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요약

이 프로토콜의 목표 nonhuman 영장류 CD34 분리 하는+ 세포 액된 골, 유전자-수정 lentiviral 벡터와이 셀 하 고 주입 헌 호스트에 대 한 제품을 준비에서. 총 프로토콜 길이 약 48 h입니다.

초록

조 혈 줄기와 조상 세포 (HSPC) 이식 백혈병에 대 한 초석 치료와 거의 반세기 동안 다른 암, 인간 면역 결핍 바이러스 (hiv-1) 감염의 유일한 알려진된 치료의 기초가 되었으며에 엄청난 약속을 보여줍니다. 베타 thalassemia 같은 유전 질환의 치료. 우리의 그룹 많은 같은 시 약 및 병원에 적용 되는 기술을 최적화 하는 과학자를 허용 nonhuman 영장류 (NHPs)에 모델 HSPC 유전자 치료 프로토콜을 개발 했습니다. 여기, 우리는 CD34 정화 방법 설명+ HSPCs 및 장기적인 유지 액된 골 (BM)에서 조 혈 줄기 세포 (HSC) 하위 집합. 다른 HSPC 소스 (예: 동원된 주변 혈액 줄기 세포 [PBSCs])의 정화에 대 한 동일한 기법을 사용할 수 있습니다. 설명 하는 것은 2 일 프로토콜 있는 셀은 정화, 교양, lentivirus (LV), 수정 및 헌 호스트에 다시 주입에 대 한 준비. 성공의 주요 정보는 CD34의 순도 포함+ HSPC 인구, 반 고체 미디어, 그리고 가장 중요 한 것은, 진 수정 효율에 형태학 상으로 다른 식민지를 형성 하는 순화 된 HSPCs의 기능. HSPC 유전자 치료의 주요 장점은 모든 조 혈 세포 종류를 수명이 긴 세포의 소스를 제공 하는 기능입니다. 따라서, 이러한 방법은 암, 유전 질환 및 전염 성 질환에 대 한 모델 치료에 사용 되었습니다. 각각의 경우에서 치료 효능 붉은 혈액 세포, T 세포, B 세포, 및 골수성 하위 집합을 포함 하 여 고유 HSPC 자손의 기능을 강화 하 여 설정 됩니다. 를 분리 하는 방법을 수정 하 고 준비 HSPC 제품은 직접 적용 및 번역 인간 환자에서 여러 질병에.

서문

줄기 세포 유전자 치료 인간 병 리의 넓은 범위를 해결 하는 강력한 수단 이다. HSPC 유전자 치료는 특히 매력적인 접근 이다, i) 상대적으로 완화의 환자에서 이러한 셀을 수집 ii) 사용할 수 셀 표면 고기 및 ex vivo 문화 매개 변수 이며, 필드와 확장, 지식 재산 때문 때문에 iii) 과학자 들은 유전자 수정 전략 관심의 다양 한 질병에 맞게 늘어나는 도구 상자와 함께 제공. 우리는 적극적으로 HSPC 생물학, 유전자 수정 HSPCs 전 임상 생체 조건 모델에서의 engraftment 및 관련 환자 인구를 응용 프로그램의 기초 과학을 포함 하 여 여러 각도에서 HSPC 유전자 치료 접근을 조사 하고있다. 우리와 다른 기능적으로 뚜렷한 HSPC 하위 집합1,2,3, 동원 및 컨디셔닝 regimens HSPC 수율 및 최소화 하면서 engraftment를 극대화 하는 세포 표면 표현 형 특징 있다 독성4,5, 그리고 유전자 수정 및 다양 한 악성, 유전, 그리고 전염병6,7,8,를 맞게 되었습니다 유전자 편집 전략 9,10. 쥐, 개, NHPs를 포함 한 작은 큰-동물 모델의 여러에서 기능과 유전자 수정 HSPCs의 engraftment를 평가할 수 있습니다. 특히, NHP 모델은 많은 시 약, 예를 들어 CD34 CD90, 같은 HSPC 세포 표면 단백질을 위한 특정 항 체를 번갈아 인간과 NHP 셀에 사용할 수 있기 때문에 유리. 또한, 마우스, 달리 NHPs 같은 큰 동물 허용 가까이 근사 유전자 수정의 규모의 임상 효능에 필요한. 마지막으로, NHPs 에이즈-1 감염11 같은 인간의 병 리 모델링에 대 한 황금 표준 고 후보 항 암 및 항 HIV immunotherapies12,13신흥 모델 시스템입니다.

이 프로토콜의 목적은 NHP HSPC 주입 제품 준비 및 정화, 유전자 수정 방법 개요입니다. 이 프로토콜의 범위 밖에 서 우리는 이전에 표시 있지만 이러한 제품 헌 NHP 호스트에서 engraft 모든 조 혈 계보, 하 고 질병 모델1의 광범위 한 범위에서 치료 효능을 제공 합니다. 우리 또한 engrafting HSPCs의 clonality를 특징 하 고 속도 론, 매매, 및 개별 HSPCs 및 그들의 자손, 다음 헌 이식1,14형 추적 플랫폼을 구축. 여기에 제시 된 방법은 다음과 같은 목표와 함께 개발 되었습니다: i)를 매우 순수한 HSPCs 장기 engrafting HSC 하위 집합, ii) 게 유지와 ex vivo 문화, 동안 원시 HSCs iii)를 효율적으로 유전자-수정 중 대량 HSPCs 격리 또는 장기 HSC 하위 집합 engrafting 형광 활성화 된 세포 (FACS), 격리 phenotypically/기능적으로 뚜렷한 HSPC 인구, 많은 그룹2,15의 방법으로 일관 된 정렬 뿐만 아니라 자기 기반 셀 정렬 (맥)을 고용 16. 문화에 기본 HSCs의 유지 보수 (즉, 림프 및 골수성 하위 집합을 분화 완전 하 일으키 다하고 창시자로이 세포의 분화를 최소화) 여기에 설명 된 프로토콜의 필수적인 일 면 이다. 비록 우리는 원시적인 형17,18, 여기, 유지 하면서 HSPCs를 확장 하는 접근을 특징 이전는 최소한의 (48 h) 통해 HSCs를 유지에 초점을 맞추고와 ex vivo 문화 정의 하는 프로토콜을 설명 합니다.

HSPCs 및 HSC의 효율적인 수정 하위 집합이이 프로토콜의 중앙 목표 이다. 몇 가지 방법을 우리는 보고, 중 2 개는 지금까지 가장 조사에서 임상 시험: LV 중재 유전자 수정 및 편집1,,619nuclease 중재 하는 유전자. 유전자 편집 전략 특히 관심의 대상된 유전자 수정 nuclease 플랫폼의 수 중 하나를 사용, 예를 들어 C C chemokine 수용 체 타입-5 (CCR5) 치료에 대 한 HIV 감염7,19 또는 Bcl11A의 치료에 대 한 hemoglobinopathies6의. 여기, 우리는 유전자 변형 화물 통합 semirandomly 게놈1,,820LV 중재 유전자 수정에 집중 한다. LV 방식의 주요 장점은 (최대 8 또는 9 kilobases) 유전 물질의 대용량을 제공 하는 능력입니다. 유전자 편집 전략 transgene 지정 된 장소에만 통합 하는 관심의 대상으로 동종 기증자 재결합 (HDR)에 의해 개발 되고있다, 하지만 이러한 방법을 더 생체 외에서 그리고 작은 동물 모델 개발이 필요 합니다. 대조적으로, LV 벡터 사용 되었습니다 광범위 하 게 NHPs와 환자21,22. 중요 한 것은, 사용 하는 시작 HSPC 소스로 BM 액, 여기에 설명 된 프로토콜 적응 수 있다 수 쉽고 광범위 하 게, 예를 들어 PBSCs을. 위에서 설명한 대로 우리 두 종에 적용 되는 시 약을 사용 하 여 NHPs와 인간 사이의 유전적 유사성의 높은 학위의 활용. 마지막으로,이 이렇게 맞게 조정 되었습니다 다른 조 혈 하위 집합, 즉 T 세포12,,2324; 수정 하 효과 T 세포 immunotherapy 접근의 출현이이 프로토콜에서 동일한 LV 플랫폼 무 겁 게 의존 하고있다. 이러한 메서드는 모든 연구원 HSPC 생물학 또는 LV 중재 유전자 수정에 적합 합니다. 여기에 제시 된 HSPC 정화 프로토콜 소설 HSC 농축 하위 집합의 특성을 사용 하는 수 예를 들어 앞에서 설명한1,,1525. 마찬가지로, 여기에 제시 하는 방법 수 마찬가지로 LV 변환 적용 되며 다른 수많은 세포 유형 및 실험적인 질문, 둘 다 생체 외에서 그리고 vivo에서 모델에 대 한 개발.

요약 하자면, 우리는 분리 및 유전자 NHP HSPCs를 수정 하는 방법을 제시. 이러한 메서드는 다른 종 및 HSPCs의 다른 소스에 쉽게 적용할 수 있습니다. 이 철저 하 게 검증 된 프로토콜 수많은 인간의 질병에 대 한 효과가 치료의 모델링에 큰 약속을 보여줍니다.

프로토콜

헌 NHP 이식, 못쓰게 (동원), 셀, 및 유전자 수정 컬렉션 이전 게시 프로토콜26일치 실시 합니다. 모든 실험 절차 검토 및 승인 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 프레드 허 친 슨 암 연구 센터와 워싱턴 대학 (프로토콜 #3235-01). 모든 연구는 관심과 건강의 국가 학회 ("가이드");의 실험 동물의 사용에 대 한 가이드의 권장에 따라 실시 동물 연구에 무작위로 지정 되었다.

1. 농축 CD34의+ HSPCs와 야간 문화 (주-1)

  1. BM을 수확 하 고 그것을 조건.
    1. 앞에서 설명한264 일간 granulocyte 콜로 니 자극 인자 (GCSF) NHPs를 동원.
    2. 100 mg/kg의 마 취 제와 0.03 mL/kg dexmedetomidine (재고 0.5 mg/mL)의 동물 진정 무승부 시 진통제 (예, Buprenorphine SR)을 관리 합니다.
    3. 클리퍼 스에 사용 하 여, 상 완 골의 근 위 끝에서 동물의 머리를 면도 또는 대 퇴 골 bone(s) 및 요오드 기반 스크럽 또는 유사한 살 균 솔루션, 알코올, 대체 피부 스크럽 3 x 반복. 추가 마 취로는 bupivacaine (사이트, 5 mg/mL 주식 당 2 밀리 그램)을 달 이다.
    4. Periosteal 항목 사이트 (골 수 구멍)를 통해 골 수 포부 바늘 (16 G)을 회전 모션을 사용 하 여 골 수 구멍 관통 피부 피어스. 바늘 포부의 stylet을 제거 하 고 추가 사용에 대 한 살 균 분야에서 예약.
      참고: 뼈는 근육에 의해 포함 되지 않는 중 뼈의 모양/조 경이의 영역에서 골 수 구멍에 periosteal 항목 사이트 선택 표시 또는 (일반적으로 뼈의 인접 또는 원심 끝)으로 피부를 통해 쉽게 느낄 수 있습니다.
    5. BM 바늘 연결 항 응 혈 약 시트르산 포도 당 솔루션의 혼합물을 포함 하는 prefilled 주사기 (ACD-A) 및 헤 파 린 (USP/20ml, 수집 될 골 수의 9 mL 당 1 mL).
    6. 부드럽게 출 렁 다리 및 회전, aspirate과 응고 제를 섞어 주사기를 선동 하는 플런저를 다시 그립니다. 바늘을 회전 하 고 골 수 공간 내에서 셀의 큰 비율에 액세스 포부와 철수 위치.
    7. 샘플 수집 후 바늘을 제거 하 고 출혈 정지까지 포부 사이트에 압력을 적용.
      참고: 필요한 볼륨에 따라 하나 (2 humeri, 2 개의 화관) 4 개의 사지에서 골 단일 컬렉션 동안 그려 수 있습니다. 더 이상 20 mL 각 사지에서 수집 되어야 하 고 총 볼륨 수집 동물의 무게 (10 mL/kg)의 10% 미만 구성 한다.
    8. 여러 사지에서 aspirates를 받고, 결합 하 고 볼륨을 기록.
    9. NHP 복구 postanesthesia 하자.
      1. 절차 후 0.03 mL/kg atipamezole (재고 5 mg/mL)와 dexmedetomidine의 효과 역방향. 진통제 (예, Buprenorphine SR) 임상 수 의사의 판단에 따라 수술 후 이상 적어도 48 h에 대 한 임상 수의 직원에 의해 처방으로 임상 증상에 따라 제공 합니다.
      2. 절차 후 동물의 집 케이지를 반환 하 고 동물 자체 앉아 있게 될 때까지 매 15-20 분 모니터링 합니다. 포부 사이트 치유는 결정 될 때까지 매일 동물 수 의사 직원에 의해 모니터링 합니다. 또한, 염증, 감염, 또는 통증의 어떤 표시 든 지를 모니터링 합니다.
    10. 셀 처리를 병렬로 myeloablative 총 몸 방사선 조사 (TBI)와 동일한 NHP 조건: 1020 cGy 셀 주입 전에 2 일 동안 분류 한 복용량에서 7 cGy/분 관리 방사선의 속도로.
  2. BM hemolyze
    1. 50 mL 원뿔 튜브 (튜브 당 10-12 mL)에 BM을 분할 하 고 볼륨 50 mL (표 1)을가지고 hemolytic 버퍼를 추가. 때 lysed 하지만 800 x g 5 분에서 7 분 원심 분리기에 대 한 보다 더 이상 볼륨/튜브의 2-5 mL을 떠나는 pellet(s)에서 상쾌한 발음까지 실 온 (RT)에서 세포를 품 어. 잔여 볼륨에 펠 릿을 resuspend.
      참고: 성공적으로 lysed 샘플 색, 투명 한 밝은 빨간색 진한 빨간색에서 변경.
    2. Hemolytic 버퍼/펠 릿의 10-15 mL를 추가 합니다. 70 µ m 세포 멤브레인을 사용 하 여 모든 혈전을 제거 합니다. Hemolytic 추가 버퍼 최대 50 mL, RT에서 5 분 동안 품 어 및 5 분 동안 800 x g 에서 회전.
    3. 발음은 상쾌한 고 맥 버퍼 (표 1) 10 mL에 셀 resuspend. 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 다시 필터링. 튜브 및 필터 최대 50 mL를 버퍼링 하는 맥의 40 mL와 함께 그것을 씻어.
  3. 풍부는 CD34+ hemolyzed 백혈구 (Wbc) 표준 프로토콜을 사용 하 여에서 세포.
    1. 800 x g 15 분 검사에서 세포 관 아무 셀 소용돌이 상단/중간에 분명 확인을 회전 합니다. 셀 펠 릿 위에 존재 하는 경우 더 높은 속도 (최대 1000 x g 최대)와 최대 10 분 동안 다시 스핀.
    2. 상쾌한 발음 하 고 10 mL에 resuspend이 MAC 버퍼, 정확한 볼륨을 지적. 1: 100 또는 1:1,000 희석 한 hemocytometer 또는 자동화 된 셀 카운터를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.
      참고: 이 총 WBC 조사는 사전 농축 수가 이다.
    3. 1 x 108 셀/mL로 세포 농도가지고 맥 버퍼를 추가 합니다. 필요한 경우, 처음 (예를 들어, 때문에 낮은 사전 농축 수) 1.3.2 1.3.1-단계 반복 합니다. 5 x 106 셀 (사전 농축 샘플) 얼룩 HSC 하위 집합에 대 한 맥 버퍼를 보유 합니다.
    4. 결합형된 안티 CD34 항 체 (클론 12.8, 테이블의 재료)27 40 µ g/mL (1 x 108 셀/mL)의 최종 농도에 나머지 사전 농축 셀에 추가 합니다. 튜브 회전에 4 ° C에 세포 현 탁 액을 품 어 ( 재료의 표참조) 25-30 분.
    5. 볼륨 50 mL를가지고 5 분에 대 한 800 x g 에서 세포를 스핀을 사용 맥 버퍼는 상쾌한 발음, resuspend MAC 버퍼, 그리고 다시 5 분 동안 800 x g 에서 스핀의 50 mL에 셀.
    6. 두 맥 버퍼의 드가 100 mL 튜브, 왁 스 종이, 25-30 분 동안 공기 흡입구를 배치 필터 또는 사용할 준비까지.
    7. 마그네틱 구슬의 필요한 볼륨 계산: 구슬/109 셀의 1 mL. 발음은 상쾌한 고 구슬 추가 된 후 ml/108 셀, 셀을 resuspend. 예: 3 x 109 셀 + 구슬 + 맥의 27 mL 3 mL 전체 볼륨의 30 mL를 버퍼.
    8. 튜브 회전 25-30 분에 4 ° C에 세포 현 탁 액을 품 어.
    9. 동안 취득 열;에 대 한 자석 109 셀 열 당 x 0.6을 사용 하려고 합니다. 자석에 열을 배치 하 고 각 열을 통해 흐름을 수집 아래 50 mL 원뿔 튜브 위치. 차입 (단계에 대 한 각 열에 대 한 15 mL 원뿔 튜브와 플런저를 준비
    10. 단계 1.3.8에서에서 부 화 완료 되 면 50 mL에 맥 버퍼를 추가 하 고 5 분 Aspirate는 상쾌한에 대 한 800 x g 에서 회전 degassed 맥 버퍼 (열 당 2 mL)에 셀 resuspend. 부드럽게 소개 피하려고 피 펫 거품.
    11. 열 건조 실행을 허용 하지 않고 뒤에 세포 현 탁 액 2 mL 각 열 degassed 맥 버퍼의 1 mL를 추가 합니다. 필터 및 원래 degassed 맥 버퍼 튜브를 헹 구 고 열 (6 mL/열); 사이 솔루션 분 그런 다음, 최종 세척을 위한 degassed 맥 버퍼의 7 mL를 추가 합니다.
    12. 부드럽게 자석 (푸시 맨 뒤)에서 열을 끌어 하 고 흐름을 통해 튜브에 마지막 물방울을 수집 합니다. 각 열에 degassed 맥 버퍼의 5 mL을 추가 하 고 단계의 1.3.9 살 균 원뿔 관으로 셀을 elute에 플런저를 적용. 거품이 나타납니다 후 어떤 액체를 수집 하지 않습니다.
  4. 농축 및 흐름을 통해 (피트) 컬렉션 튜브 1:10 희석 비율에 있는 셀을 계산 합니다. 얼음에 셀을 계속. CD34-농축 분수와 cytometry 분석에 대 한 FT 분수에서 5 x 106 세포에서 aliquot 1 x 106 셀. 품질 관리 (2 단계) 체결 될 때까지 4 ° C에서 피트 부분을 저장 합니다.
    참고: CD34의 수+ 는 NHP에 성공적인 multilineage engraftment HSC 농축 CD34의 주파수에 따라 달라 집니다 필요한 셀+CD90+CD45RA- 하위 집합. 평균 주파수 3%-5%의와++CD45RA CD90 122000 CD34의 최소 요구에 따라 바디의 킬로그램 당- 셀 무게1,6 적어도 2.5 x 10의 총 진행을 권장 하 고 최대 10 x 10 6 CD34 체중의 킬로그램 당+ 세포.
  5. 맥을 추가 는 CD34 버퍼+ 농축 분수 총에서 50 mL, 5 분 동안 800 x g 에서 회전, 상쾌한, 발음을 HSPC 미디어 (표 1)에 106 셀/mL을 셀 resuspend.
    1. 발명, 조직 문화 (TC) 106 셀/mL의 농도에서 세포를 플레이트-T-75 플라스 크, 플라스 크, 당 10-20 mL를 취급 하 고 37 ° C, 5% CO2 배양 기에서에서 그들을 밤새 품 어. 플라스 크 세로 (안 서) 휴식.
      참고: 원하는 경우 추가 CD34+ 셀 또는 CD34- 피트 90% 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) + 1 x 106 5 x 106 셀/mL의 농도에서 10% 디 메 틸 sulfoxide (DMSO) cryopreserved 다음에-느린 냉각 수 있습니다 80 ° C (예를 들어, 냉동 컨테이너를 사용 하 여). Cryopreserved 셀의 평균 복구 수익률은 CD34에 따라 달라 집니다+ 순수성 및 일반적으로 50%에서 80%의 생존 능력에 범위 > 80%.

2. 품질 관리 CD34-농축 셀 (주-1)

  1. Cytometry에 대 한 샘플을 준비 합니다.
    1. Resuspend 샘플 10 x 106 셀/mL의 농도에서 FACS 버퍼 (사전 농축, 피트, 그리고 분수 CD34-농축) 위에서 언급 한 각 격리 단계에서 예약 및 FACS 튜브를 100 µ L 각 세포 현 탁 액 (표 1)의 전달.
      참고: 컨트롤 샘플 앞으로 산포 (FSC), 측면 살포 (SSC), 및 각 형광 채널에 autofluorescence 조정 흠 없는 세포 각 격리 단계 (예: 5 x 105 셀)에서 포함 되어야 합니다. 또한, 각 형광 색소 활용 된 항 체에 대 한 단일 스테인드 보상 구슬 사이 인접 한 채널 (표 2 및 표 3) 보상에 대 한 조정 해야 합니다.
    2. 한 테스트 (100 µ L에 1 x 106 셀)에 대 한 제조업체의 지침에 따라 원하는 항 체 (예: 안티 CD45, 안티 CD34, 안티-CD45RA 및 안티 CD90), 추가 (표 3). 4 ° c.에 20 분 동안 품 어 5 분 동안 800 x g 에서 FACS 버퍼 및 스핀 3 mL를 추가, 발음은 상쾌한, FACS 버퍼의 100 µ L에서 resuspend 및 적절 한 교류 cytometer (단계 2.2)에 분석.
  2. 분석에 대 한 교류 cytometer/셀 정렬을 준비 합니다.
    참고:     셀 단계 2.3에서에서 정렬에 사용할 동일한 컴퓨터에서 분석을 수행 하는 것이 좋습니다.
    1. FSC/SSC, CD45/CD34, CD45RA/CD90 (3 흐름 플롯) 등 프로토콜을 생성 합니다. 흐름에 단추로 인구 계층 구조형 레이아웃을 추가 합니다.
    2. FSC/SSC 플롯에 left-click, 다각형 게이트 기능을 선택 하 고 파편과 죽은 세포를 제외 하는 게이트를 그릴. 새로운 게이트를 선택 하 고 관리자 창에서 분산형 을 이름을 바꿉니다.
      참고: 이것은 자동으로 P1으로 불린다.
    3. CD45/CD34 흐름 음모의 중심에 단추로, 인구를 표시, 탐색를 게이트 분산형에 플롯 합니다. 제외 비 CD34 세포와 잘 잔여 혈소판 및 적혈구 nonhematopoietic 셀+ CD45intCD34 주위 사각형 게이트 셀 그리기 (CD45-). 게이트를 이름을 CD34+.
    4. 게이트는 CD34에 CD45RA/CD90 흐름 작+ 인구. 그리기 CD90 주위 3 개의 독립적인 subgates+CD45RA- 세포 (HSCs 위한 농축), CD90-CD45RA- 세포 (multipotent 및 erythro 골수성 창시자 [MPPs/EMPs]에 대 한 농축), 그리고 CD90-CD45RA + 세포 (lympho 골수성 창시자 [LMPs]에 대 한 농축). 각각 HSC, MPP-EMP, LMP, 게이트를 이름을 바꿉니다.
    5. 완료 되 면 다음과 같은 순서로 6 계층적 조직된 항목 인구 계층 에 포함 되어 있는지 확인: 1) 모든 이벤트; 2) 분산형; 3) CD34+; 4) HSC; 5) MPP-EMP; 6) LMP입니다. 그림 4에서 볼 수 있듯이 흐름 플롯과 게이트의 모양을 보고 확인 합니다.
    6. 조정 하는 전압 FSC, SSC, 모든 형광 채널 (표 2, 샘플 5) 흠 없는 사전 농축 Wbc를 실행 합니다. 인접 채널 (표 2, 샘플 1-4) 사이 보상을 조정 하려면 단일 스테인드 보상 구슬을 실행 합니다. 나머지 모든 실행 흠 없는 및 샘플은 조정으로 얼룩진 프로토콜, CD34 농축 효율 (표 2, 샘플 6-9)를 보상.
      참고: 최종 샘플 (표 2, 샘플 10) 동시 흐름 분석 및 단계 2.4에서에서 정렬 셀을 계속.
  3. 셀 정렬 셀 (CFC) 분석 실험 식민지 형성으로 CD34 하위 집합의 정렬 정화에 대 한 구성 합니다.
    참고:     경우 다른 기계 분석 (2.2 단계) 이전 단계 2.2.1-2.2.5에서에서 설명한 셀 정렬에서 프로토콜 설정에 대 한 사용 되었습니다.
    1. 왼쪽 및 오른쪽 스트림에 연합사 매체를 포함 하는 15 mL 튜브에 입금 셀 셀 정렬 소프트웨어에 대 한 각도/전압을 조정 합니다. 각도의 부정합을 방지 하기 위해 측면 스트림 구성 합니다. 현명한, 세부적으로 조정할 반사 측 스트림의 각도 거의 셀 정렬 됩니다 때문에 정렬된 셀 CFC 매체와 아닌 튜브의 측면을 칠 때까지.
    2. 브라우저에서 글로벌 워크시트 폴더를 열고 새로운 정렬 레이아웃 브라우저 윈도우의 상단 메뉴에 있는 단추를 사용 하 여 만들 수 있습니다. 2 튜브를 수집 장치 드롭 다운 메뉴에서 항목, 4 방향 순도 또는 단일 셀 에 정밀 드롭-다운 메뉴에서 항목을 변경 하 고 800-1200 셀에 대상 이벤트를 설정. (왼쪽 또는 오른쪽) 정렬 위치 필드에 left-click, 메뉴에서 항목 추가 선택 하 고 채우기 메뉴에서 정렬을 선택.
  4. 연합사 분석 실험에 대 한 셀을 정렬 합니다.
    참고:     CFC 분석만 CD34-농축 제품 (표 2, 샘플 10)에서 세포와 수행에 대 한 정렬.
    1. 샘플 10를 로드 하 고 2000-3000 이벤트 기록 미세 조정 신호 강도 및 대상 인구에 맞게 정렬 게이츠.
    2. 설치가 완료 되 면 셀 (표 2, 샘플 10) 취득. 2.2.3 단계에서 설명한 대로 데이터를 취득, 500-1000 셀/s, 유량 조정 및 i) 분산형 게이트, ii)는 CD34에서에서 800-1200 셀 정렬+ 게이트, iii) HSC 게이트, iv)는 MPP EMP 게이트 및 v) 연합사의 3.6 mL를 포함 하는 별도 튜브로 LMP 게이트 미디어입니다.
      참고: 연합사 분석 실험에 대 한 정렬 셀에서 CD34-농축 제품 (표 3, 샘플 10)만 수행 됩니다. 분산형 및 CD34 셀+ HSCs, MPP-EMPs, 및 LMPs 왼쪽 및 오른쪽 튜브 홀더 위치에 동시에 정렬할 수 있습니다 반면 게이츠 개별적으로 정렬 되어야 합니다.
    3. 소용돌이의 3 x 3.5 cm 살 균, nontissue, 문화 취급 접시의 각 세포 현 탁 액 1 mL를 분배 하 고. 보조 컨테이너 (예를 들어, 15 cm 배양 접시)에서 10-14 일 동안 37 ° C에서 세포를 품 어.
    4. 일 10-11 postplating, 계산 조건, 식민지 형태에 따라 당 모든 3 개의 격판덮개에서 개별 식민지.

3. 유전자 수정 CD34의+ HSPCs와 하룻밤 복구 (0 일)

  1. 행 크의 균형된 소금물 (HBSS, 참조 테이블의 재료) 50 mL에 50 µ g/mL을 1 µ g / µ L 채널-296 솔루션의 2.5 mL를 희석.
  2. LV 변환에 대 한 플라스 크를 준비 합니다.
    1. Nontissue-문화 (비-TC)의 대략적인 수를 결정-(일반적으로 셀 수 단계 1.4에서에서 결정)에서 필요한 플라스 크 취급. 플레이트 1 x 107 셀 T-75 플라스 크 당 미디어 10 mL에 계획 (1 x 108 총 셀 10 플라스 크 필요) 포함 한 TC 치료 비 12-잘 접시 (모의 변환 조건). 2 µ g/c m2의 농도에 각 플라스 크/플레이트, 3.1 단계에서 메 마른 HBSS와 50 µ g/mL 채널-296 주식을 추가 합니다. T-75 플라스 크를 사용 하 여 50 µ g/mL 채널-296 + 7 mL HBSS; 3 mL 12-잘 접시 잘 당 50 µ g/mL 채널-296 + 340 µ L HBSS의의 160 µ L을 사용 합니다.
    2. 그대로 RT에 또는 2 h. Aspirate 채널-296에 대 한 후드에 깨끗 한 벤치에 앉아서 멸 균 HBSS + 2% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)의 비슷한 볼륨으로 대체 요리를 하실 수 있습니다. 30 분 동안 RT에서 품 어, HBSS/BSA, 발음 및 2.5%를 포함 하는 메 마른 HBSS의 비슷한 양으로 설거지 1 M HEPES, pH 7.0. 셀 (3.4 단계) 도금 직전 발음.
      참고: 3.2.2 단계, 건조 접시/플라스 크를 허용 하지 않습니다. 살 균 HBSS + 2.5%를 포함 하는 접시 1 M HEPES는 개최 4 ° C에서 하룻밤 (즉,, -1 당일 준비).
  3. 수확 하 고는 CD34 transduce+ 세포 주-1에서에서.
    1. 10 mL 피 펫을 사용 하 여 살 균 HBSS와 각 문화 플라스 크의 반복, 부드러운 rinsing에 의해 느슨하게 부착 셀 린스. 모든 셀이 분리 됩니다 있는지 확인 (필요한 경우 탭/때 리고 셀을 풀고 플라스 크).
    2. 800 x g 5 분에 세포를 원심, 상쾌한, 발음 및 resuspend 변환 미디어 1 x 106 셀/mL의 농도에서 세포. 모든 세포가 수집 하 고, 일단 hemocytometer 또는 자동화 된 셀 카운터를 사용 하 여 셀 수를 결정 합니다.
    3. (대 한 모의 불리고 컨트롤 샘플) 채널-296-코팅 12-잘 접시의 한 잘에 세포 현 탁 액 (1 x 106 셀)의 1 mL를 추가 합니다. 분할 T-75 플라스 크 (3.2.2 단계) 중 셀의 나머지 플라스 크 당 약 10 mL (1 x 107 셀) 추가. 통풍 모자 37 ° C에서 배양, 30 분, 5% CO2 채널-296 코팅을 준수를 셀 수 있습니다.
    4. 미디어 바이러스 조절 (VCM, 재료의 테이블)을 해 동 하 고 밀리 (IU/mL)28,,2930,31,32 당 감염 단위에서 titer를 결정 . 3.3.3 단계에서 각 T-75 플라스 크를 VCM의 적절 한 볼륨을 추가 하 고 37 ° C, 5% CO2에서 셀을 품 어.
      참고: 단일 변환 수행 하는 경우는 품 어 하룻밤; 이중 변환을 수행할 경우 반복이 stepapproximately 6-8 세척/복구 하지 않고 첫 번째 변환 후 h 단계 고, 다음, 하룻밤에 품 어. 예를 들어 10의 감염 (MOI)의 원하는 다양성을 가진 하나의 플라스 크 (1 x 107 셀)에 대 한 1 x 108 IU/mL에서 바이러스 titered의 1 mL를 추가 합니다.

4. 세포 수확 및 주입 (주 1)에 대 한 준비

  1. 셀을 수확.
    1. 3.3.2 3.3.1-단계에 설명 된 대로 불리고 모의 세포를 수집 합니다. HBSS, 셀으로 원뿔 튜브는 세척 전송의 10 mL와 순차적 세척을 수행 합니다. 모든 셀 도청/두 드림은 플라스 크 필요한 경우 플라스 크에서 제거 되었는지 확인 합니다.
    2. 5 분 동안 800 x g 에서 셀 정지 원심, 상쾌한, 발음 그리고 HBSS의 1 mL에 펠 릿을 resuspend. 같은 조건에서 셀을 포함 하는 튜브를 결합 한다. HBSS의 10 mL에 각각을 헹 구 고 셀 서 스 펜 션에 그것을 추가. hemocytometer를 사용 하 여 셀 수를 결정 합니다. HBSS 및 5 분 동안 800 x g 에서 원심 분리기에서 50 mL에 총 셀 볼륨을 가져와.
  2. 펄스 스타 글란 딘 E2 (PGE2) 주입 제품에 대 한 시 약을 준비 하 고.
    1. 발음은 상쾌한 고 cytokines 없이 HSPC 미디어에서 5 x 106/mL을 transduced 셀 (안 모의) resuspend. 10의 최종 농도에 10mm PGE2 추가 µ M. 품 어 부드럽게 소용돌이 그들을 30 분 마다 2 시간에 대 한 얼음에 셀.
    2. 4.2.1 단계 열 비활성화 헌 혈 청 (자료 테이블), 컨테이너 왁 스 종이에 배치 하 고 30 분을 위한 56 ° C에서 배양 들 음, HBSS (500 µ L 열 비활성화 세럼 + HBSS 24.5 mL), 혼합에 2% 헌 혈 청을 준비 하 고 사용까지 얼음에 혼합물을 저장 합니다. 또한, 단계 4.2.1 pipetting 셀 아래로 적극적으로 하 여 12-잘 접시의 모의 불리고 세포를 수확. 15 mL 원뿔 튜브에 세포 현 탁 액을 추가, 그들을 씻어 HBSS의 1 mL와 함께 3 x 같은 15 mL 원뿔 튜브는 세척에 추가.
    3. 셀 2 세척 후 PGE2 외피의 2 h, x 800 x g 5 분에서 centrifuging와 삭제는 상쾌한. 두 번째 세척 후 resuspend HBSS의 적절 한 볼륨에 셀, 대 한 한 hemocytometer 또는 자동화 된 셀 카운터를 사용 하 여.
      참고: 세포는 자주 덜 신뢰할 수 있는 셀 개수에 대 한 만들 수 있는 PGE2 펄스 후 덩어리. 그렇다면, 단계의 4.1.2 셀 수를 사용 하 여 단계 4.2.3에서에서 대신.
  3. 주입 제품의 품질 관리 (5 단계)에 대 한 모의 고 불리고 셀 보유: 1 x 106 5 x 105 액체 문화 (5.2 단계)에 대 한6 셀 흐름 cytometry/셀 정렬 (5.1, 5.3 단계)와 약 1 x 10에 대 한 세포 및 식민지 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) (단계 5.4).
  4. 주입 제품을 준비 합니다.
    1. Transduced 셀의 나머지, HBSS 50 mL에 세 번째 세척을 수행 하 고 상쾌한, 발음 HBSS + 2% 헌 혈 청 (4.2.2 단계에서 준비) 10 mL에 셀 resuspend. 16.5 G 바늘으로 장착 20 mL 주사기로 10 mL 해결책을 그립니다. HBSS + 2% 자동 혈 청의 10 mL와 함께 튜브를 세척 하 고 총 볼륨 20 mL를가지고 같은 주사기로 세척을 그립니다. 주사기 바늘 캡 모자, 주사기, 라벨 그리고 수송/주입에 대 한 얼음에 그것을 배치.
    2. 통해 중앙 정 맥 카 테 테 르33,34공인된 동물 연구 시설 내에 위치한 헌 호스트에 불리고 셀 제품을 달 이다. 이식된 동물의 완전 한 혈액 세포 수 (CBCs)와 혈액 화학을 모니터링 하 고 프로젝트1,,619에 맞게 연구 관련 유전자 표시 분석 실험을 수행.

5입니다. 품질 관리

참고: Cytometry 교류 하 고 셀 정렬 셀은 후속 단계 4.4.2에서에서 설명의 일부로 동물에 주입 후 수행 됩니다. 흐름 cytometric 데이터 이식 직후 phenotypically 정의 된 줄기와 조상 세포 하위 집합 주입 제품 (5.1, 5.3 단계)의 구성을 결정 하는, 반면에 CFC의 분석 분석 실험 수행 12-14 일 식민지 PCR (5.4 단계)에 의해 유전자-수정 효율을 결정 하는 postinfusion.

  1. Cytometry 및 CFC 주입 제품의 정렬을 수행 합니다.
    1. Cytometry에 의해 세포를 분석 하 고 정렬-정화 연합사 분석 실험에 대 한 하위 집합 CD34 단원 2에서에서 설명한 대로. 씨앗 연합사 모의 고 불리고 CD34 셀 (PGE2 펄스 후 주입 제품)에서 분석 실험.
    2. 정렬 조건 및 소용돌이, 플레이트, 문화, 800 셀의 최대 및 CFC 분석 2.4 단계에서 설명한 대로. 후 식민지 PCR 단계 5.4에서에서 설명 된 대로 수행 하기 위해 CFC 분석 실험에서 식민지를 선택 하십시오.
  2. 액체 문화
    1. 플레이트 1 x 106/mL TC 치료 비 접시에서에 HSPC 미디어에 액체 문화에 대 한 셀. 2, 5, 및 12 일 posttransduction에서 수확 하 고 cytometry에 대 한 셀을 계산 합니다. 연합사 분석 실험에 대 한 정렬 셀 필요 하지 않습니다.
    2. 일 2, 5, 33% 신선한 HSPC 미디어 1 x 106/mL에서 replate. 실시간 양이 많은 PCR에 DNA 추출 버퍼에 셀의 33%를 동결. Cytometry에 대 한 셀의 33%를 사용 하 여 2.1과 2.2 단계에 설명 된 대로.
    3. 5.2.2 단계에서이 데이터를 사용 하 여 조 혈 자손의 phenotypic 구성 분석. 2.2.2 각 샘플 내에서 단계에서 설명한 대로 CD34 + 세포 그리고 phenotypically 정의 된 하위 집합의 주파수를 결정 합니다. CD34의 구성 비교+ 세포 유전자 수정의 효과 결정 하는 조건 사이.
      참고: CD34+ 세포 전체 문화에 걸쳐 그들의 식을 유지 하 고 모든 phenotypic 하위 집합을 포함 해야 합니다. CD90 손실+CD45RA- 셀 또는 phenotypical 하위 집합의 overrepresentation 유전자 수정의 간접 또는 직접 효과 나타낼 수 있습니다.
  3. Cytometry (옵션 및 실험 설정에 따라), 적응 단계 2.2에서에서 프로토콜에 의해 transgene 식 (예:., 녹색 형광 단백질 [GFP])를 계량.
    1. SSC/transgene를 보여주는 3 개의 흐름 플롯을 추가 (예: SSC/GFP). 게이트 HSCs, MPPs EMPs에 두 번째 그리고 세 번째 LMPs 음모에에 첫 번째 작 각 대 transgene (예를 들어, GFP) 하 고 게이츠 라는 HSC-GFP+, MPP-EMP-GFP++, LMP-GFP 각각 만듭니다.
    2. 완료 되 면 인구 계층 구조 는 다음 순서로 9 계층적 조직된 항목을 포함 하는: 1) 모든 이벤트; 2) 분산형; 3) CD34+; 4) HSC; 5) HSC-GFP+; 6) MPP-EMP; 7) MPP-EMP-GFP+; 8) LMP; 9) LMP-GFP+.
      참고: 액체 문화 뒷부분에서 transgene 식 (예를 들어, 5-12 일) 더 나은 단계 5.4에서에서 식민지 PCR에 의해 결정 하는 유전자 수정 효율성을 반영할 것 이다. 액체 문화에서 이전 시간 포인트 transgene 식 unintegrated 정 맥 주사 때문과 대 평가 될 수 있습니다. 마찬가지로, 많은 거짓 긍정적인 식민지 흐름 정렬 GFP+ 셀 1 일 연합사 분석에 대 한 발생 합니다.
  4. 식민지 PCR을 수행 합니다.
    1. 2.4.4 및 5.1.1 단계에서 계산 후 DNA 추출 버퍼의 50 µ L로 단일 식민지를 선택, 10 µ L 또는 20 µ L를 사용 하 여 플라스틱, 8 튜브 PCR 스트립 캡의 1 개의 관에 식민지를 전송 하려면 위쪽 및 아래쪽 플라스틱. 모의 조건에서 8 식민지와 88 식민지 한 전체 96 잘 접시를 생성 하 transduced 상태에서 선택 합니다. 각 우물에 DNA 추출 버퍼의 50 µ L를 추가 합니다.
    2. thermocycler 및 다음 프로그램을 사용 하 여 식민지에서 DNA를 추출: 65 ° C/20 분, 99 ° C/10 분, 그리고 개최 4 ° C. 최적의 품질을 위해 최대한 빨리-20 ° C에 DNA를 이동 하려고 합니다.
    3. 식민지 PCR LV 불리고 셀, 걸 F/R 및 제어 뇌관 (테이블의 재료)를 사용 하 여 전체 식민지 Lenti F/R 뇌관을 사용 하 여 LV+ 식민지의 수를 비교 척도를 수행 합니다.

결과

위에서 설명한 프로토콜은 격리 하 고 유전자 수정 NHP CD34 설계 되었습니다+ HSPCs, 이후 헌 호스트 (그림 1 및 그림 2)에 다시 들어갈 수 있습니다. 이 프로토콜에 따라 때 우리가 일반적으로 피그 원숭이에서 끝났다 BM에서 8 x 10까지9 총 Wbc 얻을 그리고, 때때로, 붉은 털 원숭이에서 그 금액을 두 번. 두 종, CD34의 수...

토론

LV 벡터 엔지니어링은 유전자 수정 CD34 셀 유형 베스트 특징이 방법+ HSPCs, 이후 이식 vivo에서. 여기에 설명 된 프로토콜은 유전자 수정 HSPCs, vivo에서 장기 유지의 수를 극대화 하 고 다양 한 악성, 감염 및 유전 질환을 가진 환자에 게 임상 혜택을 제공 설계 되었습니다. 유전자 편집 전략 지난 10 년간 등장, LV 수정 세포는 최고의 생체 외에서, 동물 모델, 그리고 환자1,

공개

저자는 공개 없다.

감사의 말

저자는이 원고, 그래픽 디자인, 짐 Woolace 그리고 베로니카 넬슨과 Devikha Chandrasekaran 프로토콜의 개발에 참여를 준비 하기 위한 헬렌 크로포드를 감사 합니다. 이 프로토콜의 개발 알레르기의 NIH 국립 연구소와 전염병 (R01 AI135953와 H.P.K. AI138329) 국가 심 혼, 폐, 및 혈액 연구소 (R01 HL136135, HL116217, P01 HL122173, 및 U19에서 교부 금에 의해 지원 되었다 H.P.K. HL129902), NIH P51 OD010425 뿐만 아니라, 일부 NIH/NCI 암 센터, 지원 그랜트 P30 CA015704를 통해. H.P.K.는 마 키 분자 의학 탐정 세포 및 유전자 치료에 대 한 암 연구와 프레드 허 치 부여의 자에 대 한 지원의 호세 카레라스/E. Donnall 토마스 부여 자의 취임 받는 사람으로 받은.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Stemspam SFEM II ("HSPC") MediaStemCell09655
Hank's Balanced Salt SolutionGibco14175095
Phosphate-Buffered SalineGibco14190-144
Penicillin/StreptomycinGibco15140-122
Dimethyl SulfoxideSigma AldrichD2650-100
100% EthanolDecon labsM18027161M
CyclosporineSigma30024-25MG
500 mM EDTAInvitrogen15575-038
Heat-Inactivated Fetal Bovine SerumSigma AldrichPS-0500-A
CH-296/ RetroNectin (2.5 mL, 1 µg/µL)TaKaRAT100B
Bovine Serum AlbuminSigmaA7906-100g
HEPESSigmaH9897
Rat anti-mouse IgM magnetic beadsMiltenyi Biotec130-047-301
Recombinant HumanStem Cell Factor (SCF)Peprotech300-07
Recombinant Human Thrombopoietin (TPO)Peprotech300-18
Recombinant Human FMS-like tyrosine kinase 3 (FLT-3)Peprotech300-19
Protamine sulfateSigmaP-4505
14 mL Polypropylene Round-Bottom TubeCorning352059
Colony Gel 1402ReachBio1402
QuadroMACS SeparatorsMiltenyi Biotec130-090-976
MACS L25 ColumnsMiltenyi biotec130-042-401
10 mM PGE2Cayman Chemical14753-5mg
TC-treated T-75 flasksBioexpressT-3001-2
Non-TC-treated T-75 flasksThermo-Fisher13680-57
20 mL syringesBD Biosciences302830
16.5 G needlesBD Precision305198
Syringe Tip CapBD Biosciences305819
QuickExtract DNA SolutionEpicentreQE09050
8-tube strip cap PCR TubesUSA scientific1402-2708
96-well ThermocyclerThermo-Fisher4375786
Pre-Separation filtersMiltenyi Biotec130-041-407
Strainer, Cell; BD Falcon; Sterile; Nylon mesh; Mesh size: 70um; Color: white; 50/CSfisher scientific352350
Ultracomp ebeadseBioscience01-2222-42
MACSmix Tube RotatorMiltenyi130-090-753
3 mL Luer-Lock SyringesThermo-Fisher14823435
35 mm x 10 mm cell culture dishCorning430165
60 mm x 15 mm cell culture dishCorning430196
150 mm x 25 mm cell culture dishCorning430599
Non TC treated flasksFalcon353133
Qiagen DNA extractionQiagen51104
PE Anti-Human CD90 (Thy1) Clone:5E10Biolegend328110
PE-CF594 Mouse Anti-Human CD34 Clone:563BD horizon562449
APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone: 5H9BD Pharmingen561212
V450 Mouse Anti-NHP CD45 Clone:d058-1283BD Biosciences561291
Autologous SerumCollected from autologous host and cryopreserved prior to mobilization and collection of CD34+ HSPCsN/ABeard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).
Virus-Conditioned Media (VCM)Kiem Lab, FHCRC Co-operative Center for Excellence in Hematology (CCEH)N/ABeard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).
Anti-CD34 antibody, Clone 12.8Kiem LabN/ABeard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).
Lenti F primer: AGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAIntegrated DNA TechnologiesN/APeterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).
Lenti R primer: TGCCTTGGTGGGTGCTACTCCTAAIntegrated DNA TechnologiesN/APeterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).
Actin F primer: TCCTGTGGCACTCACGAAACTIntegrated DNA TechnologiesN/APeterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).
Actin R primer: GAAGCATTTGCGGTGGACGATIntegrated DNA TechnologiesN/APeterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).

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