao longo da sutura sagital usando uma faca cirúrgica, e corte o crânio em direções diagonais do ponto lambda para um ponto um pouco na frente da Bregma usando tesouras cirúrgicas. Em seguida, retire suavemente o crânio do cérebro usando pinças curvas.
3. Use uma espátula para levantar o cérebro e transferi-lo para uma placa de Petri (100 mm x 20 mm) com solução de corte gelada (preparada na etapa 4,1). Fluxo de ar contendo 95% O₂ e 5% co₂ de uma bomba de gás externa com uma velocidade de rotação controlada da bomba (~ 4,0 rpm) para gerar pequenas bolhas na solução de corte de gelo-frio (Figura 1a).
4. Após 1 – 2 min, coloque o cérebro em um pano de microfibra cuja superfície é levemente coberta por uma peneira de farinha, e limpe o fluido da superfície do cérebro, usando suavemente o pano de microfibra (Figura 1b).
5. Põr o cérebro com seu aspecto dorsal acima no carrinho da amostra no BBB, e põr também o BBB no centro do Turntable automático.
6. Escurecer a sala durante a digitalização 3D e realizar uma digitalização 3D na plataforma giratória. Para testar se a digitalização 3D funciona bem, clique em digitalização 3D selecionando o ângulo entre dois tiros como 22,5, o ângulo inicial como 0 e o ângulo final como 360 (Figura 1C-1).
7. Mova o cérebro para uma placa de Petri, e Borbulhe o cérebro na solução de corte por aproximadamente 10 s.
8. Corte o cérebro em dois blocos no meio do plano coronal usando uma faca cirúrgica, e mova os dois blocos cerebrais suavemente para a superfície plana usando uma espátula cirúrgica.
9. Anexar os blocos cerebrais do BBB usando cola instantânea, e suavemente e cuidadosamente Limpe o fluido da superfície do cérebro dentro de 1-2 min, usando um pano de microfibra novamente. Em seguida, realize uma digitalização 3D novamente (Figura 1C-2).
10. Anexar a fita preta cobrindo o centro do BBB para o centro do estágio de corte para um do (Figura 1D).
11. Derrame a solução do corte no estágio de corte e ajuste o estágio de corte no vibratome. Ajuste a velocidade de corte e a amplitude. Faça 2 – 5 fatias coronais (300 μm de espessura) dos dois blocos cerebrais. Mantenha a solução na fase de corte borbulhando se possível (Figura 1e).
12. Prenda uma lâmina ao suporte da lâmina do do e otimize a velocidade de corte, a frequência e a amplitude de vibração do sistema, definindo-as como 12,7 mm/min para a velocidade, 87 – 88 Hz para a frequência e 0,8 – 1,0 mm para a largura do balanço. Quando o corte cuidadoso for necessário, diminua a velocidade para o nível 2 – 3.
13. Ao cortar as fatias cerebrais, registre a coordenada cortada no formato, incluindo a coordenada anterior-posterior, hemisfério e outras condições (Figura 2C).
14. Transfira delicadamente as fatias do cérebro a um béquer enchido com o pré-aquecido (~ 34 ° c) ACSF usando uma pipeta plástica grossa, e incubar-os no copo em ~ 34 ° c para ~ 1 h. Durante este tempo, realize uma varredura 3D dos restantes blocos cerebrais na fase de corte (Figura 1C-2).
15. Defina um chip MEA em uma unidade de gravação. Conecte o chip a uma bomba peristáltica usando dois tubos. Use um tubo para guiar o mesmo ACSF na microplaqueta de MEA e no outro tubo para guiar ACSF fora do chip MEA.
16. Prenda duas agulhas (0,60 mm x 19 mm), conectadas nas pontas dos dois tubos, até o topo da parede do chip MEA, e fixar suas posições com suas pontas seguindo a parede interna do chip MEA. Ajuste a taxa de fluxo do ACSF a 4,1 RPM.
17. Após 1 h passou, mova uma fatia na microplaqueta usando uma pipeta plástica grossa, e ajuste a posição usando uma escova macia. Em seguida, inicie o processo de gravação de atividades neuronais (Figura 2-d).

7. imunohistoquímica coloração (dias 3 e 4)

1. Após a gravação do MEA ser concluída, transfira as fatias para 1,5 mL de tubos preenchidos com paraformaldeído a 4% (PFA) em soro fisiológico tamponado por fosfato (PBS). Incubar-os durante a noite a 4 ° c. Em seguida, retire a solução de PFA de 4% e lave as fatias 3x com PBS durante 5 min no total.
   Nota: Se necessário, incorporar as fatias em 20% gelatina/PBS e ressecção da fatia para torná-lo mais fino do que 50 μm, usando o vibratome.
2. Prepare a solução de recuperação do antígeno (10 mM de citrato de sódio, pH 6,0). Retire a PBS da última lavagem e adicione a solução de recuperação do antígeno.
3. Ferva a água em uma panela térmica elétrica e incubar os tubos com as fatias de 20 min em ~ 95 – 98 ° c no pote, seguido de resfriamento natural.
4. Prepare 50 mm de soro fisiológico com tampão Tris e adicione 1% na bissulfito (1% na solução de bissulfito-Tris). Ajuste o pH para 7,5. Em seguida, lave as fatias com 1% na solução de bisulfite-Tris por 5 min à temperatura ambiente (~ 20 – 25 ° c).
5. Prepare a solução de bloqueio adicionando 4% de soro de cabra normal e 0,5% de etoxilato de Octilfenol à solução de 1% na bisulfite-Tris.
6. Retire a solução de 1% na bisulfite-Tris dos tubos com as fatias e adicione a solução de bloqueio. Incubar por 2 h à temperatura ambiente.
7. Prepare a solução de anticorpos primários adicionando 1% de soro de cabra normal e 0,5% Triton X-100 à solução de 1% na bisulfite-Tris e diluindo anticorpos primários. Use as seguintes concentrações de anticorpos primários: 1:800 de mouse anti-GAD67 e 1:500 de coelho anti-NeuN.
8. Retire a solução de 1% na bisulfite-Tris dos tubos com as fatias e adicione a solução de anticorpo primário. Incubar-lo durante a noite a 4 ° c.
9. Prepare 50 mM de solução salina tampão Tris e adicione 8,5 g/L de NaCl (Tris-NaCl Solution). Titrate o pH a 7,5. Em seguida, lave as fatias 3x com a solução Tris-NaCl (~ 20 – 25 ° c) durante 5 min no total.
10. Prepare a segunda solução de anticorpos adicionando 3% de soro de cabra normal e 0,3% Triton X-100 à solução Tris-NaCl e diluindo anticorpos secundários. Use as seguintes concentrações de anticorpos secundários: 1:500 de cabra anti-mouse e 1:500 de cabra anti-coelho.
11. Remova a solução de tris-NaCl dos tubos com as fatias e adicione a solução secundária do anticorpo. Incubar por 2 h à temperatura ambiente. Em seguida, lave as fatias 3x com a solução Tris-NaCl por 5 min no total.
12. Coloque as fatias no slide usando um pincel pequeno e aplique suportes de montagem e uma lamínula. Examine as lâminas com um microscópio confocal. Tirar imagens da superfície de uma fatia (Figura 2e).

8. processamento de dados de MRI para extrair volumes corticais

1. Instale o software livre FSL (https://FSL.fmrib.Ox.AC.uk/FSL/fslwiki/FslInstallation). Prepare as imagens de ressonância magnética adquiridas na seção 3.
2. Altere o formato de imagem usando o comando fslchfiletype NIFTI_PAIR_GZ . Expanda a imagem do cérebro para torná-lo tão grande quanto um cérebro humano usando o comando fslcreatehd e, se necessário, alterar a orientação usando fslorient com a opção -setqformcode 1. Depois disso, recupere o formato de arquivo original usando fslchfiletype NIFTI_GZ. O comando exato é o seguinte.
   fslchfiletype NFTI_PAIR [imagem de entrada]. Nii. gz
   fslcreatehd 144 196 160 1 0,95 0,6 1,15 0 0 0 0 4 [imagem de entrada]. HDR. gz
   fslorient – setqformmcode 1 [imagem de entrada]. HDR. gz
   fslchfiletype NIFTI_GZ [imagem de entrada]
3. Digite FSL para abrir o software FSL. Extraia cérebros usando o comando Bet a partir da interface gráfica do usuário (GUI), mas não descasque muito. Em seguida, controle os limiares de intensidade fracionária,... e as coordenadas do centro da esfera inicial da superfície cerebral com cuidado. Os valores ideais são diferentes para dados individuais.
4. Redimensione a imagem cerebral para o tamanho original do cérebro do mouse, usando o mesmo procedimento que na etapa 8,2. O comando exato é como segue:
   fslchfiletype NFTI_PAIR [imagem de entrada]. Nii. gz
   fslcreatehd 144 196 180 1 0,1 0,1 0, 8 0 0 0 0 4 [imagem de entrada]. HDR. gz
   fslorient – setqformmcode 1 [imagem de entrada]. HDR. gz
   fslchfiletype NIFTI_GZ [imagem de entrada]
5. Coregistrate todas as imagens do cérebro usando o comando Flirt , e produza uma imagem média do cérebro usando a opção -Add e a opção -div do comando fslmaths .
   fslmaths [imagem do cérebro 1] – Adicionar... – adicionar [imagem do cérebro N] – div N [nome da imagem média] – odt float
6. Faça o limpador de cérebro em média usando a opção -thr do comando fslmaths . Em seguida, selecione um valor de limite ideal adaptável a casos individuais.
   fslmaths [nome da imagem média] – thr [valor thr, por exemplo, 5000] [imagem média thresholded]
7. Por fim, remodelar a imagem cerebral média na coordenada de um indivíduo usando o comando Flirt novamente. Em seguida, prepare corticais extraídos bastante limpos (Figura 2a).
   Nota: Infelizmente, o bulbo e o cerebelo olfactory não serão perfeitos na superfície reconstruída do cérebro dos volumes de MRI por causa das limitações essenciais do software de FSL ao Peal todas as partes do cérebro que incluem o bulbo olfactory e o cerebelo.

9. processamento da imagem de MRI às superfícies corticais da listra

1. Baixe outro software livre, slicer 3D (https://download.slicer.org/).
2. Abra as imagens de MR dos cérebros extraídos (clique em arquivo e selecione Adicionar dados) produzidos de acordo com a seção 8, usando o volume de renderização e módulos editor em 3D slicer.
3. Mude o modo do Editor para a renderização de volumee clique em um botão de destino para fazer a imagem do cérebro chegar ao centro da tela.
4. Selecione o modo Mr-T2-Brain e ajuste o limiar movendo a barra de deslocamento . Em seguida, mova para trás da renderização de volume para o Editor e clique no botão efeito de limite .
5. Aplique o Label 41. Córtex cerebral e salvar os dados de superfície do cérebro como um arquivo . STL . Em seguida, altere o formato de ficheiro de . VTK para . STLe guarde o ficheiro, verificando o formulário.

10. pré-processamento para dados de digitalização 3D

1. Realize uma coregistração automática entre 8 ou 16 imagens tiradas de 8 ou 16 ângulos diferentes dentro de uma sequência de uma varredura para corrigir pequenos desencontros entre eles, clicando em registro global incluído na opção alinhamento e integrá-los. Repita as varreduras de diferentes ângulos para obter a superfície do cérebro inteiro (Figura 2b).
   1. Se a integração entre imagens digitalizadas de diferentes ângulos não foi bem-sucedida, clique em alinhamento manual e selecione um par de uma imagem fixa e uma imagem em movimento.
   2. Clique em Iniciar para iniciar o alinhamento manual das imagens selecionando três ou quatro pontos comuns em imagens diferentes. Em seguida, clique em OK. O algoritmo de otimização é o algoritmo de ponto mais próximo iterativo (ICP)¹⁰. Não inclui uma deformação não linear.
2. Faça uma malha de todas as imagens alinhadas (ou seja, dos conjuntos de dados de pontos) selecionando todas as imagens e clicando no botão de geração de malha . Em seguida, selecione a opção pequeno objeto artístico para obter a malha como a resolução mais alta. Em seguida, guarde a imagem como. STL binário ou no formato ASCII.

11. coregistração da superfície de ressonância magnética e da superfície de digitalização 3D

1. Abra a superfície de ressonância magnética e combine-a com a superfície de digitalização 3D usando o software de processamento de superfície. Em seguida, execute um processo de alinhamento manual usando o mesmo procedimento descrito nas etapas 10.1.1 e 10.1.2. Em seguida, guarde estas imagens de superfície coregistered novamente (Figura 2a, b).
   1. Se necessário, limpe os dados de superfície individuais, por exemplo, apagando pequenos ruídos em torno da região do cérebro, especialmente no caso dos dados de RM, e preenchendo buracos se existirem, especialmente no caso dos dados de digitalização 3D.
2. Por fim, abra os dados de superfície com um software de análise de dados, por exemplo, MATLAB, e realize e avalie os histogramas das distâncias mínimas entre as duas superfícies.

Resultados

Foram avaliadas as distâncias entre as superfícies corticais, produzidas pela remoção do volume de RM e superfícies obtidas a partir de varreduras 3D de cérebros extraídos. Os valores de modo do histograma das distâncias são apenas 55 μm (Figura 3a). Adicionalmente, ao acumular o histograma a partir do ponto em que a distância é igual a zero, o valor acumulado atinge 90% do total de números de amostra em ~ 300 μm (Figura 3B<...

Discussão

Nós desenvolvemos um protocolo novo chamado o protocolo 3D-NEO para colmatar escalas espaciais macroscópicas e microscópicas sobrepondo duas superfícies do cérebro mais exatamente do que antes. Originalmente, havia dois desafios em criar este protocolo que fêz possível a sobreposição exata de duas imagens de superfície do cérebro e de gravar atividades neuronal saudáveis dos organismos vivos. Primeiramente, era necessário limpar eficazmente a solução do corte que circunda o cérebro extraído após a extra...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Air compressor	Kimura Medical	KA-100	Animal preparation for MRI
All-in-one fluorescence microscope	KEYENCE	BZ-X710
Anesthesia box	Bio Research Center	RIC-01	Animal preparation for MRI
Anesthesia system	ACOMA Medical Industry	NS-5000A	Animal preparation for MRI
Anti-GAD67, clone 1G10.2	Merk Millipore	MAB5406	For immunostaining
Calcium Chrolide	nacalai tesque	06729-55	aCSF
Choline Chloride	nacalai tesque	08809-45	aCSF
Curved blunt forceps
Disposal scalpel	Kai	10
D-PBS(-) without Ca and Mg, liquid (10x)	nacalai tesque		For immunostaining
D(+)-Glucose	Wako	049-31165	aCSF
Gelatin	nacalai tesque	16605-42	re-secctioning
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488	Invitrogen	A32723	For immunostaining
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555	Invitrogen	A32732	For immunostaining
Heater mat	Bio Research Center	HM-10	Animal preparation for MRI
Heater mat controller	Bio Research Center	BWT-100A	Animal preparation for MRI
Heater system	SA Instruments	MR-compatible Small Animal Heating System	Animal preparation for MRI
Isoflurane	AbbVie		Animal preparation for MRI
Isoflurane vaporizer	ACOMA Medical Industry	MKIIIai	Animal preparation for MRI
Linear Slicer	DOSAKA	Neo Linear Slicer MT
L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt	Wako	196-01252	aCSF
Magnesium Chrolide Hexahydrate	Wako	135-00165	aCSF
MaxOne Single-Well MEA	MaxWell Biosystems
Metal Spatula
Monitoring system	SA Instruments	Model 1025	Animal preparation for MRI
Monitoring software	SA Instruments	PC-SAM V.5.12	Animal preparation for MRI
MRI compatible cradle	Bruker BioSpin	T12812	Animal preparation for MRI
MRI coil	Bruker BioSpin	T9988	For MRI
MRI operation software	Bruker BioSpin	ParaVision 5.1	For MRI
Neo LinearSlicer MT	D.S.K.	NLS-MT
NeuN (D4G40) XP Rabbit mAb	Cell Signaling	24307	For immunostaining
Normal Goat Serum	Wako	143-06561	For immunostaining
Potassium Chloride	Wako	163-03545	aCSF
Polyethylene Glycol Mono-p-isooctylphenyl Ether	nacalai tesque	12967-45	For immunostaining
Pressure-sensitive respiration sensor	SA Instruments	RS-301	Animal preparation for MRI
Preclinical MRI scanner	Bruker BioSpin	BioSpec 70/20 USR	For MRI
Pyruvic Acid Sodium Salt	nacalai tesque	29806-54	aCSF
SCAN in a BOX	Open Technologies srl
Scissors
Sieve bottle	TIGERCROWN	81	For 3D scan
SlowFade Gold Antifade Mountant	Invitrogen	S36937	For immunostaining
Sodium Chloride	Wako	191-01665	aCSF
Sodium Dihydrogenphosphate	Wako	197-09705	aCSF
Sodium Hydrogen Carbonate	Wako	191-01305	aCSF
Sodium Hydrogensulfite	nacalai tesque	31220-15	For immunostaining
Thermistor temperature probe	SA Instruments	RTP-101-B, PLTPC-300	Animal preparation for MRI
Tooth bar	Bruker BioSpin	T10146	Animal preparation for MRI
Winged intravenous needle	TERUMO	SV-23CLK	For perfusion
1 mol/l-Tris-HCl Buffer Solution	nacalai tesque	35436-01	For immunostaining
1 mol/l-Hydrochloric Acid	nacalai tesque	37314-15	For pH adjustment of solution
16%-Paraformaldehyde Aqueous Solution	Electron Microscopy Sciences	15710	For immunostaining