JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu makalede, iki uzamsal ölçekler köprüleme 3D tarama teknolojisi kullanarak deneysel bir protokol tanıttı: MRG tarafından > 100 μm olarak görüntülenmiş tüm beyin anatomisinin makroskopik uzamsal ölçeği ve nöronal dağılımları kullanarak mikroskobik uzamsal ölçek immunohistokimya boyama ve multielektrot dizi sistemi ve diğer Yöntemler (~ 10 μm).

Özet

İnsan beyni, çok ölçekli sistemi olan, hem makroskopik elektrik sinyalleri, küresel kalın beyaz madde elyaf demetleri boyunca akan, ve mikroskopik nöronal sivri, akons ve dendrites boyunca yayılıyor. Her iki ölçek insan bilişsel ve davranışsal fonksiyonların farklı yönlerini tamamlar. Makroskopik düzeyde MRG, en küçük uzamsal çözünürlüğün, Voksel boyutunun 0,1 – 1 mm3olduğu mevcut standart görüntüleme teknolojisi olmuştur. Ayrıca, mikroskobik düzeyde, önceki fizyolojik çalışmalar bu tür voxels içinde eşit olmayan nöronal mimariler farkındayız. Bu çalışmada, 3D tarama teknolojisindeki teknolojik gelişmeler ile biyolojik bilimsel araştırmalarla arabirim yaparak mikroskobik verileri makroskopik bir haritaya doğru bir şekilde katıştırmak için güçlü bir yol gelişir. 3D tarama teknolojisi çoğunlukla mühendislik ve endüstriyel tasarım için şimdiye kadar kullanılmış olduğundan, ilk kez canlı beyin hücrelerinde doğal spiking korurken tüm beyin içine microconnectomes katıştırmak için repurposed. Bu amaca ulaşmak için, ilk olarak, nemli ve yansıtıcı yüzeyler nedeniyle görüntü için doğal olarak zorlu yaşam biyo-organizmaların doğru 3D görüntüleri elde etmek için bir tarama protokolü inşa ettik. İkinci olarak, biz daha iyi koşullar koruyarak ve beyin dokusunda aktif nöronların daha doğal nöronal sivri kayıt önemli bir faktördür yaşam beyin dokusu, bozulması önlemek için hız tutmak için eğitildi. İki kortikal yüzey görüntüleri, bağımsız olarak iki farklı görüntüleme modülleri, yani MRI ve 3D tarayıcı yüzey görüntüleri, şaşırtıcı bir mesafe hatası gösteren sadece 50 μm histogram modu değeri olarak ayıklanır. Bu doğruluk, hücre içi mesafelerin mikroskobik çözünürlüğüne Ölçekle karşılaştırılabilir; Ayrıca, farklı bireysel fareler arasında kararlı. Bu yeni protokol, çakışan (3D-NEO) protokol katıştırma 3D roman, bu entegratif protokol tarafından türetilen makroskopik ve mikroskobik seviyeleri köprüler ve kapsamlı bağlantı mimarileri (i.e., çalışma için yeni bilimsel bulgular hızlandırır microconnectome).

Giriş

Çeşitli fiziksel ve biyolojik kuruluşlarda bulunan çok ölçekli mimarileri genellikle1,2' de bulunur. Beyin aynı zamanda çok eşit olmayan ve çok ölçekli ağ organizasyon3,4. Çeşitli bilişsel fonksiyonlar, bu tür ağ kuruluşlarında kodlanmış, submillisecond temporal çözünürlüklerde nöronal nüfus elektrik başak desenleri temporal değişiklikler tutarak. Tarihsel olarak, nöronlar arasında karmaşık ağlar yapısal ayrıntılı olarak Santiago Ramón y Cajal tarafından 150 yıl önce5' ten itibaren boyama teknikleri kullanılarak gözlenmiştir. Aktif nöronların grup davranışlarını gözlemlemek için, araştırmacılar çeşitli kayıt teknolojileri geliştirdik6,7,8, ve bu tür teknolojilerin son önemli gelişmeler bize kayıt sağladı aynı anda çok sayıda nöronların elektrik faaliyetleri. Ayrıca, bu tür işlevsel etkinliklerden, bilim adamları, nöronların çok sayıda arasındaki nedensel etkileşimlerin ağları yeniden inşa etmeye başardı ve karmaşık etkileşimleri ' microconnectome ' 9 topolojik mimarisi ilan ettiler . Birçok beyin bölgeleri birden fazla Fiber-demetleri ile bağlı çünkü beynin makroskopik gözlemler de bir ağ organizasyonu olarak bir bütün beyin ile ilgili izin verir. Microconnectomes küresel beyin haritası içine gömme hala mevcut teknolojik gelişmeler içinde açık sınırlamalar vardır, bu yüzden bu gömme protokol çok önemlidir. Ancak, gömme protokolünün geliştirilmesi için birçok zorluk vardır. Örneğin, tamamen yalıtılmış beyin bölgelerinde yerel nöronal devrelerin yaşam etkinliklerini gözlemlemek için, beyin dilimleri in vitro kayıtlar için üretilmesi gerekir. Ayrıca, in vitro kayıtlar için Beyin dilimleri kayıtları hala en az iki nedenden dolayı önemli bir seçimdir. İlk olarak, beyin bölgelerinden ~ 1,5 mm 'den daha derin ve yüksek temporal çözünürlükte (< 1 MS) aynı anda birçok yaşam bireysel nöronların faaliyetlerini gözlemlemek kolay değildir. İkinci olarak, yerel bir nöronal devrenin iç mimarisini bilmeyi umduğunuzda, dış beyin bölgelerinden gelen tüm girişleri, karıştıran faktörleri ortadan kaldırmak için durdurmak gerekir. Yol tarifi ve üretilen Beyin dilimleri konumlarını belirlemek için, bu koordinatları kullanarak bu üretilen Beyin dilimleri uzamsal pozisyonları entegre etmek daha gerekli olacaktır. Ancak, organize bir şekilde beyin dilimleri yapmak için birkaç sistematik ve güvenilir yolları vardır10,11. Burada, Integrative protokol sağlamak için nörobilimsel araştırma için 3D tarama teknolojisini kullanarak yeni bir coregistration Protokolü tanıtıldı. Bu protokol, mikro ve makroölçekleri koordine etmek ve multielektrot dizisi (MEA) mikro veriler12,13 ve boyama verilerini, ayıklanan beynin 3D tarama yüzeyleriyle makroskopik MRG alanına yerleştirecek şekilde davranır, ayrıca noninvazif beyin kaydedildi. Şaşırtıcı bir şekilde, Bu histogram mod değeri olarak sadece ~ 50 μm bir mesafe hatası gösterdi. Sonuç olarak, MRI yüzeyi ile taranan 3B yüzey arasındaki iki yüzey arasındaki minimum mesafelerin mod değerleri, bireyler arasında ortak denetim yaparken uygun bir sayı olan altı fareler için yaklaşık 50 μm idi. Tipik dilim genişliği 300 μm civarında kaydedilmiş bir başak aktivitesine sahipti.

Protokol

Burada açıklanan tüm deneysel prosedürler Kyoto Üniversitesi hayvan bakımı Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. hayvanlar (gün 1)

  1. Kadın C57BL/6J fareler hazırlayın (n = 6, yaşlı 3 − 5 hafta).
    Not: Bu protokol tüm kemirgen türler için geçerlidir.

2. MRI ayarları (gün 1)

  1. Bir ısıtıcı mat kontrol cihazı kullanarak 37 °C ' ye ayarlanmış bir kalorifer paspas üzerine yerleştirilen bir akrilik anestezi kutusuna fareyi koyun.
  2. Bir Isoflurane buharlaştırıcı, hava debimetre ve hava kompresörü oluşan bir anestezi sistemi kullanarak 1,4 L/min bir akış hızında kutu akan hava 2% izofluran ile fare anesteziye.
  3. Anestezinin indüksiyonunun ardından, fareyi uygun pozisyonda MRI uyumlu bir beşik içine yerleştirin. Eğer ağrı hissetmiyorum görmek için cımbız ile fare bir ayak kırparak anestezi yeterli olup olmadığını kontrol edin.
  4. Diş çubuğu ve beşik ile donatılmış yüz maskesi ile farenin kafasını düzeltin. Daha sonra, yüz maskesi üzerinden 1,4 L/dak 'da havada% 1 −% 1,5 ısofluran ile anestezi sürdürün.
  5. Farenizin rektumuna bir termistör sıcaklık sondası takın ve farenin arkasına basınca duyarlı solunum sensörü yerleştirin.
  6. Beşiği bir MRI mıknatısının deliğine aktarın. İstikrarlı ve yeniden üretilebilen bir anestezi derinliğini sağlamak için Isoflurane konsantrasyonu% 1 −% 1,5 civarında ayarlayın. 33 − 35 °C arasında vücut sıcaklığının kontrol edilmesi ve MRG deneylerinin tüm döneminde 0.5 − 1.3 Hz arasında solunum hızı denetlenirken, küçük hayvanların fizyolojik parametreleri için bir izleme sistemi (malzeme tablosu) kullanılarak monitör özel yazılım (malzeme tablosu).
  7. Rektal sıcaklığın ölçülen değerini kullanarak, izleme sisteminde donatılmış bir ısıtıcı sisteminden mıknatıs delik sağlanan sıcak hava sıcaklığını kontrol ederek vücut sıcaklığını düzenler.

3. MRG satın alımları (gün 1)

  1. Yüksek çözünürlüklü 3D T2 ağırlıklı MRI taraması için preparatlar
    1. Fare konumunu kontrol etmek için üç ortogonal (Aksiyel, koronal ve sagittal) düzlemlerinde üç manyetik rezonans (MR) görüntü kazanın.
    2. Bu görüntülere atıfta bulunmak için, farenin pozisyonunu, fare beynin merkezinin rezonatör merkezinde ve eksenel yönde gradyan bobinlerinin merkezinde konumlandırılabilmesi için beşiği taşıyarak ayarlayın.
    3. Rezonatörü ayarlayarak, statik manyetik alan homojenliğini (ışıllama) ve temel frekansı ayarlama ve radyo frekansı (RF) gücünü kalibre ederek MRI sistemini ayarlayın.
    4. Koronal ve sagittal oryantasyonlarla düşük çözünürlüklü 2D çok kesitli T2 ağırlıklı (T2W) görüntüleri edinin. Bu resimlere dayanarak, yüksek çözünürlüklü 3D T2W MRG taraması için görüş alanını (FOV) belirleyin.
    5. FASTMAP otomatik dolgu algoritmasını kullanarak yerelleştirilmiş parıldanmayı gerçekleştirin. FASTMAP protokolü için tüm beyni kaplayan dikdörtgen bir bölge seçin. Lokalize ışıltu tamamlandıktan sonra, beyin bölgesinde B0 alanı inhomojenliğini, nokta çözümlenmiş spektroskopisi (Press) kullanarak lokalize 1H spektrumlu olarak onaylayın.
    6. Yüksek çözünürlüklü 3D T2W MRI için tarama ayarlarının, FOV 'nin uygun konumunu, sarmalayıcıları (yumuşatma) yapılarını ve yağ sinyallerinin verimli bastırılmasını kontrol ederek uygun olduğundan emin olmak için düşük çözünürlüklü 3D T2W görüntüler edinin.
  2. Görüntüleme Pulse dizisi
    1. Preparatlar yukarıda açıklanan sonra, gevşeme geliştirme (nadır) dizisi ile hızlı bir edinme kullanarak, fare tüm beynin yüksek çözünürlüklü 3D T2W görüntüleri elde.
      Not: Bu yazıda, 7 T, 210 mm yatay delik, preklinik tarayıcı, rampa süresi 100 μs 'de 440 mT/m gradyan sistemi ile donatılmış MRG denemeleri yapılmıştır. RF uyarma ve sinyal alımı için 35 mm iç çapı olan bir Quadrature hacim rezonatör kullanılmıştır. MRG verileri adanmış bir operasyon yazılımı ile elde edildi. Bu çalışmada kullanılan 3B nadır Pulse dizisinin edinme parametreleri Tablo 1' de özetlenmiştir.

4. deneysel çözümlerin hazırlanması (2. gün)

  1. Hazırlamak 500 mL bir buz-soğuk kesme çözeltisi (2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2Po4, 7 mm MgCl2, 15 mm glikoz, 25 mM NaHCO3, 0,5 mm CAcl2, 11,6 mm sodyum ascorbate, 3,1 mm sodyum pyruvate, ve 100 mm Kolin klorür, bubbled 95% O2 ve 5% Co2) ile. PH 'ı 7.3 − 7.4 olarak ayarlayın.
  2. Hazırlamak 1 L Yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF; 127 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2Po4, 1 mm MgCl2, 15 mm glikoz, 25 mm NaHCO3, ve 2 mM CAcl2, BUBBLED ile 95% O2 ve 5% Co2). PH 'ı 7.3 – 7.4 olarak ayarlayın.

5. ekipman hazırlanması (gün 2)

  1. Hazırlamak bir 6,6 cm2 kare, 0,5 cm kalınlığında mıknatıs "Yüzük" ve, ilk, yer siyah bant ve, ikinci, halka üzerinde cerrahi bant (Şekil 1C-2). Bu malzemenin bir beyin bloğu tabanı (BBB) olarak adlandırılır ve buz blokları üzerinde soğuk tutmak unutmayın.
    Not: Daha sonra, bantlar vibratome için beyin blokları ile dilimleme istasyonuna iliştirilir. Kare yüzük iki amacı karşılamak için BBB alt tabanı olarak kullanılır, yani bir vibratome 3D tarama istasyonundan sorunsuz beyin blokları geçirmek ve tarama adımında beyin bloklarının yüksekliklerini doğru ölçmek için.
  2. Otomatik bir turntable ile BBB ayarlayın. Tarayıcıyı ve turntable özelliğini açın. Görüntü işleme yazılımını başlatın.
  3. Tüm deneylerin öncesinde, kameralar ve yapılandırılmış ışık projeksiyon ve Masaüstü tipi 3D tarayıcı bağlı pikap kalibrasyonları gerçekleştirin.
    1. Merkez projektörü, iki kamerayı ve turntable 'ı açın. Sonra yazılımı açın. Yazılım, optik kurulum tıklayın ve 100 x 80 ve kılavuz numaraları olarak 100 x 100 olarak görüntü alanını seçin. Ardından, kamera kalibrasyonu aşağıdaki dört adımlara göre başlar.
      1. Projektör kurulumu için, kalibrasyon sayfasını masanın üzerine yerleştirin ve ölçüm alanının sabitleme noktasını levha ortasına ve ön yöne yönlendirmeyi ayarlamak için kalibrasyon kartını kalibrasyon sayfasına koyun. Projektör ile pano arasındaki mesafeyi 200 yaklaşık olarak ayarlayın. iki düğme sabitleme vidaları gevşetin ve ışık hassasiyeti ve iki kameranın odağı ayarlamak için düğmeleri döndürün. Ardından, sonraki adıma gitmek için ok düğmesini tıklatın.
      2. Kameralar yönlendirmek için, iki kamera kendilerini sabitleme vidaları gevşetin ve pozisyon ve rotasyonlar Kalibrasyon Panosu, dikey çizgi ve projektörden yansıtılan sarı haç üzerinde merkez hattı ile örtüşme hareket. Kameraları düzeltin ve ok tuşuna tekrar tıklayın. Sonra, ekran karanlık olacak.
      3. Kameralara odaklanmak için, düğme sabitleme vidalarını gevşettikten sonra, ışık hassasiyetini artırın ve odağı tekrar ayarlayın. Ardından, sonraki adıma gitmek için ok düğmesini tıklatın.
      4. F değeri ve pozlama derecesi (kameranın) için, ışık hassasiyetini tekrar kırmızı bölgenin kaybolduğu yerin hemen altına ayarlayın. Daha sonra ok yeniden tıklatın ve kalibrasyon başlangıç' ı tıklatın ve isterseniz Evet Eğer optik ayarı bitirmek sordu?
    2. Kalibrasyonu Başlat'ı tıklatın ve piksel değerlerinin 0 – 255 arasında normalleştirilmiş olup olmadığını denetleyin. Sonra devam' ı tıklatın.
    3. Önerilen pozisyonlar takip ederek, tarayıcı ve kalibrasyon kartı dokuz farklı göreli açıları görüntüleri kaydetmek ve kalibrasyon sürecini onayladıktan sonra bitirmek, ve, son olarak, kalibrasyon güncellemetıklayın.
    4. Turntable için kalibrasyon panosuyla takas yapın ve turntable kalibrasyonunutıklayın.
      Not: Şimdi, tüm Kalibrasyonlar bitti.

6. beyin yüzey tarama, Dilimleme ve MEA kayıt (gün 2)

  1. Bir fareyi% 1 −% 1.5 Isoflurane ile anestezize edip fareyi salla. Cildi açmak ve kafatasını açığa çıkarmak için bir neşter kullanın.
  2. Bir cerrahi bıçak kullanarak sagittal sütür boyunca anestezik fare kafa derisi kes, ve ameliyat makas kullanarak kemiğinin önünde biraz bir noktaya lambda noktasından diyagonal yönde kafatası kesti. Sonra, yavaşça kafatasını eğri Cımbız kullanarak beyninden ayırın.
  3. Beyin kaldırmak için bir spatula kullanın ve bir petri çanak (100 mm x 20 mm) ile buz-soğuk kesme çözeltisi (adım 4,1 hazırlanmış) aktarmak. Buz-soğuk kesme çözeltisi (Şekil 1a) küçük kabarcıklar oluşturmak için pompa (~ 4,0 rpm) kontrollü bir dönüş hızı ile harici bir gaz bombadan 95% O2 ve 5% Co2 içeren akış hava.
  4. 1-2 dk sonra, yüzeyi biraz un elek ile kaplı bir mikrofiber bez üzerine beyin koymak ve beyin yüzeyinden sıvı silin, hafifçe mikrofiber bez kullanarak (Şekil 1B).
  5. BBB üzerinde örnek stand yukarı onun dorsal yönü ile beyin koymak, ve aynı zamanda otomatik turntable merkezinde BBB koydu.
  6. 3B tarama sırasında odayı karartın ve turntable 'da 3B tarama gerçekleştirin. 3B taramanın iyi çalışıp çalışmadığını sınamak için, 22,5 olarak iki çekim, başlangıç açısı 0 ve 360 olarak son açı (Şekil 1C-1) arasındaki açı seçerek 3B Tarama 'yı tıklatın.
  7. Beyin bir petri tabak taşıyın ve yaklaşık 10 s için kesme çözeltisi içinde kabarcık beyin.
  8. Bir cerrahi bıçak kullanarak koronal uçağın ortasında iki blok içine beyin kes ve cerrahi spatula kullanarak düz yüzeye hafifçe iki beyin blokları hareket ettirin.
  9. Anında tutkal kullanarak BBB beyin blokları takın, ve yumuşak ve dikkatlice beyin yüzeyinde sıvı silin 1 – 2 dakika, tekrar bir mikrofiber bez kullanarak. Ardından, bir 3B taraması yeniden gerçekleştirin (Şekil 1C-2).
  10. BBB 'nin merkezini kaplayan siyah bandı, vibratom için kesme aşamasının merkezine takın (Şekil 1D).
  11. Kesme aşamasına kesme çözeltisi dökün ve vibratom üzerinde kesme aşamasını ayarlayın. Kesme hızını ve genliği ayarlayın. İki beyin bloklarından 2 – 5 koronal dilim (300 μm kalınlığında) yapın. Çözelti mümkünse köpüren kesme aşamasında tutun (Şekil 1e).
  12. Vibratomun bıçak tutucusuna bir bıçak takın ve frekans için 12,7 mm/dak, frekansı 87 – 88 Hz ve salıncak genişliği için 0,8 – 1,0 mm olarak ayarlayarak sistemin kesme hızını, frekansını ve titreşim genliğini optimize edin. Dikkatli kesme gerekli olduğunda, seviye 2 – 3 hızını yavaşlatın.
  13. Beyin dilimlerini keserken, anterior-posterior koordinat, Yarımküre ve diğer koşullar (Şekil 2C) dahil olmak üzere dilimlenmiş koordinatlarını kaydedin.
  14. Beyin dilimlerini, kalın bir plastik pipet kullanarak prewarmed (~ 34 °C) ACSF ile dolu bir be34 yene yavaşça aktarın Bu süre zarfında, kesme aşamasında kalan beyin bloklarının 3B taramasını gerçekleştirin (Şekil 1C-2).
  15. Kayıt birimine bir MEA yongası ayarlayın. Yongayı iki tüp kullanarak peristaltik bir pompaya bağlayın. Mea yongası içine aynı ACSF rehberlik ve MEA çip ACSF rehberlik diğer tüp bir tüp kullanın.
  16. 2 iğne (0,60 mm x 19 mm) takın, iki tüpün uçlarında, MEA çipin duvarının üstüne bağlanır ve MEA çipin iç duvarını izleyen ipuçlarıyla konumlarını düzeltin. ACSF akış hızını 4,1 RPM 'ye ayarlayın.
  17. 1 saat geçtikten sonra, kalın bir plastik pipet kullanarak çipte bir dilim taşıyın ve yumuşak bir fırça kullanarak konumu ayarlayın. Daha sonra, nöronal faaliyetlerin kayıt sürecini başlatın (Şekil 2-d).

7. immünhistokimya boyama (gün 3 ve 4)

  1. MEA kaydı bittikten sonra, dilimlerini, fosfat-tamponlu tuzlu (PBS) içinde% 4 paraformaldehit (PFA) ile dolu 1,5 mL tüplere aktarın. Onları gece 4 °C ' de kulyın. Ardından,% 4 PFA çözümünü çıkarın ve toplam 5 dakika boyunca PBS ile 3 dilimlerini yıkayın.
    Not: Gerekirse,% 20 jelatin/PBS dilimleri katıştırın ve vibratome kullanarak, 50 μm ' den daha ince yapmak için dilim rezeksiyon.
  2. Antijen alma çözümünü hazırlayın (10 mM sodyum sitrat, pH 6,0). PBS son yıkama çıkarın ve antijen alma çözümü ekleyin.
  3. Elektrikli termos tencerede su kaynatın ve tencerede ~ 95 – 98 °C ' de 20 dakika boyunca dilimleri ile tüplerin kulyası, ardından doğal soğutma.
  4. Hazırlamak 50 mm Tris-tamponlu tuzlu ve eklemek 1% na bisülfit (1% na bisülfit-Tris solüsyonu). PH 7,5 için ayarlayın. Ardından, dilimleri oda sıcaklığında 5 dakika (~ 20 – 25 °C) için% 1 na Bisulfite-Tris çözeltisi ile yıkayın.
  5. % 1 na Bisulfite-Tris çözeltisine% 4 normal keçi serumu ve 0,5% octylphenol etoksilat ekleyerek engelleme çözümünü hazırlayın.
  6. 1% na Bisulfite-Tris solüsyonu dilimlerle tüplerden çıkarın ve engelleme çözümünü ekleyin. Oda sıcaklığında 2 saat boyunca inküye yapın.
  7. Primer antikor çözümünü% 1 normal keçi serumu ve% 0,5 Triton X-100 ' e% 1 na Bisulfite-Tris solüsyonu ve seyreltilen primer antikorlar ekleyerek hazırlayın. Birincil antikorlar aşağıdaki konsantrasyonları kullanın: 1:800 fare Anti-GAD67 ve 1:500 tavşan Anti-NeuN.
  8. 1% na Bisulfite-Tris çözeltisi dilimlerle tüplerden çıkarın ve primer antikor çözeltisi ekleyin. 4 °C ' de bir gecede inküye yapın.
  9. Prepare 50 mM Tris-tamponlu tuz ve 8,5 g/L NaCl (Tris-NaCl solüsyonu) ekleyin. 7,5 için pH titrat. Sonra, toplam 5 dakika boyunca Tris-NaCl solüsyonu (~ 20 – 25 °C) ile 3x dilimleri yıkayın.
  10. Tris-NaCl çözeltisine% 3 normal keçi serumu ve 0,3% Triton X-100 ekleyerek ikinci antikor çözümünü hazırlayın ve ikincil antikorları seyreltin. İkincil antikorlar aşağıdaki konsantrasyonları kullanın: 1:500 keçi Anti-fare ve 1:500 keçi Anti-tavşan.
  11. Tris-NaCl çözeltisi dilimleri ile tüplerden çıkarın ve ikincil antikor çözeltisi ekleyin. Oda sıcaklığında 2 saat boyunca inküye yapın. Sonra, toplam 5 dakika için Tris-NaCl solüsyonu ile 3x dilimleri yıkayın.
  12. Dilimleri küçük bir fırça kullanarak slaytta yerleştirin ve montaj ortamını ve bir coverslip uygulayın. Slaytlar bir Konfokal mikroskop ile inceleyin. Bir dilim yüzeyinin görüntülerini alın (Şekil 2e).

8. Corical hacimleri ayıklamak için MRG veri Işleme

  1. Ücretsiz yazılım FSL (https://FSL.fmrib.ox.AC.uk/FSL/fslwiki/FslInstallation) yükleyin. Bölüm 3 ' te alınan MRG görüntülerini hazırlayın.
  2. Fslchfiletype NIFTI_PAIR_GZ komutunu kullanarak görüntü biçimini değiştirin. Fslcreatehd komutunu kullanarak bir insan beyni kadar büyük hale getirmek için beyin görüntüsünü genişletin ve gerekirse, fslorient seçeneğini kullanarak yönünü değiştirmek -setqformcode 1. Bundan sonra, fslchfiletype NIFTI_GZkullanarak özgün dosya biçimini kurtarın. Tam komut aşağıdaki gibidir.
    fslchfiletype NFTI_PAIR [giriş görüntü]. Nii. gz
    fslcreatehd 144 196 160 1 0,95 0,6 1,15 0 0 0 0 4 [giriş görüntüsü]. HDR. gz
    fslorient – setqformmcode 1 [giriş görüntüsü]. HDR. gz
    fslchfiletype NIFTI_GZ [giriş görüntü]
  3. FSL yazılımını açmak için FSL yazın. Grafik Kullanıcı arayüzü (GUI) Bet komutunu kullanarak beyin ayıklamak, ama çok fazla soyma yok. Sonra, kesirli yoğunluk eşikleri kontrol... ve dikkatle ilk beyin yüzeyi küre merkezinin koordinatları . En iyi değerler, bireysel veriler için farklıdır.
  4. Adım 8,2 olarak aynı prosedürü kullanarak, orijinal fare beyin boyutuna beyin görüntüsünü yeniden boyutlandırın. Tam komutu aşağıdaki gibidir:
    fslchfiletype NFTI_PAIR [giriş görüntü]. Nii. gz
    fslcreatehd 144 196 180 1 0,1 0,1 0,08 0 0 0 0 4 [giriş görüntüsü]. HDR. gz
    fslorient – setqformmcode 1 [giriş görüntüsü]. HDR. gz
    fslchfiletype NIFTI_GZ [giriş görüntü]
  5. Flört komutunu kullanarak tüm beyin görüntülerini coregistrate ve fslmatematiksel komutunun- Add seçeneği ve -div seçeneği kullanarak ortalama bir beyin görüntü üretmek.
    fslmatematik [beyin görüntü 1]-eklemek... – [beyin görüntü N] ekleyin – div N [Ortalama görüntü adı] – ODT float
  6. Fslmatematik komutunun -THR seçeneğini kullanarak ortalama beyin Temizleyici olun. Ardından, bireysel durumlarda adaptif en uygun eşik değeri seçin.
    fslmatematik [Ortalama görüntü adı] – THR [THR değeri, örneğin, 5000] [eşik ortalama görüntü]
  7. Son olarak, tekrar Flirt komutunu kullanarak bir bireyin koordinatını ortalama beyin görüntüsünü yeniden şekillendirin. Sonra, oldukça temiz çıkarılan korexler hazırlayın (Şekil 2a).
    Not: ne yazık ki, koku ampul ve serebellum FSL yazılımının temel sınırlamaları nedeniyle koku ampul ve serebellum dahil olmak üzere tüm beyin parçaları Peal MRG hacimlerini yeniden inşa beyin yüzeyinde mükemmel olmayacaktır.

9. şerit kortikal yüzeylere MRG görüntü Işleme

  1. Download başka özgür bilgisayar yazılımı, 3D dilimleyici (https://download.Slicer.org/).
  2. Ayıklanan beynin MR görüntülerini açın ( Dosya tıklayın ve veri Ekleseçin) Bölüm 8 göre üretilen, 3D dilimleyici ses işleme ve düzenleyici modülleri kullanarak.
  3. Modu Düzenleyici 'den birim işlemeolarak değiştirin ve beynin görüntüsünü ekranın ortasına getirmek için bir hedef düğmesini tıklatın.
  4. Bay-T2-Brain modunu seçin ve Shift çubuğunu taşıyarak eşik ayarını yapın. Daha sonra birim işleme 'den düzenleyiciye geri taşıyın ve eşik efekti düğmesini tıklatın.
  5. Etiket 41 uygulayın . Serebral korteks ve beyin yüzeyi verileri bir . stl dosyası olarak kaydedin. Ardından, dosya biçimini. VTK öğesinden . stlolarak değiştirin ve formu denetleyerek dosyayı kaydedin.

10.3B Tarama verileri için ön işlem

  1. Hizalama seçeneğine dahil edilen Global kayıt 'ı tıklatarak aralarında küçük uyuşmazların düzeltilmesi için bir tarama dizisi içinde 8 veya 16 farklı açılardan alınan 8 veya 16 görüntü arasında otomatik bir birleştirme gerçekleştirin ve bunları tümleştirin. Tüm beyin yüzeyini elde etmek için taramaları farklı açılardan tekrarlayın (Şekil 2B).
    1. Farklı açılardan taranan görüntüler arasında entegrasyon başarılı olmasaydı, manuel hizalama 'yı tıklatın ve Sabit görüntü ve hareketli görüntüçiftini seçin.
    2. Farklı görüntülerde üç veya dört ortak nokta seçerek görüntülerin el ile hizalamasını başlatmak için Başlat 'ı tıklatın. Sonra Tamam' ı tıklatın. En iyi duruma getirme algoritması yinelemeli en yakın noktası (ıCP) algoritması10' dir. Doğrusal olmayan bir deformasyon içermez.
  2. Tüm görüntüleri seçerek ve Mesh oluşturma düğmesine tıklayarak, tüm hizalanmış görüntülerin (örneğin, nokta veri kümeleri) bir kafes yapın. Ardından, en yüksek çözünürlük olarak Mesh almak için küçük sanatsal nesne seçeneğini seçin. Sonra görüntüyü. stl ikili veya ASCII biçiminde kaydedin.

11. MRI yüzeyinin ve 3B Tarama yüzeyinin coregistration

  1. MRG yüzeyini açın ve yüzey işleme yazılımını kullanarak 3B Tarama yüzeyi ile birleştirin. Daha sonra bir el ile hizalama işlemi, aynı yordamı, adımları, 10.1.1 ve 10.1.2 açıklandığı gibi kullanarak gerçekleştirin. Ardından, bu coregistered yüzey görüntülerini tekrar kaydedin (Şekil 2a, b).
    1. Gerekirse, örneğin, beyin bölgesini çevreleyen küçük sesleri silerek, özellikle MRG verisi durumunda ve özellikle 3D tarama verisi durumunda, herhangi bir durum varsa delikleri doldurarak, bireysel yüzey verilerini temizleyin.
  2. Son olarak, yüzey verilerini bir veri çözümleme yazılımıyla açın, örneğin MATLAB, iki yüzey arasındaki minimum mesafelerin histogramlarını gerçekleştirin ve değerlendir.

Sonuçlar

Biz kortikal yüzeyler arasındaki mesafeler değerlendirdi, MRI hacmi sıyırma tarafından üretilen, ve yüzeyler çıkarılan beynin 3D taramaları elde. Mesafelerin histogram mod değerleri sadece 55 μm (Şekil 3A). Ayrıca, histogram uzaklığı sıfır eşittir noktadan biriktirirken, birikmiş değeri% 90 toplam örnek sayıların ~ 300 μm (Şekil 3B) ulaşır. İki yüzey arasındaki mesafelerin son histogram 50 μm ci...

Tartışmalar

İki beyin yüzeyinden daha doğru bir şekilde örtüşerek makroskopik ve mikroskobik uzamsal ölçekleri köprüleyerek 3D-NEO protokolü olarak adlandırılan yeni bir protokol geliştirdik. Aslen, iki beyin yüzeyi görüntülerinin doğru şekilde örtüşmesini ve canlı organizmalardan sağlıklı nöronal faaliyetleri kaydetmesi mümkün kılan bu protokolü oluştururken iki zorluk vardı. İlk olarak, etkili bir şekilde beyin organizması (adım 6,2 protokol) yaralanmadan kafatası ayıkladıktan sonra çıka...

Açıklamalar

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Teşekkürler

M.S., Tıp Bilimleri Fakültesi ve Tıp fakültesinde tıbbi bilgi Mühendisliği dersinde bulunan tüm personelden destek için minnettar ve yardımcı oldukları için Prof. Tetsuya Takakuwa, Prof. Nobukatsu Sawamoto ve Doris Zakian 'a teşekkür etmek istiyor Yorum. Bu çalışmada, zorlu araştırmacı araştırmalar için Grant-ın-Aid ve MEXT (eğitim, kültür, spor, bilim ve Teknoloji Bakanlığı) ' dan M.S. mükemmel genç araştırmacılar (LEADER) programının önde gelen girişimi tarafından destekleniyordu. Bu çalışmanın MRG denemeleri küçük hayvan MRG, tıbbi araştırma Destek Merkezi, Tıp Enstitüsü, Kyoto Üniversitesi, Japonya için bölüm 'de gerçekleştirildi.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Air compressorKimura MedicalKA-100Animal preparation for MRI
All-in-one fluorescence microscopeKEYENCEBZ-X710
Anesthesia boxBio Research CenterRIC-01Animal preparation for MRI
Anesthesia systemACOMA Medical IndustryNS-5000AAnimal preparation for MRI
Anti-GAD67, clone 1G10.2Merk MilliporeMAB5406For immunostaining
Calcium Chrolidenacalai tesque06729-55aCSF
Choline Chloridenacalai tesque08809-45aCSF
Curved blunt forceps
Disposal scalpelKai10
D-PBS(-) without Ca and Mg, liquid (10x)nacalai tesqueFor immunostaining
D(+)-GlucoseWako049-31165aCSF
Gelatinnacalai tesque16605-42re-secctioning
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488InvitrogenA32723For immunostaining
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555InvitrogenA32732For immunostaining
Heater matBio Research CenterHM-10Animal preparation for MRI
Heater mat controllerBio Research CenterBWT-100AAnimal preparation for MRI
Heater systemSA InstrumentsMR-compatible Small Animal Heating SystemAnimal preparation for MRI
IsofluraneAbbVieAnimal preparation for MRI
Isoflurane vaporizerACOMA Medical IndustryMKIIIaiAnimal preparation for MRI
Linear SlicerDOSAKANeo Linear Slicer MT
L(+)-Ascorbic Acid Sodium SaltWako196-01252aCSF
Magnesium Chrolide HexahydrateWako135-00165aCSF
MaxOne Single-Well MEAMaxWell Biosystems
Metal Spatula
Monitoring systemSA InstrumentsModel 1025Animal preparation for MRI
Monitoring softwareSA InstrumentsPC-SAM V.5.12Animal preparation for MRI
MRI compatible cradleBruker BioSpinT12812Animal preparation for MRI
MRI coilBruker BioSpinT9988For MRI
MRI operation softwareBruker BioSpinParaVision 5.1For MRI
Neo LinearSlicer MTD.S.K.NLS-MT
NeuN (D4G40) XP Rabbit mAbCell Signaling24307For immunostaining
Normal Goat SerumWako143-06561For immunostaining
Potassium ChlorideWako163-03545aCSF
Polyethylene Glycol Mono-p-isooctylphenyl Ethernacalai tesque12967-45For immunostaining
Pressure-sensitive respiration sensorSA InstrumentsRS-301Animal preparation for MRI
Preclinical MRI scannerBruker BioSpinBioSpec 70/20 USRFor MRI
Pyruvic Acid Sodium Saltnacalai tesque29806-54aCSF
SCAN in a BOXOpen Technologies srl
Scissors
Sieve bottleTIGERCROWN81For 3D scan
SlowFade Gold Antifade MountantInvitrogenS36937For immunostaining
Sodium ChlorideWako191-01665aCSF
Sodium DihydrogenphosphateWako197-09705aCSF
Sodium Hydrogen CarbonateWako191-01305aCSF
Sodium Hydrogensulfitenacalai tesque31220-15For immunostaining
Thermistor temperature probeSA InstrumentsRTP-101-B, PLTPC-300Animal preparation for MRI
Tooth barBruker BioSpinT10146Animal preparation for MRI
Winged intravenous needleTERUMOSV-23CLKFor perfusion
1 mol/l-Tris-HCl Buffer Solutionnacalai tesque35436-01For immunostaining
1 mol/l-Hydrochloric Acidnacalai tesque37314-15For pH adjustment of solution
16%-Paraformaldehyde Aqueous SolutionElectron Microscopy Sciences15710For immunostaining

Referanslar

  1. Vogelsberger, M., et al. Properties of galaxies reproduced by a hydrodynamic simulation. Nature. 509 (7499), 177-182 (2014).
  2. Zhang, B., et al. Integrated systems approach identifies genetic nodes and networks in late-onset Alzheimer’s disease. Cell. 153 (3), 707-720 (2013).
  3. Sporns, O., Chialvo, D. R., Kaiser, M., Hilgetag, C. C. Organization, development and function of complex brain networks. Trends in Cognitive Sciences. 8 (9), 418-425 (2004).
  4. Shimono, M. Non-uniformity of cell density and networks in the monkey brain. Scientific Reports. 3, 2541 (2013).
  5. DeFelipe, J., Jones, E. G. . Cajal on the Cerebral Cortex: An Annotated Translation of the Complete Wrings. , (1988).
  6. Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M. . Principles of Neural Science. , (2013).
  7. Pine, J., Taketani, M., Baudry, M. A history of MEA development. Advances in Network Electrophysiology. , 3-23 (2006).
  8. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
  9. Shimono, M., Beggs, J. M. Functional clusters, hubs, and communities in the cortical microconnectome. Cerebral Cortex. 25 (10), 3743-3757 (2014).
  10. Amunts, K., et al. BigBrain: An Ultrahigh-Resolution 3D Human Brain Model. Science. 340, 1472-1475 (2013).
  11. Ali, S., et al. Rigid and non-rigid registration of polarized light imaging data for 3D reconstruction of the temporal lobe of the human brain at micrometer resolution. NeuroImage. 181, 235-251 (2018).
  12. Kozai, T. D. Y., et al. Ultrasmall implantable composite microelectrodes with bioactive surfaces for chronic neural interfaces. Nature Materials. 11, 1065-1073 (2012).
  13. Kampasi, K., et al. Dual color optogenetic control of neural populations using low-noise, multishank optoelectrodes. Microsystems & Nanoengineering. 4 (1), 10 (2018).
  14. Hellwig, B. A quantitative analysis of the local connectivity between pyramidal neurons in layers 2/3 of the rat visual cortex. Biological Cybernetics. 82 (2), 111-121 (2000).
  15. Bezgin, G., Reid, A. T., Schubert, D., Kötter, R. Matching spatial with ontological brain regions using Java tools for visualization, database access, and integrated data analysis. Neuroinformatics. 7 (1), 7-22 (2009).
  16. Holmgren, C., Harkany, T., Svennenfors, B., Zilberter, Y. Pyramidal cell communication within local networks in layer 2/3 of rat neocortex. The Journal of Physiology. 551 (1), 139-153 (2003).
  17. Boucsein, C., Nawrot, M., Schnepel, P., Aertsen, A. Beyond the cortical column: abundance and physiology of horizontal connections imply a strong role for inputs from the surround. Frontiers in Neuroscience. 5 (32), 1-13 (2011).
  18. Edelsbrunner, H., Aronov, J. P. B., Basu, S., Sharir, M. Surface reconstruction by wrapping finite point sets in space. Discrete and Computational Geometry - The Goodman-Pollack Festschrift. , 379-404 (2003).
  19. Roland, P. E., et al. Human brain atlas: For high‐resolution functional and anatomical mapping. Human Brain Mapping. 1 (3), 173-184 (1994).
  20. Johnson, G. A., et al. Waxholm space: an image-based reference for coordinating mouse brain research. NeuroImage. 53 (2), 365-372 (2010).
  21. Evans, A. C., Janke, A. L., Collins, D. L., Baillet, S. Brain templates and atlases. NeuroImage. 62 (2), 911-922 (2012).
  22. Okabe, S. Brain/MINDS–a new program for comprehensive analyses of the brain. Microscopy. 64 (1), 3-4 (2015).
  23. Shimono, M., Hatano, N. Efficient communication dynamics on macro-connectome, and the propagation speed. Scientific Reports. 8 (1), 2510 (2018).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

N robilimsay 147beyinsinir a larmanyetik rezonans g r nt leme MRGboyutlu 3D taramaharitalamal ekconnectomics

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır