JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

والهدف من هذا البروتوكول عزل الرئيسيات نونومان CD34+ الخلايا من نخاع العظم معبي، للجينات-تعديل هذه الخلايا مع ناقلات لينتيفيرال، وإعداد منتج لضخ في المضيف ذاتي. طول إجمالي البروتوكول ما يقرب من 48 ساعة.

Abstract

زرع الخلايا (هسبك) الجذعية والسلف المكونة للدم كان حجر زاوية في علاج لسرطان الدم وغيرها من أنواع السرطان لما يقرب من نصف قرن، يكمن وراء العلاج الوحيد المعروف للإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية (فيروس نقص المناعة البشرية-1)، وتبشر بخير هائلة في علاج الأمراض الوراثية مثل الثلاسيميا بيتا. مجموعتنا قد وضعت بروتوكولا للعلاج الجيني هسبك النموذجي في المقدمات نونومان (NHPs)، يسمح للعلماء لتحسين العديد من نفس الكواشف والتقنيات التي تطبق في العيادة. هنا، يمكننا وصف طرق لتنقية CD34+ هسبكس وطويلة الأجل استمرار الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSC) مجموعات فرعية من معبي نخاع العظم (بي أم). يمكن أن تستخدم تقنيات مماثلة لتنقية مصادر هسبك أخرى (مثلاً، الدم المحيطي تعبئة الخلايا الجذعية [ببسكس]). المبين هو بروتوكول يوم 2 التي الخلايا هي تنقية ومثقف وتعديل مع لينتيفيروس (LV) وعلى استعداد لضخ العودة إلى المضيف ذاتي. قراءات أساسية للنجاح تشمل نقاء CD34+ هسبك السكان، وقدرة هسبكس المنقي تشكل مستعمرات شكلياً متميزة في وسائل الإعلام سيميسوليد، والأهم من ذلك، كفاءة التعديل الجيني. أن الميزة الأساسية للعلاج الجيني هسبك هو القدرة على توفير مصدر للخلايا المعمرة التي تؤدي إلى جميع أنواع الخلايا المكونة للدم. على هذا النحو، استخدمت هذه الأساليب للعلاج النموذجي للسرطان والأمراض الوراثية والأمراض المعدية. في كل حالة، أنشأتها الفعالية العلاجية هو تعزيز وظيفة ذرية هسبك متميزة، بما في ذلك خلايا الدم الحمراء وخلايا T وخلايا ب، مجموعات فرعية النقوي. الأساليب لعزل، تعديل، وإعداد هسبك المنتجات مباشرة المنطبقة وقابل للنقل لأمراض متعددة في المرضى البشرية.

Introduction

العلاج الجيني في الخلايا الجذعية وسيلة قوية للتصدي لمجموعة واسعة من الأمراض البشرية. العلاج الجيني هسبك هو نهج جاذبية خاصة، بسبب ط) السهولة النسبية لجمع هذه الخلايا من المرضى، والثاني) ثروة المعارف التي تتوفر بخصوص تعمل الخلية السطحية والسابقين فيفو ثقافة المعلمات، كالمجال يتسع، لأن الثالث) ويقدم العلماء مربع أدوات استراتيجيات تعديل الجينات لتلائم مختلف الأمراض ذات الأهمية المتزايدة. أننا نحقق بنشاط هسبك نهج العلاج الجيني من زوايا متعددة، بما في ذلك العلوم الأساسية هسبك علم الأحياء وانجرافتمينت من هسبكس المعدلة وراثيا الإكلينيكية في النماذج الحية، وتطبيق للسكان المريض ذات الصلة. نحن وآخرون اتسمت خلية النمط الظاهري السطحي متميزة وظيفيا هسبك مجموعات فرعية،1،2،3، وتعبئة وتكييف الأنظمة العلاجية التي تعظم العائد هسبك وانجرافتمينت مع التقليل سمية4،5، والجينات استراتيجيات تحرير الجينات التي تلائم مجموعة واسعة الخبيثة، والوراثية، والأمراض المعدية6،،من78، وتعديل 9،10. يمكن تقييم وظيفة وانجرافتمينت من هسبكس المعدلة وراثيا في عدد من نماذج الحيوانات الصغيرة والكبيرة، بما في ذلك الفئران والكلاب ونهبس. على وجه الخصوص، نماذج الخطتين مفيداً نظراً لأن العديد من الكواشف، على سبيل المثال، الأجسام المضادة المحددة هسبك الخلية البروتينات السطحية مثل CD34 و CD90، يمكن استخدامها بشكل تبادلي في الإنسان وخلايا الخطتين. وعلاوة على ذلك، خلافا للفئران، الحيوانات الكبيرة مثل نهبس السماح لتقريب أكثر قربا من نطاق تعديل الجينات اللازمة للفعالية السريرية. وأخيراً، نهبس هي المعيار الذهبي لنماذج الأمراض البشرية مثل الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية-111 ونظام نموذج الناشئ للمرشح السرطان، ومكافحة فيروس نقص المناعة البشرية إيمونوثيرابيس12،13.

والغرض من هذا البروتوكول تحديد أساليب لتنقية وتعديل وراثيا، وإعداد منتجات ضخ هسبك الخطتين. على الرغم من خارج نطاق هذا البروتوكول، وقد أظهرنا سابقا أن هذه المنتجات انجرافت في ذاتي الخطتين المضيفين، تؤدي إلى جميع الأنساب المكونة للدم، وتوفير الفعالية العلاجية في طائفة واسعة من النماذج المرض1. كما تتميز كلوناليتي هسبكس انجرافتينج وبناء منصة لتتبع حركية والاتجار بالأشخاص، والنمط الظاهري هسبكس الفردية وذرياتهم، الزرع الذاتي التالية1،14. الأساليب المقدمة هنا قد وضعت مع الأهداف التالية: ط) لعزل هسبكس نقية جداً وطويلة الأجل انجرافتينج HSC مجموعات فرعية، الثاني) للحفاظ على هسكس البدائية خلال السابقين فيفو ثقافة، والثالث) لكفاءة الجينات تعديل الجملة أما هسبكس أو طويلة الأجل انجرافتينج HSC مجموعات فرعية. نحن نوظف المغناطيسي ساعد الخلية فرز (ماك)، فضلا عن تنشيط fluorescence الخلية الفرز (الأصول)، لعزل phenotypically/وظيفيا متميزة هسبك السكان، تمشيا مع أساليب العديد من المجموعات2،15، 16. صيانة هسكس البدائية في الثقافة (التقليل من التفريق بين هذه الخلايا إلى فروعه ملتزمة التي تؤدي بالكامل متمايزة أي مجموعات فرعية اللمفاوية والنقوي) جانبا أساسيا من جوانب البروتوكول هو موضح هنا. على الرغم من أننا تميزت سابقا النهج بتوسيع هسبكس مع الاحتفاظ النمط الظاهري بدائية17،18، هنا، نحن تصف بروتوكول الذي يركز على الحفاظ على هسكس عبر الحد أدنى (ح 48) وتعريف السابقين فيفو ثقافة.

تعديل كفاءة هسبكس و HSC مجموعات فرعية هدف الرئيسي لهذا البروتوكول. بين عدة نهج أبلغنا، هما حتى الآن أكثر من التحقيق في التجارب السريرية: التعديل الجيني بوساطة LV والجينات بوساطة nuclease التحرير1،،من619. استخدام استراتيجيات تحرير الجينات واحدة من عدد من منصات نوكلاس لتعديل جينات مستهدفة للفائدة على وجه التحديد، على سبيل المثال، اكتب مستقبلات تشيموكيني ج ج 5 (CCR5) لعلاج الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية7،19 أو Bcl11A لعلاج من هيموجلوبينوباثيس6. هنا، علينا أن نركز على التعديل الجيني بوساطة LV، الذي دمج الشحنات المعدلة وراثيا سيميراندوملي في الجينوم1،،من820. مزايا رئيسية للنهج LV هو القدرة على توفير كميات كبيرة من المواد الوراثية (ما يصل إلى 8 أو 9 كيلوبس). على الرغم من أن يجري وضع استراتيجيات تحرير الجينات لاستهداف التحوير فائدة لدمج فقط في مكان محدد حسب الجهات المانحة مثلى جزئ (HDR)، هذه الأساليب يتطلب مزيدا من التطوير في المختبر وفي نماذج حيوانية صغيرة. وفي المقابل، ناقلات LV قد استخدمت على نطاق واسع في نهبس والمرضى21،22. الأهم من ذلك، البروتوكول هو موضح هنا، الذي يستخدم أعدادا BM كمصدر هسبك بداية، يمكن بسهولة وعلى نطاق واسع تكييفها، على سبيل المثال، لعزل ببسكس. كما هو موضح أعلاه، يمكننا الاستفادة من درجة عالية من التشابه الوراثي بين نهبس والبشر لاستخدام الكواشف التي تنطبق على كلا من الأنواع. وأخيراً، تم تكييف هذا النهج تعديل المجموعات الفرعية الأخرى المكونة للدم، أي تي الخلايا12،،من2324؛ ظهور نهج العلاج المناعي خلايا تي ناجع وقد تعتمد اعتماداً كبيرا على منصة LV نفسها المستخدمة في هذا البروتوكول. هذه الأساليب مناسبة لأي باحث المهتمة في البيولوجيا هسبك أو التعديل الجيني بوساطة LV. على سبيل المثال، يمكن استخدام البروتوكول تنقية هسبك المعروضة هنا لتميز رواية HSC إثراء مجموعات فرعية، كما هو موضح سابقا1،،من1525. وبالمثل، توصيل LV الأساليب المعروضة هنا يمكن كذلك تطبيقها وتطويرها للعديد من أنواع الخلايا الأخرى والأسئلة التجريبية، سواء في نماذج في المختبر والمجراه.

وباختصار، نقدم طرق لعزل وتعديلها وراثيا "هسبكس الخطتين". هذه الطرق يمكن تكييفها بسهولة للأنواع الأخرى ومصادر أخرى من هسبكس. ويبين هذا البروتوكول فحص دقة وعدا كبيرا في نماذج العلاجات الناجعة للعديد من الأمراض البشرية.

Protocol

وتجري زرع الخطتين ذاتي، فتيلة (تعبئة)، والمجموعة من الخلايا، وتعديل الجينات متسقة مع البروتوكولات المنشورة سابقا26. جميع إجراءات تجريبية يتم استعراضها والموافقة عليها برعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة بمركز أبحاث فريد هاتشينسون السرطان وجامعة واشنطن (البروتوكول #3235-01). تجري جميع الدراسات الصارمة وفقا للتوصيات الواردة في الدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية "المعاهد الوطنية للصحة" ("دليل")؛ وانتدب الحيوانات عشوائياً للدراسات.

1-إثراء CD34+ هسبكس والثقافة بين عشية وضحاها (اليوم-1)

  1. حصاد BM وشرط عليه.
    1. تعبئة نهبس مع عامل تحفيز مستعمرة المحببات (جكسف) لمدة 4 أيام كما هو موضح سابقا26.
    2. رصانة الحيوانات مع 100 ملليغرام/كغم الكيتامين و 0.03 مل/كجم من ديكسميديتوميديني (الأوراق المالية 0.5 ملغ/مل). إدارة المسكنات (مثل، البوبرينورفين ريال) في وقت السحب.
    3. باستخدام مقص، حلق شعر الحيوان من نهاية الدانية من عظم العضد أو عظم الفخذ bone(s) وفرك الجلد بفرك المستندة إلى اليود أو حل مطهر مماثل، بديل مع الكحول، وكرر 3 x. كمخدر إضافية، يبث في السمحاق مع bupivacaine (2 مغ في كل موقع، الأسهم 5 ملغ/مل).
    4. ضع الإبرة تطلع نخاع العظام (16 G) موقع دخول periosteal (تجويف النخاع) واختراق الجلد، وتخترق تجويف النخاع باستخدام اقتراح تناوب. إزالة ستيليت إبرة الطموح والاحتياطي في حقل عقيمة لاستخدامها مرة أخرى.
      ملاحظة: اختر موقع periosteal الدخول إلى تجويف النخاع في منطقة العظام التي لا تغطيها العضلات وأين الشكل/المناظر الطبيعية العظم أما مرئية أو يمكن أن يرى بسهولة من خلال الجلد (عادة في اتجاه نهاية العظام القريبة أو البعيدة).
    5. إبرة BM، تعلق حقنه المعبأة التي تحتوي على خليط من سترات التخثر سكر العنب الحل (حوار التعاون الآسيوي-A) والهيبارين (20 جامعة جنوب المحيط الهادئ/mL, 1 مل كل مل 9 نخاع يتعين جمعها).
    6. رسم المكبس مرة أخرى حين تعصف أطرافهم بلطف والتناوب عليها، أن تحرض المحاقن مزيج أسبيراتي وتخثر الدم. تدوير الإبرة وموضعه طوال الطموح والانسحاب الوصول إلى نسبة مئوية أكبر من الخلايا داخل الفضاء نخاع.
    7. حالما يتم جمع العينة، إزالة الإبرة وتطبيق الضغط على الموقع تطلع حتى يتوقف النزف.
      ملاحظة: اعتماداً على حجم الحاجة، يمكن استخلاص نخاع العظام من واحد إلى أربعة أطراف (هوميري اثنين، هما قصبة) خلال مجموعة واحدة. وينبغي جمع أي أكثر من 20 مل من كل أطرافه، وينبغي أن تشكل إجمالي حجم تجمع لا يزيد عن 10% وزن الحيوان (10 مل/كغ).
    8. إذا تلقي تبين من أطراف متعددة، تجمع بين وسجل وحدة التخزين.
    9. واسمحوا بوستانيسثيسيا استرداد الخطتين.
      1. عكس آثار ديكسميديتوميديني مع أتيباميزولي 0.03 مل/كغ (5 ملغ/مل الأسهم) بعد هذا الإجراء. توفير المسكنات (مثل، البوبرينورفين ريال) كما تقضي بذلك موظفي الطب البيطري السريرية لمالا يقل عن 48 ساعة بعد الإجراء أو أطول، حسب تقدير الطبيب البيطري السريرية، استناداً إلى علامات سريرية.
      2. إرجاع الحيوان إلى قفصة المنزل بعد الإجراء ورصد كل 15-20 دقيقة، حتى الحيوان قادرة على الجلوس من تلقاء. رصد الحيوان يوميا من موظفي التعليم والتدريب المهني حتى يتم تحديد أن تلتئم الشفط (ق). وبالإضافة إلى ذلك، رصد أي علامات للالتهاب أو العدوى أو الألم.
    10. وبالتوازي مع معالجة الخلية، شرط الخطتين نفسه تشعيع الجسم الكلي ميلوابلاتيفي (تبي): كجي 1,020 بمعدل 7 كجي/دقيقة إدارة الإشعاع بجرعات هورمونات على مدى يومين قبل ضخ خلية.
  2. هيموليزي في بي أم.
    1. تقسيم BM أنابيب مخروطية 50 مل (10-12 مل في الأنبوب) وإضافة المخزن المؤقت الانحلالي إحضار وحدة التخزين إلى 50 مل (الجدول 1). احتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة (RT) حتى يتم تفكيك ولكن لا يزيد عن الحد الأدنى 7 أجهزة الطرد المركزي في 800 x ز لمدة 5 دقائق ونضح المادة طافية من pellet(s)، ترك 2-5 مل من حجم/الأنبوبة. ريسوسبيند بيليه في حجم المتبقية.
      ملاحظة: عينات بنجاح تفكيك تغيير اللون، من أحمر داكن إلى حمراء خفيفة شفافة.
    2. إضافة 10-15 مل من المخزن المؤقت الانحلالي/بيليه. قم بإزالة أي تجلط الدم باستخدام 70 ميكرومتر خلية مصافي. إضافة الانحلالي المخزن المؤقت يصل إلى 50 مل واحتضان لمدة 5 دقائق في RT، وتدور في 800 x ز لمدة 5 دقائق.
    3. نضح المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في 10 مل من المخزن المؤقت لأجهزة ماكينتوش (الجدول 1). تصفية مرة أخرى من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر. شطف الأنبوب وتصفية مع 40 مل من أجهزة ماكينتوش المخزن المؤقت يصل إلى 50 مل.
  3. إثراء في CD34+ الخلايا من هيموليزيد خلايا الدم البيضاء (الكريات البيضاء) باستخدام البروتوكولات القياسية.
    1. تدور الخلايا في 800 x ز عن 15 دقيقة الاختيار هذه الأنابيب للتأكد من الدوامات الخلية لا تتضح في الأعلى/الأوسط. إذا كانت خلايا موجودة أعلاه بيليه، تدور مرة أخرى بسرعة أكبر (تصل إلى 1,000 x ز كحد أقصى) و لمدة تصل إلى 10 دقائق.
    2. نضح المادة طافية وريسوسبيند أنه في 10 مل أو أقل من المخزن المؤقت لأجهزة ماكينتوش، مشيراً إلى أن حجم الدقيق. عد الخلايا في إضعاف 1: 100 أو 1:1,000 باستخدام هيموسيتوميتير أو عداد الآلي خلية.
      ملاحظة: عدد تخصيب اليورانيوم قبل الوقت هذا العدد الإجمالي لمكافحة حرائق آبار النفط.
    3. إضافة أجهزة ماكينتوش العازلة جلب تركيز الخلية إلى 1 x 108 خلايا/مل. إذا لزم الأمر، أولاً كرر الخطوات 1.3.1-1-3-2 (مثلاً، بسبب عدد قبل تخصيب اليورانيوم منخفض). حجز 5 × 106 خلايا في المخزن المؤقت لأجهزة ماكينتوش لفرعية HSC تلطيخ (التخصيب قبل عينة).
    4. إضافة CD34 مكافحة unconjugated جسم (استنساخ 12.8، الجدول للمواد)27 في الخلايا قبل تخصيب اليورانيوم المتبقية لتركيز نهائي من 40 ميكروغرام/مل (1 × 108 خلايا/مل). احتضان تعليق خلية في 4 درجات مئوية على المدورة أنبوب (انظر الجدول للمواد) لمدة 25-30 دقيقة.
    5. استخدام أجهزة ماكينتوش المخزن المؤقت إلى الحجم 50 مل وتدور الخلايا في 800 x ز للحد الأدنى 5 نضح المادة طافية، ريسوسبيند الخلايا في 50 مل من المخزن المؤقت لأجهزة ماكينتوش، وتدور مرة أخرى في 800 x ز لمدة 5 دقائق.
    6. ديغا 100 مل من المخزن المؤقت لأجهزة ماكينتوش مع اثنين من أنابيب تصفية، التفاف مدخل الهواء مع ورق الشمع، 25-30 دقيقة أو حتى جاهزة للاستخدام.
    7. حساب حجم الخرز المغناطيسية اللازمة: 1 مل من 10 حبات/9 خلايا. نضح المادة طافية وريسوسبيند الخلايا لخلايا8 10/مل، بعد إضافة الخرز. فعلى سبيل المثال:9 خلايا 3 × 10 + 3 مل من حبات + 27 مل من أجهزة ماكينتوش المخزن المؤقت إلى 30 مل حجم الإجمالي.
    8. احتضان تعليق خلية في 4 درجات مئوية على المدورة أنبوب لمدة 25-30 دقيقة.
    9. أثناء الحصول على مغناطيس للأعمدة؛ خطة لاستخدام 0.6 × 109 خلايا كل عمود. وضع الأعمدة على المغناطيس ووضع أنبوب 50 مل مخروطية الشكل أدناه كل عمود للتدفق من خلال جمع. إعداد أنبوب مخروطي 15 مل والمكبس لكل عمود شطف (الخطوة
    10. عند اكتمال الحضانة في خطوة 1.3.8، إضافة المخزن المؤقت لأجهزة ماكينتوش إلى 50 مل وتدور في 800 x ز لأدنى 5 Aspirate المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في أجهزة ماكينتوش يطرد العازلة (2 مل كل عمود). ماصة برفق لتجنب إدخال الفقاعات.
    11. دون السماح للعمود لتجف، أضف 1 مل من المخزن المؤقت لأجهزة ماكينتوش يطرد لكل عمود، تليها 2 مل تعليق خلية. شطف بالتصفية والانبوب الأصلي مع المخزن المؤقت لأجهزة ماكينتوش يطرد وتقسيم الحل على قدم المساواة بين الأعمدة (6 مل/عمود)؛ ثم إضافة 7 مل من أجهزة ماكينتوش يطرد العازلة للغسيل نهائياً.
    12. بلطف سحب العمود بعيداً عن المغناطيس (دفع الجزء الخلفي العلوي) وجمع آخر بالتنقيط في التدفق من خلال أنبوب. إضافة 5 مل من المخزن المؤقت لأجهزة ماكينتوش يطرد إلى كل عمود ويطبق المكبس الوت الخلايا في أنبوب مخروطي العقيمة من الخطوة 1.3.9. لا تجمع أي سائل بعد ظهور الفقاعات.
  4. عد الخلايا التخصيب والتدفق من خلال (قدم) جمع الأنابيب بنسبة 01:10 إضعاف. تبقى الخلايا على الجليد. الكوة 1 × 106 خلايا من أثري CD34 الكسر والخلايا 5 × 106 من كسور متر للتحليل بالتدفق الخلوي. تخزين الكسر متر في 4 درجات مئوية حتى يتم الانتهاء من مراقبة الجودة (الخطوة 2).
    ملاحظة: عدد CD34+ الخلايا المطلوبة لتعتمد على تواتر CD34 أثري HSC engraftment مولتيلينيجي ناجحة في الخطتين+CD90+CD45RA– مجموعة فرعية. استناداً إلى تردد متوسط من 3-5% والحد الأدنى من المتطلبات من 122,000 CD34+CD90+CD45RA– الخلايا للكيلوغرام الواحد من الجسم الوزن1، يصل إلى 10 × 10 والتي ينصح بها المضي قدما في مجموعة على الأقل 2.5 × 106 6 CD34+ الخلايا للكيلوغرام الواحد من وزن الجسم.
  5. إضافة أجهزة ماكينتوش المخزن المؤقت إلى CD34+ أثري الكسر إلى 50 مل في المجموع، تدور في 800 x ز لمدة 5 دقائق ونضح المادة طافية وريسوسبيند الخلايا إلى 106 خلايا/مل في وسائط الإعلام هسبك (الجدول 1).
    1. لوحة الخلايا في كثافة 106 خلايا/مل في تنفيس، زراعة الأنسجة (TC)-معاملة قوارير T-75، 10-20 مل في قارورة، واحتضان هذه بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، 5% CO2 حاضنة. بقية قوارير طوليا (عدم الوقوف).
      ملاحظة: إذا رغبت في ذلك، CD34 إضافية+ الخلايا أو CD34– متر يمكن cryopreserved في 90% معطل الحرارة الجنيني البقري المصل (FBS) + 10% ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) بتركيز 1 × 106 إلى 5 × 106 خلايا/مل، ثم تبريد بطيئة في- 80 درجة مئوية (على سبيل المثال، تستخدم حاويات تجميد). استرداد متوسط غلة cryopreserved الخلايا مرهون CD34+ النقاء وعادة تتراوح من 50% إلى 80% مع قدرة بقاء > 80%.

2-مراقبة النوعية من الخلايا CD34 المخصب (يوم-1)

  1. إعداد العينات للتدفق الخلوي.
    1. ريسوسبيند عينات محفوظة من كل مرحلة العزلة المذكورة أعلاه (التخصيب قبل وقدم، والكسور أثري CD34) في المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية بتركيز 10 × 106 خلايا/مل ونقل 100 ميليلتر من كل تعليق خلية (الجدول 1) إلى أنبوب نظام مراقبة الأصول الميدانية.
      ملاحظة: ينبغي أن تشمل عينات مراقبة الخلايا أونستينيد من كل مرحلة العزلة (مثلاً 5 × 105 خلايا) للتعديل من الأمام مبعثر (FSC) والجانب مبعثر (SSC) وأوتوفلوريسسينسي في كل قناة الأسفار. وباﻹضافة إلى ذلك، سيلزم الخرز التعويض الملطخة بمفرده لكل جسم مترافق fluorochrome لضبط لتعويض ما بين القنوات المجاورة (الجدول 2 و الجدول 3).
    2. إضافة الأجسام المضادة المطلوبة (مثلاً، CD45 مكافحة مكافحة-CD34، CD45RA المضادة ومكافحة--CD90)، وفقا لإرشادات الشركة المصنعة، لاختبار واحد (1 × 106 خلايا في 100 ميليلتر) (الجدول 3). احتضان لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. أضف 3 مل من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية وتدور في 800 x ز لمدة 5 دقائق ونضح المادة طافية، ريسوسبيند في 100 ميليلتر من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية، وتحليل تدفق مناسب سيتوميتير (الخطوة 2، 2).
  2. إعداد أرز سيتوميتير/خلية تدفق للتحليل.
    ملاحظة:     فمن المستحسن إجراء التحليل على نفس الجهاز الذي سيتم استخدامه للخلية الفرز في الخطوة 2، 3.
    1. إنشاء بروتوكول بما في ذلك منتدى التعاون الأمني/SSC و CD45/CD34 CD45RA/CD90 (ثلاث قطع تدفق). انقر بالزر الأيمن على مؤامرة تدفق وإضافة تخطيط التسلسل الهرمي للسكان .
    2. الأيسر على الأرض منتدى التعاون الأمني/SSC وحدد ميزة بوابة المضلع، ورسم بوابة لاستبعاد الحطام والخلايا الميتة. تسليط الضوء على البوابة الجديدة وإعادة تسميته إلى مبعثر في إطار المفتش.
      ملاحظة: ويطلق هذا تلقائياً P1.
    3. انقر بالزر الأيمن في وسط الأرض تدفق CD45/CD34، انتقل إلى إظهار السكان، وبوابة مؤامرة مبعثر. رسم الخلايا بوابة مستطيلة حول CD45intCD34+ إلى استبعاد غير CD34 الخلايا والخلايا نونهيماتوبويتيك، وكذلك المتبقية الصفائح الدموية والكريات الحمراء (CD45–). تسمية البوابة CD34+.
    4. بوابة المؤامرة تدفق CD45RA/CD90 في CD34+ السكان. رسم سوبجاتيس المستقلة الثلاثة حول CD90+CD45RA– الخلايا (إثراء هسكس)، CD90–CD45RA الخلايا– (إثراء لموروث multipotent واريثرو النقوي [توجبه/EMPs])، و CD90–CD45RA + الخلايا (إثراء لموروث ليمفو النقوي [لمبس]). تسمية الأبواب HSCو القسط-EMP LMP، على التوالي.
    5. عند الانتهاء، ضمان أن التسلسل الهرمي للسكان يحتوي على إدخالات تنظيم هرمي الستة بالترتيب التالي: 1) "جميع الأحداث"؛ 2) مبعثر؛ 3) CD34+؛ 4) HSC؛ 5) MPP-خطة الإدارة البيئية؛ 6) LMP. التأكد من أن قطع تدفق والشكل من البوابة البحث كما هو موضح في الشكل 4.
    6. تشغيل الكريات البيضاء قبل تخصيب أونستينيد لضبط الجهد لمنتدى التعاون الأمني والتعاون بين بلدان الجنوب وجميع الأسفار القنوات (الجدول 2، نموذج 5). تشغيل الخرز التعويض الملطخة بمفرده لضبط التعويض ما بين القنوات المجاورة (الجدول 2، عينات 1-4). تشغيل جميع ما تبقى أونستينيد والملون عينات مع المعدل والتعويض عن البروتوكول، لتوثيق CD34 إثراء الكفاءة (الجدول 2، عينات من 6-9).
      ملاحظة: الاحتفاظ بالعينة النهائية (الجدول 2، 10 عينة) لتحليل التدفقات المتزامنة والخلية الفرز في الخطوة 2، 4.
  3. تكوين فارز خلية للفرز-تنقية مجموعات فرعية CD34 في تشكيل مستعمرة فحوصات الخلية (مركبات الكربون الكلورية فلورية).
    ملاحظة:     إذا كان قد استخدم جهاز آخر للتحليل (الخطوة 2، 2)، إعداد البروتوكول على فارز الخلية كما سبق ذكره في خطوات 2.2.1-2.2.5.
    1. قم بضبط الزاوية/الجهد لتيارات الجانب الأيسر والأيمن في البرنامج فارز خلية لإيداع الخلايا في أنابيب 15 مل المحتوية على مركبات الكربون الكلورية فلورية المتوسطة. تكوين زاوية تيار الجانب لمنع اختلالها. ضبط زاوية تيار الجانب درا المجوعات، حتى ضرب خلايا تم فرزها المتوسطة مركبات الكربون الكلورية فلورية وليس إلى جانب الأنبوب لأنه يتم فرز الخلايا قليلة جداً.
    2. في المستعرض، فتح مجلد "أوراق العمل العالمية"، وإنشاء تخطيط جديد فرز باستخدام الزر في أعلى القائمة لإطار المستعرض. تغيير الإدخال في القائمة المنسدلة "الجهاز جمع" أنابيب 2، والإدخال في القائمة المنسدلة الدقة 4-طريقة النقاء أو خلية واحدة وتعيين "الأحداث المستهدفة" إلى 800-1,200 الخلايا. الأيسر في حقل نوع الموقع (اليسار أو اليمين) وحدد إضافة إدخال في القائمة، واختيار السكان لفرز من القائمة.
  4. فرز الخلايا لفحوصات مركبات الكربون الكلورية فلورية.
    ملاحظة:     الفرز لفحوصات مركبات الكربون الكلورية فلورية تتم فقط مع الخلايا من أثري CD34 المنتج (الجدول 2، نموذج 10).
    1. تحميل نموذج 10، سجل الأحداث 2,000 3,000، وغرامة ضبط بوابات الفرز صالح السكان إشارة قوة والهدف.
    2. عند اكتمال الإعداد، تكتسب الخلايا (الجدول 2، نموذج 10). الحصول على البيانات كما هو موضح في الخطوة 2.2.3 وضبط معدل التدفق إلى 500-1,000 الخلايا/s، وفرز الخلايا 800-1,200 من ط) بوابة مبعثر، ثانيا) CD34+ الثالث) HSC، بوابة EMP القسط الرابع)، وبوابة الخامس) بوابة LMP في أنابيب منفصلة تحتوي على 3.6 مل من مركبات الكربون الكلورية فلورية وسائل الإعلام.
      ملاحظة: الفرز لمركبات الكربون الكلورية فلورية فحوصات تتم فقط مع الخلايا من المنتج أثري CD34 (الجدول 3، عينة 10). خلايا من التشتت و CD34+ غيتس يجب أن يتم فرز كل على حدة، بينما يمكن فرز هسكس والقسط-EMPs لمبس في موقف حامل الأنبوب الأيسر والأيمن في نفس الوقت.
    3. دوامة والاستغناء عن 1 مل تعليق خلية لكل من نونتيسوي العقيمة، 3 × 3.5 سم، تعامل الثقافة أطباق بيتري. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة 10-14 يوما في حاوية ثانوية (مثلاً، طبق بيتري 15 سم).
    4. في أيام 10-11 بوستبلاتينج، عد المستعمرات الفردية من جميع لوحات ثلاثة كل شرط، استناداً إلى مورفولوجيا مستعمرة.

3-الجينات تعديل CD34+ هسبكس والانتعاش بين عشية وضحاها (يوم 0)

  1. تمييع 2.5 مل من 1 ميكروغرام/ميليلتر CH-296 حل 50 ميكروغرام/مل في 50 مل من محلول ملح متوازن هانك في (حبس، انظر الجدول للمواد).
  2. إعداد قوارير لتوصيل الجهد المنخفض.
    1. تحديد العدد التقريبي لثقافة نونتيسوي (غير TC)-تعامل قوارير المطلوب (عادة من عدد خلايا تحديده في الخطوة 1، 4). تخطط للوحة 1 × 107 خلايا في 10 مل من وسائل الإعلام كل قارورة T-75 (1 × 108 مجموع الخلايا يتطلب 10 قوارير) وتشمل واحد من لوحة 12-جيدا-التعامل مع TC (شرط توصيل صورية). إضافة حبس العقيمة و 50 ميكروغرام/مل الأسهم CH-296 من الخطوة 3.1 لكل قارورة/لوحة، بتركيز 2 ميكروغرام/سم2. لقوارير T-75، استخدم 3 مل 50 مل CH 296 + 7 ميكروغرام/ملليلتر من حبس؛ للوحة 12-جيدا، واستخدام ميليلتر 160 من 50 ميكروغرام/مل CH 296 + 340 ميليلتر لحبس كل بئر.
    2. السماح للاطباق على الجلوس دون عائق في RT على مقاعد البدلاء نظيفة، أو في غطاء محرك السيارة ل 2 حاء Aspirate CH-296 واستبدالها بكمية مماثلة من حبس معقمة + 2% ألبومين المصل البقري (BSA). احتضان على RT لمدة 30 دقيقة، ونضح هبس/جيش صرب البوسنة وغسل الأطباق بحجم مماثل من هبس العقيمة التي تحتوي على 2.5% 1 "م هيبيس"، درجة الحموضة 7.0. نضح فورا قبل طلاء الخلايا (الخطوة 3، 4).
      ملاحظة: وفي أعقاب الخطوة 3.2.2، لا تسمح باللوحات/قوارير لتجف. لوحات تتضمن العقيمة حبس + 2.5% 1 "م حبيس" هي المعقود في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها (أي، تعد اليوم-1).
  3. الحصاد وترانسدوسي CD34+ الخلايا من يوم-1.
    1. استخدام ماصة 10 مل، شطف الخلايا فضفاضة ملتصقة بدهن لطيف، المتكررة لكل قارورة الثقافة مع حبس العقيمة. تأكد من أن كافة الخلايا سيتم فصل (إذا لزم الأمر، اضغط/صفعة قارورة لتخفيف الخلايا).
    2. الطرد المركزي الخلايا في 800 x ز لمدة 5 دقائق ونضح المادة طافية ريسوسبيند الخلايا في توصيل الوسائط بتركيز 1 × 106 خلايا/مل. وبمجرد الانتهاء من جمع كافة الخلايا، تحديد عدد الخلايا، باستخدام هيموسيتوميتير أو العداد الآلي الخلية.
    3. أضف 1 مل تعليق خلية (1 × 106 خلايا) إلى بئر واحدة لصفيحة 12-جيدا CH-296-المغلفة (للحصول على نموذج التحكم ترانسدوسيد موك). الفجوة المتبقية الخلايا بين قوارير T-75 (الخطوة 3.2.2)، إضافة حوالي 10 مل (1 × 107 الخلايا) في قارورة. السماح للخلايا للالتزام بطلاء CH-296 بحضانة في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2 لمدة 30 دقيقة، مع قبعات تنفيس.
    4. ذوبان الجليد مكيفة الفيروسات وسائل الإعلام (VCM، الجدول للمواد)، وتحديد عيار في وحدة معدية في المليلتر (وحدة دولية/مل)28،،من2930،31،32 . إضافة حجم VCM المناسبة لكل قارورة T-75 من الخطوة 3.3.3 واحتضان الخلايا في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2.
      ملاحظة: إذا كان المنفذ توصيل واحد، احتضان بين عشية وضحاها؛ إذا كان المنفذ توصيل مزدوجة، كرر هذا ستيبابروكسيماتيلي 6-8 ح بعد توصيل الأولى دون انتعاش يغسل المرحلة و، ثم، احتضان بين عشية وضحاها. على سبيل المثال، لقارورة واحدة (1 × 107 خلايا) مع تعدد المطلوب من العدوى (وزارة الداخلية) من 10، إضافة 1 مل فيروسات تيتيريد في 1 × 108 وحدة دولية/مل.

4-الخلية الحصاد والتحضير لضخ (1 يوم)

  1. حصاد الخلايا.
    1. جمع الخلايا ترانسدوسيد ووهمية كما هو موضح في الخطوات 3.3.1-3.3.2. أداء يغسل متسلسلة مع 10 مل حبس، نقل يغسل إلى الأنبوبة المخروطية مع الخلايا. تأكد من أن كافة الخلايا أزيلت من قوارير، التنصت/الصفع قوارير إذا لزم الأمر.
    2. الطرد المركزي من تعليق خلية في 800 x ز لمدة 5 دقائق ونضح المادة طافية ريسوسبيند بيليه في 1 مل حبس. الجمع بين هذه الأنابيب التي تحتوي على خلايا من نفس الحالة. أشطف كل منهما مع 10 مل حبس وأضف إلى ذلك تعليق خلية. تحديد عدد الخلايا استخدام هيموسيتوميتير. جعل حجم الخلية إجمالي 50 مل في حبس وأجهزة الطرد المركزي في 800 x ز لمدة 5 دقائق.
  2. نبض البروستاغلاندين E2 (PGE2) وإعداد المواد الكاشفة لضخ المنتج.
    1. نضح المادة طافية وريسوسبيند الخلايا ترانسدوسيد (لا صورية) إلى 5 × 106/mL في وسائل الإعلام هسبك دون السيتوكينات. إضافة 10 مم PGE2 لتركيز نهائي من 10 ميكرون. احتضان الخلايا على الجليد ح 2، يحوم بلطف لهم كل 30 دقيقة.
    2. خلال الخطوة 4.2.1، الحرارة--إلغاء تنشيط ذاتي المصل (جدول المواد) والتفاف الحاوية في ورق الشمع وتفرخ في 56 درجة مئوية للحد الأدنى 30 إعداد المصل الذاتي 2% في حبس (500 ميليلتر من المصل إبطال الحرارة + مل 24.5 من حبس)، مزيج جيد لهم، و تخزين المخلوط على الجليد حتى الاستخدام. أيضا، أثناء الخطوة 4.2.1، حصاد الخلايا ترانسدوسيد وهمية في صفيحة 12-جيدا قبل بيبيتينج الخلايا في أعلى وأسفل بقوة. إضافة تعليق خلية أنبوب مخروطي 15 مل، غسلها x 3 مع 1 مل حبس، وتضيف يغسل إلى أنبوب مخروطي 15 مل نفس.
    3. بعد 2 ساعة حضانة PGE2، تغسل الخلايا 2 x سينتريفوجينج لهم في 800 x ز لمدة 5 دقائق وتجاهل المادة طافية. بعد الغسيل الثاني، ريسوسبيند الخلايا الموجودة في وحدة تخزين مناسبة لحبس للعد، استخدام هيموسيتوميتير أو عداد الآلي خلية.
      ملاحظة: وكثيراً ما تتجمع الخلايا بعد نبض PGE2، التي يمكن أن تجعل عدد خلايا أقل موثوقية. إذا كان الأمر كذلك، استخدم عدد الخلايا من الخطوة 4.1.2 بدلاً من واحد من الخطوة 4.2.3.
  3. حجز خلايا وهمية وترانسدوسيد لمراقبة جودة المنتج التسريب (الخطوة 5): 5 × 105 إلى 1 × 106 خلايا للتدفق الخلوي/الخلية الفرز (خطوات 5.1 و 5.3) وحوالي 1 × 106 خلايا لثقافة السائل (الخطوة 5، 2) و مستعمرة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) (الخطوة 5، 4).
  4. إعداد المنتج التسريب.
    1. مع ما تبقى الخلايا ترانسدوسيد، أداء يغسل ثالثة في 50 مل حبس ونضح المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في 10 مل من حبس + 2% مصل ذاتي (أعد الخطوة 4-2-2). رسم الحل 10 مل في محقن 20 مل مزودة بإبرة ز 16.5. أغسل الأنبوب مع 10 مل من حبس + المصل التلقائي 2% ورسم الغسيل في محقن نفسه أن إجمالي حجم 20 مل. كاب المحاقن مع غطاء الإبرة وتسمية المحاقن، ووضعه على الجليد للنقل/التسريب.
    2. ضخ المنتج خلية ترانسدوسيد في البلد المضيف ذاتي، ويقع داخل مرفق بحوث حيوانية معتمدة، عبر قسطرة وريدية مركزية33،34. مراقبة خلايا الدم الكامل التهم الحيوانات زرع (CBCs) وكيمياء الدم وإجراء فحوصات الجينات-وضع العلامات الخاصة بالدراسة مصممة خصيصا للمشروع1،،من619.

5-مراقبة الجودة

ملاحظة: التدفق الخلوي والخلية الفرز يتم تنفيذها بعد أن يتم غرس الخلايا في الحيوانات كجزء من المتابعة هو موضح في الخطوة 4.4.2. تدفق سيتوميتريك وتستخدم البيانات فورا بعد زرع الأعضاء لتحديد التكوين phenotypically تعريف مجموعات فرعية الخلايا الجذعية والسلف في ضخ المنتج (خطوات 5.1 و 5.3)، بينما يتم إجراء تحليل فحوصات مركبات الكربون الكلورية فلورية 12-14 يوما بوستينفوسيون لتحديد كفاءة التعديل الجيني بمستعمرة [بكر] (الخطوة 5، 4).

  1. أداء التدفق الخلوي ومركبات الكربون الكلورية فلورية فرز المنتج التسريب.
    1. تحليل الخلايا بالتدفق الخلوي وفرز-تنقية CD34 مجموعات فرعية لفحوصات مركبات الكربون الكلورية فلورية، كما هو موضح في المقطع 2. فحوصات البذور مركبات الكربون الكلورية فلورية من الخلايا CD34 صورية وترانسدوسيد (ضخ المنتج بعد نبض PGE2).
    2. فرز كحد أقصى خلايا 800 كل شرط ودوامه، ولوحة، والثقافة، وتعول فحوصات مركبات الكربون الكلورية فلورية كما هو موضح في الخطوة 2، 4. وبعد فرز الأصوات، واختيار المستعمرات من فحوصات مركبات الكربون الكلورية فلورية لأداء مستعمرة [بكر] كما هو موضح في الخطوة 5، 4.
  2. ثقافة السائل
    1. لوحة خلايا لثقافة السائل في وسائط الإعلام هسبك في 1 × 106/mL في لوحات التعامل مع TC. في أيام 2 و 5 و 12 بوستترانسدوكشن، الحصاد وحساب الخلايا للتدفق الخلوي. الخلية الفرز لفحوصات مركبات الكربون الكلورية فلورية غير مطلوب.
    2. وفي أيام 2 و 5، ريبلاتي 33% الخلايا الموجودة في الوسائط هسبك جديدة في 1 × 106/mL. تجميد 33% الخلايا الموجودة في المخزن المؤقت لاستخراج الحمض النووي للكمي PCR الوقت الحقيقي. استخدام 33% الخلايا للتدفق الخلوي كما هو موضح في الخطوات 2.1 و 2.2.
    3. استخدام هذه البيانات من الخطوة 5.2.2 لتحليل تكوين المظهرية من ذرية المكونة للدم. تحديد تواتر CD34 + خلايا ومجموعات فرعية محددة فينوتيبيكالي كما هو موضح في الخطوة 2.2.2 داخل كل عينة. مقارنة تكوين CD34+ الخلايا بين الشروط لتحديد مفعول التعديل الجيني.
      ملاحظة: CD34+ الخلايا ينبغي الحفاظ على التعبير عنها في جميع أنحاء ثقافة كاملة وتحتوي على كافة مجموعات فرعية المظهرية. خسارة CD90+CD45RA– الخلايا أو فرط تمثيل المجموعات الشكلية يمكن أن تشير إلى الآثار المباشرة أو غير المباشرة للتعديل الجيني.
  3. تحديد مقدار التحوير التعبير (مثلاً.، أخضر نيون البروتين [بروتينات فلورية خضراء]) بالتدفق الخلوي (اختياري وذلك استناداً إلى إعداد تجريبية)، تكييف البروتوكول من الخطوة 2، 2.
    1. إضافة ثلاث قطع تدفق عرض SSC/التحوير (مثلاً SSC/التجارة والنقل). بوابة المؤامرة الأولى على هسكس والثاني عن توجبه EMPs، والثالثة لمبس. المؤامرة على كل مقابل التحوير (مثل التجارة والنقل) وإنشاء بوابات المسمى HSC-التجارة والنقل+والقسط-EMP-بروتينات فلورية خضراء+LMP-التجارة والنقل+، على التوالي.
    2. عند الانتهاء، التسلسل الهرمي للسكان يجب أن تحتوي على إدخالات تنظيم هرمي تسعة بالترتيب التالي: 1) "جميع الأحداث"؛ 2) مبعثر؛ 3) CD34+؛ 4) HSC؛ 5) HSC-التجارة والنقل+؛ 6) MPP-خطة الإدارة البيئية؛ 7) MPP-EMP-التجارة والنقل+؛ 8) LMP؛ 9) LMP-التجارة والنقل+.
      ملاحظة: أي تعبير التحوير في وقت لاحق في ثقافة السائل (مثلاً، أيام 5 و 12) سوف تعكس أفضل كفاءة تعديل الجينات يحدده مستعمرة [بكر] في الخطوة 5، 4. نقاط زمنية سابقة في ثقافة السائل قد نبالغ في التعبير التحوير، بسبب LVs تنل. وبالمثل، سيؤدي إلى تدفق--فرز الخلايا بروتينات فلورية خضراء+ لفحوصات مركبات الكربون الكلورية فلورية في يوم 1 في العديد من المستعمرات الإيجابية الكاذبة.
  4. أداء مستعمرة [بكر].
    1. بعد عد في خطوات 2.4.4 و 5.1.1، اختيار واحدة من المستعمرات إلى 50 ميليلتر من المخزن المؤقت لاستخراج الحمض النووي، واستخدام ميليلتر 10 أو 20 ميليلتر ماصة، وماصة صعودا وهبوطاً لتحويل المستعمرات إلى أنبوب واحد من بكر 8-أنبوب قطاع كاب. اختيار المستعمرات ثمانية من شرط صورية والمستعمرات 88 من الشرط ترانسدوسيد لإنشاء لوح كامل 96-بئر واحد. إضافة 50 ميليلتر من المخزن المؤقت لاستخراج الحمض النووي لكل بئر.
    2. استخراج الحمض النووي من المستعمرات، استخدام ثيرموسيكلير والبرنامج التالي: 65 ° C/20 دقيقة، 99 درجة مئوية/10 دقيقة، ودرجة مئوية 4 عقد. خطة لنقل الحمض النووي إلى-20 درجة مئوية أقرب للجودة المثلى.
    3. أداء مستعمرة PCR لتحديد الخلايا ترانسدوسيد LV، مقارنة العدد من المستعمرات LV+ ، استخدام أجهزة الإشعال لينتي F/R، إلى مجموع المستعمرات، استخدام كبسولة تفجير أكتين F/R والتحكم (جدول المواد).

النتائج

بروتوكول الموصوفة أعلاه يهدف إلى عزل والجينات-تعديل الخطتين CD34+ هسبكس، التي يمكن أن تكون غرست فيما بعد العودة إلى المضيف ذاتي (الشكل 1 و الشكل 2). عند اتباع هذا البروتوكول، نحن عادة الحصول على تصل إلى 8 × 109 مجموع الكريات البيضاء م...

Discussion

ناقل LV الهندسة هو الأسلوب الأفضل تتسم للجينات-تعديل أنواع الخلايا مثل CD34+ هسبكس، لزرع اللاحقة المجراة في. تم تصميم البروتوكول هو موضح هنا لزيادة عدد هسبكس المعدلة وراثيا التي ما زالت قائمة طويلة الأجل في فيفو، وتوفير الفوائد السريرية للمرضى بمختلف الأمراض الخبيثة والمعدية والوراثي...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

يشكر المؤلفون كراوفورد هيلين لإعداد هذه المخطوطة وجيم وولسي لتصميم الرسوم البيانية، ونيلسون فيرونيكا وكريموو ديفيكا للمشاركة في تطوير البروتوكول. تم دعم هذا البروتوكول من المنح المقدمة من المعهد الوطني للحساسية في المعاهد الوطنية للصحة والأمراض المعدية (R01 AI135953 و AI138329 إلى H.P.K.) والوطني للقلب والرئة والدم معهد (R01 HL136135، HL116217، P01 HL122173، وآسيا تحت 19 عاماً HL129902 إلى H.P.K.)، فضلا عن OD010425 P51 المعاهد الوطنية للصحة، وفي جزء آخر من خلال "مركز السرطان" المعاهد الوطنية للصحة/NCI، CA015704 P30 منحة الدعم. H.P.K. هو "محقق الطب الجزيئي ماركي" وتلقى الدعم كمستلم خوسيه كاريراس/هاء "دونال توماس هبت الرئيس" الافتتاحية لأبحاث السرطان ورئيسة وهبت القفص فريد للخلية والعلاج الجيني.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Stemspam SFEM II ("HSPC") MediaStemCell09655
Hank's Balanced Salt SolutionGibco14175095
Phosphate-Buffered SalineGibco14190-144
Penicillin/StreptomycinGibco15140-122
Dimethyl SulfoxideSigma AldrichD2650-100
100% EthanolDecon labsM18027161M
CyclosporineSigma30024-25MG
500 mM EDTAInvitrogen15575-038
Heat-Inactivated Fetal Bovine SerumSigma AldrichPS-0500-A
CH-296/ RetroNectin (2.5 mL, 1 µg/µL)TaKaRAT100B
Bovine Serum AlbuminSigmaA7906-100g
HEPESSigmaH9897
Rat anti-mouse IgM magnetic beadsMiltenyi Biotec130-047-301
Recombinant HumanStem Cell Factor (SCF)Peprotech300-07
Recombinant Human Thrombopoietin (TPO)Peprotech300-18
Recombinant Human FMS-like tyrosine kinase 3 (FLT-3)Peprotech300-19
Protamine sulfateSigmaP-4505
14 mL Polypropylene Round-Bottom TubeCorning352059
Colony Gel 1402ReachBio1402
QuadroMACS SeparatorsMiltenyi Biotec130-090-976
MACS L25 ColumnsMiltenyi biotec130-042-401
10 mM PGE2Cayman Chemical14753-5mg
TC-treated T-75 flasksBioexpressT-3001-2
Non-TC-treated T-75 flasksThermo-Fisher13680-57
20 mL syringesBD Biosciences302830
16.5 G needlesBD Precision305198
Syringe Tip CapBD Biosciences305819
QuickExtract DNA SolutionEpicentreQE09050
8-tube strip cap PCR TubesUSA scientific1402-2708
96-well ThermocyclerThermo-Fisher4375786
Pre-Separation filtersMiltenyi Biotec130-041-407
Strainer, Cell; BD Falcon; Sterile; Nylon mesh; Mesh size: 70um; Color: white; 50/CSfisher scientific352350
Ultracomp ebeadseBioscience01-2222-42
MACSmix Tube RotatorMiltenyi130-090-753
3 mL Luer-Lock SyringesThermo-Fisher14823435
35 mm x 10 mm cell culture dishCorning430165
60 mm x 15 mm cell culture dishCorning430196
150 mm x 25 mm cell culture dishCorning430599
Non TC treated flasksFalcon353133
Qiagen DNA extractionQiagen51104
PE Anti-Human CD90 (Thy1) Clone:5E10Biolegend328110
PE-CF594 Mouse Anti-Human CD34 Clone:563BD horizon562449
APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone: 5H9BD Pharmingen561212
V450 Mouse Anti-NHP CD45 Clone:d058-1283BD Biosciences561291
Autologous SerumCollected from autologous host and cryopreserved prior to mobilization and collection of CD34+ HSPCsN/ABeard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).
Virus-Conditioned Media (VCM)Kiem Lab, FHCRC Co-operative Center for Excellence in Hematology (CCEH)N/ABeard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).
Anti-CD34 antibody, Clone 12.8Kiem LabN/ABeard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).
Lenti F primer: AGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAIntegrated DNA TechnologiesN/APeterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).
Lenti R primer: TGCCTTGGTGGGTGCTACTCCTAAIntegrated DNA TechnologiesN/APeterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).
Actin F primer: TCCTGTGGCACTCACGAAACTIntegrated DNA TechnologiesN/APeterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).
Actin R primer: GAAGCATTTGCGGTGGACGATIntegrated DNA TechnologiesN/APeterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).

References

  1. Radtke, S., et al. A distinct hematopoietic stem cell population for rapid multilineage engraftment in nonhuman primates. Science Translational Medicine. 9 (414), (2017).
  2. Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L. Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood. Cell Stem Cell. 1 (6), 635-645 (2007).
  3. Notta, F., et al. Isolation of single human hematopoietic stem cells capable of long-term multilineage engraftment. Science. 333 (6039), 218-221 (2011).
  4. Hoggatt, J., et al. Rapid mobilization reveals a highly engraftable hematopoietic stem cell. Cell. 172 (1-2), 191-204 (2018).
  5. Chandrasekaran, D., Nakamoto, B., Watts, K. L., Kiem, H. P., Papayannopoulou, T. Modeling promising nonmyeloablative conditioning regimens in nonhuman primates. Human Gene Therapy. 25 (12), 1013-1022 (2014).
  6. Humbert, O., Peterson, C. W., Norgaard, Z. K., Radtke, S., Kiem, H. P. A nonhuman primate transplantation model to evaluate hematopoietic stem cell gene editing strategies for beta-hemoglobinopathies. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 8, 75-86 (2018).
  7. Peterson, C. W., et al. Differential impact of transplantation on peripheral and tissue-associated viral reservoirs: Implications for HIV gene therapy. PLoS Pathogens. 14 (4), e1006956-e1006956 (2018).
  8. Zhen, A., et al. Long-term persistence and function of hematopoietic stem cell-derived chimeric antigen receptor T cells in a nonhuman primate model of HIV/AIDS. PLoS Pathogens. 13 (12), e1006753 (2017).
  9. Moffett, H. F., et al. Hit-and-run programming of therapeutic cytoreagents using mRNA nanocarriers. Nature Communications. 8 (1), 389 (2017).
  10. Burtner, C. R., et al. Intravenous injection of a foamy virus vector to correct canine SCID-X1. Blood. 123 (23), 3578-3584 (2014).
  11. Evans, D. T., Silvestri, G. Nonhuman primate models in AIDS research. Current Opinion in HIV and AIDS. 8 (4), 255-261 (2013).
  12. Taraseviciute, A., et al. Chimeric antigen receptor T cell-mediated neurotoxicity in nonhuman primates. Cancer Discovery. 8 (6), 750-763 (2018).
  13. McGary, C. S., et al. CTLA-4(+)PD-1(-) memory CD4(+) T cells critically contribute to viral persistence in antiretroviral therapy-suppressed, SIV-infected rhesus macaques. Immunity. 47 (4), 776-788 (2017).
  14. Beard, B. C., Adair, J. E., Trobridge, G. D., Kiem, H. P. High-throughput genomic mapping of vector integration sites in gene therapy studies. Methods in Molecular Biology. 1185, 321-344 (2014).
  15. Zonari, E., et al. Efficient ex vivo engineering and expansion of highly purified human hematopoietic stem and progenitor cell populations for gene therapy. Stem Cell Reports. 8 (4), 977-990 (2017).
  16. Doulatov, S., et al. Revised map of the human progenitor hierarchy shows the origin of macrophages and dendritic cells in early lymphoid development. Nature Immunology. 11 (7), 585-593 (2010).
  17. Fares, I., et al. Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal. Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).
  18. Gori, J. L., et al. Endothelial cells promote expansion of long-term engrafting marrow hematopoietic stem and progenitor cells in primates. Stem Cells Translational Medicine. 6 (3), 864-876 (2017).
  19. Peterson, C. W., et al. Long-term multilineage engraftment of autologous genome-edited hematopoietic stem cells in nonhuman primates. Blood. 127 (20), 2416-2426 (2016).
  20. Peterson, C. W., et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 3, 16007 (2016).
  21. Thompson, A. A., et al. Gene therapy in patients with transfusion-dependent beta-thalassemia. The New England Journal of Medicine. 378 (16), 1479-1493 (2018).
  22. Eichler, F., et al. Hematopoietic stem-cell gene therapy for cerebral adrenoleukodystrophy. The New England Journal of Medicine. 377 (17), 1630-1638 (2017).
  23. Paul, B., et al. Efficient enrichment of gene-modified primary T cells via CCR5-targeted integration of mutant dihydrofolate reductase. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 5 (9), 347-357 (2018).
  24. Levine, B. L., Miskin, J., Wonnacott, K. Global manufacturing of CAR T cell therapy. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 4, 92-101 (2017).
  25. Masiuk, K. E., et al. Improving gene therapy efficiency through the enrichment of human hematopoietic stem cells. Molecular Therapy. 25 (9), 2163-2175 (2017).
  26. Trobridge, G. D., et al. Efficient transduction of pigtailed macaque hematopoietic repopulating cells with HIV-based lentiviral vectors. Blood. 111 (12), 5537-5543 (2008).
  27. Beard, B. C., et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354 (2010).
  28. Horn, P. A., et al. Efficient lentiviral gene transfer to canine repopulating cells using an overnight transduction protocol. Blood. 103 (10), 3710-3716 (2004).
  29. Adair, J. E., et al. Semi-automated closed system manufacturing of lentivirus gene-modified haematopoietic stem cells for gene therapy. Nature Communications. 7, 13173 (2016).
  30. Kutner, R. H., Zhang, X. Y., Reiser, J. Production, concentration and titration of pseudotyped HIV-1-based lentiviral vectors. Nature Protocols. 4 (4), 495-505 (2009).
  31. Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protocols in Human Genetics. 54 (1), (2007).
  32. Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. BMC Biotechnology. 6, 34 (2006).
  33. Kiem, H. P., et al. Improved gene transfer into baboon marrow repopulating cells using recombinant human fibronectin fragment CH-296 in combination with interleukin-6, stem cell factor, FLT-3 ligand, and megakaryocyte growth and development factor. Blood. 92 (6), 1878-1886 (1998).
  34. Morton, W. R., Knitter, G. H., Smith, P. M., Susor, T. G., Schmitt, K. Alternatives to chronic restraint of nonhuman primates. Journal of the American Veterinary Medical Association. 191 (10), 1282-1286 (1987).
  35. Noser, J. A., et al. Cyclosporine increases human immunodeficiency virus type 1 vector transduction of primary mouse cells. Journal of Virology. 80 (15), 7769-7774 (2006).
  36. Uchida, N., Hsieh, M. M., Washington, K. N., Tisdale, J. F. Efficient transduction of human hematopoietic repopulating cells with a chimeric HIV1-based vector including SIV capsid. Experimental Hematology. 41 (9), 779-788 (2013).
  37. Cornetta, K., Anderson, W. F. Protamine sulfate as an effective alternative to polybrene in retroviral-mediated gene-transfer: implications for human gene therapy. Journal of Virological Methods. 23 (2), 187-194 (1989).
  38. Goerner, M., et al. The use of granulocyte colony-stimulating factor during retroviral transduction on fibronectin fragment CH-296 enhances gene transfer into hematopoietic repopulating cells in dogs. Blood. 94 (7), 2287-2292 (1999).
  39. Dao, M. A., Hashino, K., Kato, I., Nolta, J. A. Adhesion to fibronectin maintains regenerative capacity during ex vivo culture and transduction of human hematopoietic stem and progenitor cells. Blood. 92 (12), 4612-4621 (1998).
  40. North, T. E., et al. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447 (7147), 1007-1011 (2007).
  41. Goessling, W., et al. Prostaglandin E2 enhances human cord blood stem cell xenotransplants and shows long-term safety in preclinical nonhuman primate transplant models. Cell Stem Cell. 8 (4), 445-458 (2011).
  42. Booth, C., Gaspar, H. B., Thrasher, A. J. Treating immunodeficiency through HSC gene therapy. Trends in Molecular Medicine. 22 (4), 317-327 (2016).
  43. Humbert, O., et al. Rapid immune reconstitution of SCID-X1 canines after G-CSF/AMD3100 mobilization and in vivo gene therapy. Blood Advances. 2 (9), 987-999 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

144

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved