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要約

このプロトコルの目標はヒト以外の霊長類 CD34 を分離、+細胞プライミング骨髄、レンチ ウイルスのベクトルでこれらの細胞の遺伝子変更および自己ホストの注入の製品を準備します。総プロトコルの長さは、約 48 時間です。

要約

造血幹・前駆細胞 (HSPC) 移植白血病の基礎療法とほぼ半世紀、他の癌にされている、ひと免疫不全ウイルス (HIV-1) 感染の唯一の既知の治療法の基礎となるの巨大な約束を示していますベータサラセミアなど遺伝性疾患の治療。当社グループは、同じ試薬と診療所に適用される技術の多くを最適化するために科学者を許可する (NHPs)、霊長類におけるモデル HSPC 遺伝子治療プロトコルを開発しました。ここで、CD34 を浄化するための方法を説明+ HSPCs と発動を促された骨髄 (BM) から長期保存する造血幹細胞 (HSC) サブセット。他の HSPC のソース (例えば、動員末梢血幹細胞 [PBSCs]) の浄化のため、同一の手法を採用できます。説明は 2 日間プロトコルは、細胞精製、培養、レンチ ウイルス (LV) と変更され自己ホストに注入のために準備です。成功のキー読み出し CD34 の純度は、+ HSPC 人口、精製 HSPCs の能力が半固体のメディア、そして最も重要なは、遺伝子改造効率形態的に異なるコロニーを形成します。HSPC 遺伝子治療する主な利点は、あらゆる造血細胞に上昇を与える寿命の長い細胞のソースを提供する機能です。など、これらのメソッドは、がん、遺伝性疾患、感染症のモデルの治療に使用されています。それぞれのケースで異なる HSPC の子孫、赤色の血液細胞、T 細胞、B 細胞および骨髄性のサブセットを含むの機能を高めることによって治療効果が確立されます。分離、方法の変更、および HSPC の準備の製品が直接適用で変換可能な人間の患者で複数の疾患。

概要

幹細胞遺伝子治療は、人間の病理学の広い範囲に対処する強力な手段です。HSPC 遺伝子療法は i) 比較的容易 ii) 細胞表面形質に関すると ex vivo 文化パラメーターが利用できますし、フィールドとして展開、知識豊富な患者からこれらの細胞を収集のための特に魅力的なアプローチiii) それは興味の様々 な疾患に合わせた遺伝子変更戦略の増えツールボックスと科学者を提示します。我々 は積極的に、HSPC 生物学、インビボ モデルで臨床、遺伝子組み換え HSPCs の生着と関連する患者への応用の基礎科学を含めて、複数の角度から HSPC 遺伝子治療の方法を調査しています。私たちと他の人が機能的に異なる HSPC サブセット1,2,3動員、HSPC 収量と最小限に抑えながら生着を最大限ご利用いただけますレジメンの細胞表面形質を特徴します。毒性4、5、および遺伝子変更と幅広い悪性、遺伝、および感染症6,7,8、調整されている遺伝子編集の戦略 9,10。機能と遺伝子組み換え HSPCs の生着は、小型と大型動物モデル、マウス、犬、NHPs など数で評価できます。特に、人間・ NHP 細胞 CD34 など CD90、HSPC セル表面蛋白質のために特定の抗体など多く試薬をどちらも使用できますので、NHP モデルも有利。さらに、マウスと対照をなして NHPs など大型の動物を許可する遺伝子の改変の規模の近い近似臨床に必要です。最後に、NHPs HIV-1 感染11など人間の病理学のモデリングのためのゴールド スタンダードは、抗がん剤の候補者と反 HIV 免疫療法12,13の新興国のモデル系。

このプロトコルの目的は、NHP HSPC 注入製品の準備浄化、遺伝子の変更、およびメソッドの概要を説明することです。このプロトコルの範囲外は、以前、これらの製品はすべて造血系統を生じ、疾患モデル1の広い範囲の治療効果を提供すること、自家 NHP ホストで接がを示しています。また接が HSPCs のクローナリティの特徴して動態、人身売買、および個々 の HSPCs と彼らの子孫、次移植1,14の表現型を追跡するためのプラットフォームを構築します。紹介した方法は、以下の目標に開発されている: 非常に純粋な HSPCs および長期接が HSC サブセット、ii) ex vivo 文化の中に原始的な造血を維持し、iii) 効率的に遺伝子変更いずれかの一括 HSPCs を分離するには i) または長期的な接が HSC のサブセット。蛍光活性化セル (FACS)、表現型/機能的異なる HSPC 集団、多くのグループ2,15の方法に一貫性のあるを分離するための並べ替えだけでなく、磁気援用細胞選別 (MAC) を用いてください。 16。文化の原始の HSCs のメンテナンス (すなわち、リンパ性と骨髄性のサブセットを区別を生じさせる完全にコミットの前駆細胞にこれらの細胞の分化を最小限に抑える) ここで説明したプロトコルの重要な一面です。我々 は以前、原始的な表現型17,18, ここでは、そのまま HSPCs を展開するアプローチを特徴とが最小限 (48 h) 経由で造血を維持することに焦点を当てて、ex vivo 文化定義プロトコルについて述べる。

HSPCs と HSC の効率的な変更のサブセットはこのプロトコルの中心的な目標。報告したいくつかのアプローチの中で 2 つは、これまでで最も研究の臨床試験: LV を介した遺伝子の改変及びヌクレアーゼを介した遺伝子1,6,19を編集します。遺伝子編集戦略は特に興味の対象となる遺伝子を変更するヌクレアーゼ プラットフォームの数は 1 つを使用して、たとえば、C-C ケモカイン受容体は、治療のための HIV 感染症7,19または Bcl11A 治療のため 5 (CCR5) を入力赤血球の溶血6。ここでは、LV を介した遺伝子の改変、ゲノム1,8,20にで semirandomly、トランスジェニック貨物統合に着目します。LV のアプローチの主な利点は、(最大 8 または 9 の kilobases) 遺伝物質の大量に配信する機能です。遺伝子編集戦略は、ドナー相同組換え (HDR) によってのみ指定した軌跡で統合する興味の遺伝子をターゲットに開発されている、これらのメソッド必要がありますさらに in vitro および小さい動物モデルの開発。対照的に、LV ベクトル広く使用されている NHPs と患者21,22。重要なは、使用する下塗り開始 HSPC ソースとして BM、ここでは、説明されたプロトコル容易かつ広範に適応できます、たとえば、PBSCs を分離します。前述のように、我々 を活用 NHPs と人間両方の種に適用される試薬を使用しての間の遺伝的類似性が高いです。最後に、このアプローチは、すなわち T 細胞12,23,24; 他の造血のサブセットを変更するのに適応されています。効果的な T 細胞免疫療法アプローチの出現は、このプロトコルで利用される同じ LV プラットフォーム上大きく頼っています。これらのメソッドは、HSPC 生物学または LV を介した遺伝子の改変に興味がある研究者に適しています。たとえば、HSPC 浄化のプロトコルがここで紹介される可能性があります小説 HSC 濃縮サブセットを特徴付ける1,15,25を前述のよう。同様に、ここで示される方法は同様に可能性があります LV 伝達に適用およびさらに多数の他のセルタイプおよび両方生体外でそして生体内でモデルの実験の質問のために開発します。

要約すると、隔離および遺伝子 NHP HSPCs を変更する方法を提案する.これらのメソッドは、他の種と HSPCs の他のソースのために容易に適応することができます。この徹底的に吟味プロトコルは、多くの人間の病気の効果的な治療法のモデル化の大きい約束を示します。

プロトコル

自家 NHP 移植、プライミング (動員)、細胞、遺伝子の改変のコレクションは、以前に公開されたプロトコル26と一致して実施しています。すべての実験プロシージャを見直し、機関動物ケアとフレッド ・ ハッチンソンがん研究センターとワシントン大学の利用委員会によって承認された (プロトコル #3235-01)。ケアと健康の国民の協会 (「ガイド」); の実験動物の使用のためのガイドの推奨事項に従い、行われているすべての研究動物は研究に無作為に割り当てられました。

1. CD34 の濃縮+ HSPCs と一晩かけて培養 (日-1)

  1. BM を収穫し、それを条件します。
    1. 顆粒球コロニー刺激因子 (GCSF) と 4 日間、26を前述の NHPs を動員します。
    2. ケタミンの 100 mg/kg と 0.03 mL/kg (0.5 mg/mL 在庫) におけるデクスメデトミジンの動物を落ち着いた。抽選の時に鎮痛剤 (例えば、ブプレノルフィン SR) を管理します。
    3. バリカンを使用すると、上腕骨の近位端から動物の毛を剃るや大腿骨を骨ごと、ヨウ素系のスクラブや似たような消毒液、アルコール、代替で肌をスクラブし 3 倍を繰り返します。追加の麻酔薬としてブピバカイン (5 mg/mL のストック サイトあたり 2 mg) と骨膜を吹き込みます。
    4. 骨膜のエントリ サイト (髄腔) に骨髄穿刺針 (16 G) を置き、回転運動を用いた髄腔を貫通、皮膚を貫通します。吸引針のスタイレットを削除し、さらに使用する滅菌フィールドで予約をして。
      注:筋肉でカバーされていないと、骨の形状/風景が骨部の髄腔に骨膜エントリ サイトを選択表示または (一般に向けて骨の近位または遠位端) の皮を通って容易に感じることができます。
    5. BM の針に抗凝固薬のクエン酸塩デキスト ロース溶液の混合物を含むプレフィルドシリンジを添付 (ACD A) やヘパリン (20 USP/mL、1 収集する骨髄の 9 mL あたり)。
    6. 軽く手足を揺動と回転、吸引と抗凝固剤を混ぜて注射器を扇動するために、プランジャーを引きます。針の回転し、吸引と撤退骨髄領域内のセルの大きな割合にアクセスするそれの位置を変更します。
    7. サンプルを収集した後、針を除去し、出血が止まるまで吸引サイトに圧力を適用します。
      注:必要なボリュームに応じて単一のコレクションの間に 1 つ (2 つの上腕骨、大腿骨 2) 4 つの手足から骨髄を描かれるかもしれません。20 mL 以上は、各肢から収集すべきし、回収量は計は動物の重量 (10 mL/kg) の 10% を構成する必要があります。
    8. 複数の手足から吸引を受信した場合、結合し、ボリュームを記録します。
    9. NHP 回復 postanesthesia をしましょう。
      1. プロシージャの実行後アチパメゾール 0.03 mL/kg (5 mg/mL ストック) とデクスメデトミジンの効果を逆に。鎮痛剤 (例えば、ブプレノルフィン SR) として定める手順の後またはそれ以上、少なくとも 48 時間の臨床獣医のスタッフ臨床獣医師の裁量に基づいて臨床兆候を提供します。
      2. プロシージャの後その家のケージに動物を返す、動物が独自座っていることができるまでそれに 15-20 分毎を監視します。吸引サイトが癒されることと判断されるまでの獣医のスタッフによって毎日動物を監視します。さらに、痛みや感染症、炎症の兆候を監視します。
    10. 細胞処理に並行して、破壊的全身照射 (TBI) と同じ NHP の条件: 1,020 cgy-ルンビア細胞注入前に、2 日間で分別された用量で cgy-ルンビア/分管理照射 7 の割合で。
  2. BM をメトします。
    1. 50 mL コニカル チューブ (10-12 mL チューブあたり) に BM を分割し、50 mL (表 1) にボリュームをもたらすため溶血性バッファーを追加します。分離がで 7 分間遠心分離機、800 x gで 5 分以内、pellet(s)、ボリューム/チューブの 2-5 mL を残してから上清を吸引するまでは、室温 (RT) で細胞を孵化させなさい。残留量でペレットを再懸濁します。
      注:正常に分離のサンプルは、透明な明るい赤、暗い赤から色を変更します。
    2. 溶血性バッファー/ペレットの 10-15 mL を追加します。70 μ m の細胞のストレーナーを使用して血の塊を削除します。溶血を追加 50 mL のバッファー、常温では、5 分間インキュベート、800 x gで 5 分で回転します。
    3. 上清を吸引し、10 mL の MAC バッファー (表 1) で細胞を再懸濁します。70 μ m 携帯こし器を通って再びフィルターします。チューブとフィルター 50 mL のバッファー 40 ml の MAC のそれをすすいでください。
  3. CD34 を豊かに+細胞の標準的なプロトコルを使用して溶血白血液細胞 (白血球) から。
    1. スピン 800 × gで 15 分間チェックでセル チューブ トップ/ミドルで明らかにセルまんじされてないかどうかを確認します。セルがペレット上存在するが 10 分程度、高速 (最大 1,000 x g最大) で再度回転します。
    2. 上清を吸引し、10 mL でそれを再懸濁します以下 MAC バッファー、正確なボリュームに注意します。診断または自動化された細胞カウンターを使用して、縮尺または 1: 100 希釈でセルをカウントします。
      注:この総白血球数は前濃縮カウントです。
    3. 1 x 10 の8セル/mL に細胞濃度をもたらす MAC バッファーを追加します。必要に応じて、まず手順 1.3.1 - 1.3.2 (例えばのために低い前濃縮カウント) を繰り返します。HSC のサブセット (前濃縮サンプル) を染色用 MAC バッファーの 5 x 10 の6セルをぜひご予約ください。
    4. 非抗 CD34 抗体 (クローン 12.8、材料表)27を 40 μ g/mL (1 x 108セル/mL) の最終的な集中に残りの前濃縮セルに追加します。4 ° C で回転させ管細胞懸濁液を孵化させなさい (材料表参照) 25-30 分のため。
    5. 50 mL にボリュームをもたらすと 800 x gで 5 分間でセルをスピンする MAC バッファーを使用、上清を吸引、MAC バッファー、および 800 x gで 5 分で再びスピンの 50 mL の細胞を再懸濁します。
    6. MAC バッファーと 2 つのドガ 100 mL チューブ、25-30 分のためのワックス ペーパーと空気吸入口をラップまたは使用する準備ができているまでいます。
    7. 必要な量の磁気ビーズを計算: ビーズ/109セルの 1 mL。上清を吸引し、ビーズを追加した後に 108セル/ml、細胞を再懸濁します。たとえば: 3 x 109セル + ビーズ + MAC 27 mL 3 mL バッファー容量 30 mL に。
    8. 4 ° C で 25-30 分の管回転細胞懸濁液を孵化させなさい。
    9. 中に磁石列を取得します。1 列につき 10 の9セル x 0.6 を使用する予定です。磁石の列を配置し、流れを収集するために各列の下 50 mL のコニカル チューブを配置します。15 mL の円錐管と、プランジャーの溶出 (ステップの各カラムを準備します。
    10. 1.3.8 の手順で孵化が完了したら、MAC バッファーを 50 mL に追加 800 x gで 5 分間吸引上澄みでスピンし、脱 MAC バッファー (1 列あたり 2 mL) で細胞を再懸濁します。気泡を導入することを避けるためにゆっくりピペット。
    11. 乾燥を実行する列をさせず、細胞懸濁液の 2 mL に続いて、各列に 1 mL の脱 MAC バッファーを追加します。フィルターと脱 MAC バッファーを持つ元管を洗い、ソリューション (6 mL/列) の列間で均等に分割7 mL の最終的な洗浄のための脱の MAC バッファーを追加します。
    12. 優しく磁石 (プッシュ トップ背面) から列をプルし、通過管に最後の点滴を収集します。5 mL の脱 MAC バッファーを各列に追加し、ステップ 1.3.9 から生殖不能の円錐管にセルを溶出するプランジャーを適用します。泡が表示された後は、任意の液体を収集しません。
  4. 濃縮と 1:10 の希釈倍率で (フィート) フロースルー コレクション チューブ内のセルをカウントします。氷の上の細胞を保ちます。CD34 濃縮率とフローサイトメトリーによる解析のためのフィートの一部分から 5 × 106セルから分注 1 x 10 の6セル。品質管理 (手順 2) が締結されるまでは、4 ° C で FT の分数を格納します。
    注:CD34 の数+ 、NHP の能生着成功は HSC 濃縮 cd34 陽性の頻度に依存して必要な細胞+CD90+CD45RA-のサブセット。平均周波数の 3%-5% と+CD90+CD45RA 122,000 CD34 の最低限の要件に基づいて体の 1 キログラムあたり-セルの重量1,6少なくとも 2.5 x 10 の合計を続行することを推奨、最大 10 × 10 です。6 cd34 陽性細胞+の体重の 1 キログラムあたり。
  5. MAC を追加CD34 にバッファー+濃縮率を合計で 50 mL、800 x gで 5 分で回転、上清を吸引、106セル/ml HSPC メディア (表 1) に細胞を再懸濁します。
    1. 106セル/mL、通気培養 (TC) の密度で細胞をプレート-T-75 フラスコ、フラスコ、あたり 10-20 mL を扱われ、37 ° C、5% CO2インキュベーターで一晩それらを孵化させなさい。(立ち上がらない) 縦のフラスコを置きます。
      注:必要な場合追加 CD34+セルまたは CD34-フィートを 90% 熱不活化ウシ胎児血清 (FBS) + 1 x 106 5 x 106セル/mL の濃度 10% ジメチルスルホキシド (DMSO) で凍結保存し、で緩速冷却できます80 ° C (凍結コンテナーの使用など)。凍結細胞の平均回復収量は CD34 に依存+純度と一般的範囲は 50% から 80% の生存率と > 80%。

2. 品質管理-豊かに cd34 陽性細胞 (日-1)

  1. フローサイトメトリー用サンプルを準備します。
    1. 上記の (前濃縮、FT、および CD34 濃縮分数) 10 x 106セル/mL の濃度で FACS バッファーの各分離段階から予約サンプルを再懸濁し、各細胞懸濁液 (表 1) の 100 μ L を FACS チューブに転送します。
      注:コントロールのサンプルは、前方散乱 (FSC)、側方散乱 (SSC)、自発蛍光の各チャンネルでの調整の各分離段階 (例えば、5 x 10 の5セル) から無染色の細胞を含める必要があります。さらに、各蛍光色素標識された抗体単一染色補正ビーズは隣接チャンネル (表 2および表 3) の間に補償を調整する必要があります。
    2. 1 つのテスト (100 μ L で 1 x 10 の6セル) のための製造元の指示に従って目的の抗体 (例えば、抗 CD45、抗 CD34、アンチ-CD45RA、アンチ CD90) を追加 (表 3)。4 ° C で 20 分間インキュベートします。800 x gで 5 分で FACS バッファーとスピンの 3 mL を追加し、上清を吸引、FACS バッファーの 100 μ L で再懸濁します、適切なフローサイト (手順 2.2) で分析します。
  2. 分析の流れの cytometer/セルソーターを準備します。
    注:    は 2.3 の手順で並べ替えセルに使用される同じマシン上で分析を実行するお勧めします。
    1. FSC/SSC、CD45/cd34 陽性 CD45RA/CD90 (3 つの流れのプロット) などのプロトコルを生成します。流れのプロットを右クリックし、人口階層レイアウトを追加します。
    2. FSC/SSC プロット上で左クリックして、多角形ゲート機能を選択し、破片や死んだ細胞を除外するゲートを描画します。新しいゲートをハイライトし、インスペクター ウィンドウに散布をするそれの名前を変更します。
      注:これは自動的に、P1 と呼ぶ。
    3. CD45/CD34 流プロットの中心を右クリックしの住民に移動し、散布図にプロットをゲートします。除外非 cd34 陽性細胞とよくとして残存血小板と赤血球の nonhematopoietic 細胞に細胞の+ CD45intCD34 周り長方形ゲート描画 (CD45-)。門の名前を変更CD34+。
    4. CD34 の CD45RA/CD90 流プロットをゲート+の人口。CD90 の周りの 3 つの独立した subgates を描く+CD45RA-細胞 (造血の濃縮)、CD90-CD45RA-細胞 (多能性とエリスロ骨髄前駆細胞 [疎/EMPs] 濃縮) と CD90-CD45RA+細胞 (リンパ骨髄系前駆細胞 [LMPs] 濃縮)。LMP、 MPP EMP、 HSCの門の名前を変更します。
    5. 完了したら、人口階層に次の順序で階層的に整頓されていた 6 つのエントリが含まれていることを確認: 1) すべてのイベント。2) 散布。3) CD34+;4) HSC;5) MPP EMP;6) LMP。流れのプロットとゲートの形状が図 4に示すように見えることを確認します。
    6. 無染色の前濃縮白血球 FSC、SSC、すべて蛍光チャンネル (表 2サンプル 5) に電圧を調整するを実行します。隣接チャンネル (表 2サンプル 1-4) の間に補正を調整する単一染色補正ビーズを実行します。残りのすべての実行無染色し、調整後の試料を染色、CD34 濃縮効率 (表 2、サンプル 6-9) を文書化するプロトコルを補償。
      注:最終的なサンプル (表 2、サンプル 10) 同時フロー解析と細胞 2.4 の段階で選別をしてください。
  3. コロニー形成細胞 (CFC) の試金に CD34 サブセットの並べ替え浄化のためセルソーターを構成します。
    注:    解析 (ステップ 2.2) セルソーター 2.2.5 2.2.1 - の手順で前述のようにプロトコルを設定する別のマシンが使用されているかどうか。
    1. フロン媒体を含んでいる 15 mL チューブに細胞を入金する細胞選別機ソフトウェアの左側と右側にストリームの角度/電圧を調整します。ズレを防止するサイド ストリームの角度を設定します。非常にいくつかのセルが並び替えられるために並べ替えられた細胞ヒット フロン媒体および管の側ではないまでステップごと、偏向側ストリームの角度を微調整します。
    2. ブラウザーでグローバル ワークシート フォルダーを開き、ブラウザー ウィンドウの上部のメニューのボタンを使って新しい並べ替えレイアウトを作成します。2 チューブにコレクション デバイスのドロップダウン メニューのエントリ、 4 ウェイ純度または単一のセルに精度のドロップダウン メニューのエントリを変更し、対象イベントを 800-1,200 セルに設定します。並べ替え場所] フィールド (左または右) をクリックしてください、メニューで、エントリを追加を選択し、メニューからソートする人口を選択します。
  4. CFC アッセイ用セルを並べ替えます。
    注:     CFC アッセイは CD34 濃縮製品 (表 2、サンプル 10) から細胞にのみ実行の並べ替え。
    1. 読み込みのサンプル 10、2,000-3,000 イベントを記録および信号強度とターゲット集団に合わせて並べ替えゲートを微調整します。
    2. セットアップが完了したら、セル (表 2、サンプル 10) を取得します。2.2.3 の手順で説明されているようにデータを取得、500-1,000 セル/秒、流量を調整、i) の散布のゲート、ii) CD34 から 800 1,200 セルを並べ替え+ v) フロンの 3.6 mL を含む個別のチューブに LMP ゲート iv) MPP EMP ゲート、iii) HSC 門ゲート メディア。
      注:CFC アッセイの並べ替えは、CD34 濃縮製品 (表 3、サンプル 10) からの細胞でのみ実行します。散布図および cd34 陽性細胞+ HSCs、MPP EMPs、および LMPs は、左と右のチューブ ホルダーの位置に同時に分類できるに対し、個別にゲートを並べ替える必要があります。
    3. 渦および各 3 × 3.5 cm の滅菌、nontissue、文化扱われるペトリ皿に細胞懸濁液の 1 mL を分注します。(例えば、15 cm シャーレ) セカンダリ コンテナーに 10 ~ 14 日 37 ° C でセルを孵化させなさい。
    4. 日 10-11 postplating、植民地形態に基づく条件につきすべての 3枚のプレートから個々 のコロニーをカウントします。

3 CD34 の遺伝子の改変+ HSPCs と一晩回復 (0 日)

  1. 50 μ g/ml (HBSS、参照テーブルの材料) ハンクのバランスの取れた塩溶液 50 mL に 1 μ g/μ L CH 296 溶液 2.5 mL を希釈します。
  2. LV 伝達のフラスコを準備します。
    1. Nontissue 文化 (非 TC) のおおよその数を決定する-(通常から 1.4 の手順で決定される細胞数) 必要なフラスコを扱われます。プレートに T-75 フラスコあたりのメディアの 10 mL で 1 x 10 の7セル計画 (1 x 10 の8の合計セル 10 フラスコが必要と思います) 1 つの無処理 TC 12 ウェル プレート (モック伝達条件) を含めると。2 μ g/cm2の濃度で各フラスコ/プレート、ステップ 3.1 から滅菌 HBSS と 50 μ g/mL CH 296 株式を追加します。T-75 フラスコ 50 HBSS; μ g/mL CH 296 + 7 mL を 3 mL を使用します。12 ウェル プレートのウェルあたり HBSS の 50 μ g/mL CH 296 + 340 μ の 160 μ L を使用します。
    2. クリーン ベンチ、2 h. 吸引チャンネル 296 のためのフードに RT で邪魔されずに座ると滅菌 HBSS + 2% ウシ血清アルブミン (BSA) のようなボリュームに置き換えます料理を許可します。室温で 30 分間インキュベート、HBSS/BSA を吸引、2.5% を含む滅菌 HBSS の似たようなボリュームで皿を洗う 1 M HEPES、pH 7.0。セル (ステップ 3.4) をめっきする前にすぐに吸引します。
      注:3.2.2 のステップ、次に乾くプレート/フラスコを許可しません。滅菌 HBSS + 2.5% を含んでいる版 1 M HEPES が一晩の 4 ° C で開催された (すなわち,日目-1 準備)。
  3. 収穫し、CD34 を変換日-1 から+の細胞します。
    1. 10 mL のピペットを使用して、滅菌 HBSS で各培養用フラスコの繰り返し、穏やかな洗浄によって緩く付着性のセルをすすいでください。すべてのセルが切断されることを確認してください (必要に応じて、タップ/平手打ちセルを緩めるフラスコ)。
    2. 800 x gで 5 分で細胞を遠心、上清を吸引、1 x 106セル/mL の濃度に伝達メディアで細胞を再懸濁します。収集されたすべてのセル、一度検定または自動化された細胞カウンターを使用して、セルの数を決定します。
    3. (モック導入コントロールのサンプル) の CH 296 コート 12 ウェル プレートのウェル 1 個に 1 mL の細胞懸濁液 (1 x 10 の6セル) を追加します。分割 T-75 フラスコ (ステップ 3.2.2) では, 細胞の残りの部分は、フラスコあたり約 10 mL (1 x 10 の7セル) を追加します。ベント キャップが 37 ° C で培養、30 分間 5% CO2 CH 296 塗装に付着する細胞を許可します。
    4. ウイルス付きのメディア (VCM、材料表) を解凍し、ミリリットル (IU/mL)28,29,30,31,32 単位の感染価を決定します。.3.3.3 のステップから各 T-75 フラスコに VCM の適切なボリュームを追加し、37 ° c、5% CO2細胞をインキュベートします。
      注:単一伝達を実行している場合は一晩インキュベートします。二重伝達を実行すると、この stepapproximately を繰り返します 6 - 8 洗浄/復旧なし最初の伝達後 h 相し、一晩インキュベートし。たとえば、10 の感染 (MOI) の必要な多重度 1 フラスコ (1 x 10 の7セル)、1 x 108 IU/mL にウイルス価の 1 mL を追加します。

4. 細胞収穫および注入 (1 日目) のための準備

  1. セルを収穫します。
    1. 3.3.2 3.3.1 - の手順で説明するよう、導入された模擬細胞を収集します。HBSS の細胞と円錐管に洗浄を転送する 10 mL で順次洗浄を実行します。すべてのセルをタップ/叩き、フラスコに応じて、フラスコから削除されていることを確認します。
    2. 800 x gで 5 分で細胞懸濁液を遠心、上清を吸引、HBSS の 1 mL にペレットを再懸濁します。同じ条件のセルを含んでいる管を組み合わせます。各 10 ml HBSS のリンス、細胞懸濁液に加えます。診断を使用してセルの数を確認します。HBSS で 800 x gで 5 分間遠心 50 mL に合計のセル容量をもたらします。
  2. パルス プロスタグランジン E2 (PGE2) と輸液製品の試薬を準備します。
    1. 上清を吸引し、HSPC メディアのサイトカインなし 5 × 106/mL に (ない模擬) 導入された細胞を再懸濁します。10 mM PGE2 を加える最終濃度 10 μ m ゆっくり旋回して 30 分毎に 2 時間、氷の上のセルを孵化させなさい。
    2. 4.2.1 のステップ中に自家血清 (資材表) を熱不活化、ワックス ペーパーでコンテナーをラップし、56 ° C で 30 分間のインキュベーションこと HBSS (500 μ L 熱非動化血清の + HBSS の 24.5 mL)、ミックスで 2% 自家血清を準備し、氷の上使用するまで混合物を格納します。また、ステップ 4.2.1 の間に上下に積極的に細胞をピペットで 12 ウェル プレートでモック導入細胞を収穫します。15 mL コニカル チューブに細胞懸濁液を追加、洗って HBSS、1 mL で 3 x と同じ 15 mL の円錐管に洗浄を追加。
    3. PGE2 孵化の 2 h は後、洗浄セル 2 x 800 x gで 5 分でそれらを遠心分離し、上清を廃棄します。第 2 洗浄後再懸濁します HBSS の適切なボリュームのセルのカウント、診断または自動化された細胞カウンターを使用して。
      注:細胞は、PGE2 パルスを入力すると、信頼性の低い細胞数を補うことができる後よく塊します。もしそうなら、4.1.2 の手順から細胞数の 4.2.3 のステップから代わりに使用します。
  3. 輸液製品の品質管理 (手順 5) のモックと導入された細胞を予約: 5 x 105 1 × 106セル流れ cytometry/セルの並べ替え (手順 5.1 および 5.3) と約 1 × 10 の液体培養 (ステップ 5.2) の6セルとコロニーのポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) (ステップ 5.4)。
  4. 輸液製品を準備します。
    1. 導入された細胞の残りの部分は、第 3 洗浄 HBSS の 50 mL で、上清を吸引を行い HBSS + 2% 自家血清 (4.2.2 の手順で準備) の 10 mL の細胞を再懸濁します。16.5 G 針装備 20 mL シリンジに 10 mL の溶液を描画します。HBSS + 2% 自動血清 10 ml チューブを洗浄し、同じシリンジ 20 mL に合計ボリュームをもたらすために洗浄を描画します。ニードル キャップ キャップ、シリンジ、注射器のラベル、トランスポート/注入のための氷の上に置きます。
    2. 経由で中心静脈カテーテル33,34の認定動物研究施設内にある自己のホストに導入された細胞製品を吹き込みます。移植の動物の完全な血球数 (Cbc) および血液化学を監視し、プロジェクト1,6,19に合わせた研究固有遺伝子マーキングの試金を実行します。

5. 品質管理

注:フローサイトメトリーし、細胞選別、セルは、4.4.2 のステップで説明されているフォロー アップの一環として、動物に注入されている後実行されます。流れフローサイトメトリーによるデータ移植後すぐに注入製品 (手順 5.1 および 5.3) で定義された表現型の幹・前駆細胞のサブセットの組成を決定するために使用、フロンの分析を試金に対し実行 12-14 日コロニー PCR (ステップ 5.4) による遺伝子の改変の効率を決定するための postinfusion。

  1. フローサイトメトリーとフロンが注入製品の並べ替えを実行します。
    1. フローサイトメトリーによる細胞を分析し、セクション 2 の説明に従って並べ替え浄化 CFC アッセイの CD34 サブセット。モックと導入された cd34 陽性細胞 (PGE2 パルスの後注入製品) から種フロンの試金します。
    2. 条件と渦、プレート、文化、あたり 800 セルの最大を並べ替え、CFC アッセイ ステップ 2.4 で説明されているようにカウントします。カウント後コロニー PCR ステップ 5.4 で説明したように実行する CFC アッセイから植民地を選ぶ。
  2. 液体培養
    1. TC-無処理板で 1 x 106/mL で HSPC メディアで液体培養の細胞。2、5、および 12 日 posttransduction 収穫し、フローサイトメトリー用セルをカウントします。CFC アッセイ用細胞は必要ありません。
    2. 2 と 5 の日に新鮮な HSPC メディア 1 x 106/mL でのセルの 33% を replate します。量的なリアルタイム PCR の DNA 抽出バッファー内セルの 33% を確定します。手順 2.1 および 2.2 でフローサイトメトリー用セルの 33% を使用します。
    3. 造血の子孫の表現型の構成を分析するのにステップ 5.2.2 からこれらのデータを使用します。2.2.2 各サンプル内のステップで説明したように CD34 陽性細胞の表現型に定義されたサブセット頻度を決定します。CD34 の組成を比較+細胞遺伝子の改変の影響を決定するための条件の間。
      注:CD34+細胞必要があります全体の文化を通して表現を維持し、すべての表現型のサブセットを含みます。CD90 の損失+CD45RA-セルまたは表現型のサブセットの overrepresentation 遺伝子の改変、間接または直接効果を示すことができます。
  3. フローサイトメトリーによる (オプションと実験のセットアップに応じて)、手順 2.2 からプロトコルの適応 (例えば.、緑色蛍光タンパク質 [GFP]) 遺伝子発現を定量化します。
    1. SSC/transgene を示す 3 つの流れのプロットを追加 (例えば、SSC/GFP)。各遺伝子対(例えば、GFP) HSCs、疎-EMPs の 2 番目、LMPs。 プロット 3 の最初のプロットをゲート、ゲートそれぞれ HSC GFP+、MPP EMP GFP+、LMP GFP+をという名前を作成します。
    2. 人口階層次の順序で階層的に整頓されていた 9 つのエントリを含める必要が完了したら、: 1) すべてのイベント。2) 散布。3) CD34+;4) HSC;5) HSC GFP+;6) MPP EMP;7) MPP-EMP GFP+;8) LMP;9) LMP-GFP+。
      注:液体培養後任意の遺伝子発現 (例えば、5 と 12 日) ステップ 5.4 でのコロニー PCR による決定遺伝子変更効率をより反映しました。液体文化で以前の時点を遺伝子発現、未統合 LVs による過大評価します。同様に、1 日目に CFC アッセイの GFP+細胞の流れの並べ替えは、多くの偽肯定的なコロニーになります。
  4. コロニー PCR を実行します。
    1. 2.4.4、5.1.1 の手順で数え、50 μ L の DNA 抽出バッファーにシングル コロニーをピックアップ, 10 μ L または 20 μ L を使用して、ピペット、ピペット 8 チューブ PCR の管に植民地を転送するために、上下ストリップはキャップ。モックの状態から 8 植民地と 88 コロニー 1 つ完全 96 ウェル プレートを生成する導入された条件から選択します。各ウェルに 50 μ L の DNA 抽出バッファーを追加します。
    2. たちと次のプログラムを使用して、植民地からの DNA の抽出: 65 ° C/20 分、99 ° C/10 分、および保持 4 ° C。DNA を最適な品質、できるだけ早く-20 ° C に移動する予定です。
    3. コロニー PCR アクチン F ・ R とコントロールのプライマー (資材表) を使用して、合計の植民地に遺伝子導入 F ・ R プライマーを使用して LV+コロニーの数を比較すると、LV 導入細胞を定量化するを実行します。

結果

上記プロトコルを特定し遺伝子変更 NHP CD34 です+ HSPCs は、その後自己ホスト (図 1および図 2) に注入が可能です。このプロトコルに従うと、我々 通常最大 8 x 109総白血球はピグテール ニホンザルからプライム BM から入手し、時に、アカゲザルからその量を倍増します。両方の種、cd34 陽性数+を豊か...

ディスカッション

LV ベクトル工学は遺伝子は CD34 など細胞の種類を変更する最も特徴付けられるメソッド+ HSPCs、その後移植生体内で。ここで説明されているプロトコルは、体内では、長期的な永続化遺伝子の HSPCs の数を最大化し、様々 な悪性、感染症、遺伝的疾患を持つ患者に臨床上の利益を提供する設計されています。遺伝子編集戦略は、過去 10 年間に浮上して、LV 変更セルが最高の in vitro、動?...

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

著者は、ヘレン ・ クロフォードがこの原稿、グラフィック デザインのためのジム Woolace とベロニカ ネルソン & Devikha チャンドラセ カラン プロトコルの開発に参加するための準備をありがちましょう。このプロトコルの開発は、NIH アレルギー研究所と感染症 (R01 AI135953 と H.P.K. を AI138329) と国立心臓、肺、血液研究所 (R01 HL136135、HL116217、P01 HL122173、U19 からの補助金によって支えられました。H.P.K. に HL129902)、NIH P51 OD010425 の一部と、NIH/NCI 癌センター、サポート助成金 P30 CA015704。H.P.K. はマーキー分子医学の調査官、細胞・遺伝子治療がん研究とフレッドのハッチ寄附のホセ ・ カレーラス/E. ドナル ・ トーマス寄付研究部門の就任の受け手としてサポートを受け取った。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Stemspam SFEM II ("HSPC") MediaStemCell09655
Hank's Balanced Salt SolutionGibco14175095
Phosphate-Buffered SalineGibco14190-144
Penicillin/StreptomycinGibco15140-122
Dimethyl SulfoxideSigma AldrichD2650-100
100% EthanolDecon labsM18027161M
CyclosporineSigma30024-25MG
500 mM EDTAInvitrogen15575-038
Heat-Inactivated Fetal Bovine SerumSigma AldrichPS-0500-A
CH-296/ RetroNectin (2.5 mL, 1 µg/µL)TaKaRAT100B
Bovine Serum AlbuminSigmaA7906-100g
HEPESSigmaH9897
Rat anti-mouse IgM magnetic beadsMiltenyi Biotec130-047-301
Recombinant HumanStem Cell Factor (SCF)Peprotech300-07
Recombinant Human Thrombopoietin (TPO)Peprotech300-18
Recombinant Human FMS-like tyrosine kinase 3 (FLT-3)Peprotech300-19
Protamine sulfateSigmaP-4505
14 mL Polypropylene Round-Bottom TubeCorning352059
Colony Gel 1402ReachBio1402
QuadroMACS SeparatorsMiltenyi Biotec130-090-976
MACS L25 ColumnsMiltenyi biotec130-042-401
10 mM PGE2Cayman Chemical14753-5mg
TC-treated T-75 flasksBioexpressT-3001-2
Non-TC-treated T-75 flasksThermo-Fisher13680-57
20 mL syringesBD Biosciences302830
16.5 G needlesBD Precision305198
Syringe Tip CapBD Biosciences305819
QuickExtract DNA SolutionEpicentreQE09050
8-tube strip cap PCR TubesUSA scientific1402-2708
96-well ThermocyclerThermo-Fisher4375786
Pre-Separation filtersMiltenyi Biotec130-041-407
Strainer, Cell; BD Falcon; Sterile; Nylon mesh; Mesh size: 70um; Color: white; 50/CSfisher scientific352350
Ultracomp ebeadseBioscience01-2222-42
MACSmix Tube RotatorMiltenyi130-090-753
3 mL Luer-Lock SyringesThermo-Fisher14823435
35 mm x 10 mm cell culture dishCorning430165
60 mm x 15 mm cell culture dishCorning430196
150 mm x 25 mm cell culture dishCorning430599
Non TC treated flasksFalcon353133
Qiagen DNA extractionQiagen51104
PE Anti-Human CD90 (Thy1) Clone:5E10Biolegend328110
PE-CF594 Mouse Anti-Human CD34 Clone:563BD horizon562449
APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone: 5H9BD Pharmingen561212
V450 Mouse Anti-NHP CD45 Clone:d058-1283BD Biosciences561291
Autologous SerumCollected from autologous host and cryopreserved prior to mobilization and collection of CD34+ HSPCsN/ABeard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).
Virus-Conditioned Media (VCM)Kiem Lab, FHCRC Co-operative Center for Excellence in Hematology (CCEH)N/ABeard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).
Anti-CD34 antibody, Clone 12.8Kiem LabN/ABeard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).
Lenti F primer: AGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAIntegrated DNA TechnologiesN/APeterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).
Lenti R primer: TGCCTTGGTGGGTGCTACTCCTAAIntegrated DNA TechnologiesN/APeterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).
Actin F primer: TCCTGTGGCACTCACGAAACTIntegrated DNA TechnologiesN/APeterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).
Actin R primer: GAAGCATTTGCGGTGGACGATIntegrated DNA TechnologiesN/APeterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).

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