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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

L'obiettivo del presente protocollo è quello di isolare il primate non umano CD34+ cellule dal midollo osseo innescato, gene-modificare queste cellule con vettori lentivirali e preparare un prodotto per infusione nell'ospite autologo. La lunghezza di protocollo totale è di circa 48 ore.

Abstract

Trapianto di cellule (HSPC) di staminali e progenitrici ematopoietico è stato una terapia di pietra angolare per la leucemia e di altri cancri per quasi mezzo secolo, sottende l'unica cura conosciuta dell'infezione del virus di immunodeficenza umana (HIV-1) e Mostra la promessa immenso in il trattamento di malattie genetiche come la beta talassemia. Il nostro gruppo ha sviluppato un protocollo di terapia genica di modello HSPC in primati non umani (NHPs), permettendo agli scienziati di ottimizzare molti dei reagenti e tecniche che vengono applicate nella clinica stessa. Qui, descriviamo i metodi per la purificazione CD34+ HSPCs e sottoinsiemi di cellule staminali ematopoietiche (HSC) persistenza a lungo termine da innescata del midollo osseo (BM). Tecniche identiche possono essere impiegate per la depurazione di altre fonti HSPC (ad es., mobilitato periferico cellule staminali [PBSCs]). Descritte è un protocollo di 2 giorni in cui le cellule sono purificate, coltivate, modificate con lentivirus (LV) e preparate per infusione nuovamente dentro l'host autologo. Letture di chiave di successo includono la purezza del CD34+ HSPC popolazione, la capacità di HSPCs purificato di formare colonie morfologicamente distinte in supporti semisolidi e, soprattutto, efficienza di modificazione del gene. Il vantaggio chiave di terapia genica HSPC è la capacità di fornire una fonte di cellule longeve che danno origine a tutti i tipi di cellule ematopoietiche. Come tali, questi metodi sono stati utilizzati per terapie di modello per cancro, malattie genetiche e malattie infettive. In ogni caso, l'efficacia terapeutica è stabilito migliorando la funzione della progenie HSPC distinte, tra cui i globuli rossi, cellule T, cellule B, o sottoinsiemi mieloide. I metodi per isolare, modificare e preparare HSPC prodotti sono direttamente applicabili e traducibili per malattie multiple in pazienti umani.

Introduzione

Terapia genica con cellule staminali è un potente mezzo per affrontare una vasta gamma di patologie umane. Terapia genica HSPC è un approccio particolarmente attraente, a causa di i) la relativa facilità di raccolta di queste cellule dai pazienti, ii) la ricchezza di conoscenza che è disponibile per quanto riguarda la superficie fenotipi cellulari ed ex vivo parametri di cultura e, come il campo si espande, perché iii) presenta scienziati con un crescente della casella degli strumenti di modifica genica su misura per varie malattie di interesse. Stiamo attivamente indagando HSPC approcci di terapia genica da angolazioni diverse, tra cui la scienza di base di biologia HSPC, l'attecchimento di HSPCs gene-modificato in modelli preclinici in vivo e l'applicazione di rilevanti popolazioni di pazienti. Noi ed altri abbiamo caratterizzato il fenotipo di superficie delle cellule di funzionalmente distinte HSPC sottoinsiemi1,2,3, la mobilizzazione e regimi di condizionamento che massimizzano il rendimento HSPC e attecchimento, riducendo al minimo tossicità4,5ed il gene modifica e strategie di modifica del gene che sono state adattate ad una vasta gamma di maligno, genetica e malattie infettive6,7,8, 9,10. La funzione e l'attecchimento del HSPCs gene-modificato può essere valutati in una serie di modelli di piccoli e grandi animali, tra cui topi, cani e NHPs. In particolare, modelli NHP sono vantaggiose perché molti reagenti, ad esempio, gli anticorpi specifici per proteine della superficie cellulare HSPC come CD34 e CD90, possono essere utilizzati indifferentemente in umani e cellule NHP. Inoltre, contrariamente ai topi, grandi animali come NHPs consentono una migliore approssimazione della scala di modificazione genetica necessari per efficacia clinica. Infine, NHPs sono il gold standard per la modellazione delle patologie umane come l'HIV-1 infezione11 e un sistema di modello emergente per candidato anticancro e anti-HIV immunoterapie12,13.

Lo scopo del presente protocollo è di delineare i metodi per purificare, geneticamente modificati e preparare NHP HSPC infusione prodotti. Anche se all'esterno dell'ambito del presente protocollo, precedentemente abbiamo indicato che questi prodotti attecchire in host NHP autologo, danno luogo a tutte le filiere emopoietiche e forniscono efficacia terapeutica in una vasta gamma di modelli di malattia1. Abbiamo anche caratterizzato il clonality di attecchimento HSPCs e costruito una piattaforma per monitorare la cinetica, il traffico e il fenotipo di HSPCs individuali e la loro progenie, seguente trapianto autologo1,14. I metodi qui presentati sono stati sviluppati con i seguenti obiettivi: i) per isolare HSPCs altamente puro e a lungo termine attecchimento sottoinsiemi HSC, ii) per mantenere HSCs primitivo durante ex vivo di cultura e iii) di gene-modificare in modo efficiente sia alla rinfusa HSPCs o a lungo termine capacità di integrazione sottoinsiemi HSC. Ci avvaliamo di magnetico-assistita ordinamento delle cellule (MACS), così come fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS), per isolare fenotipico/funzionalmente HSPC popolazioni distinte, coerente con i metodi di molti gruppi2,15, 16. La manutenzione di HSCs primitivo nella cultura (cioè, riducendo al minimo la differenziazione di queste cellule nei progenitori che danno luogo a completamente differenziato sottoinsiemi linfoidi e mieloidi) è un aspetto essenziale del protocollo descritto qui. Anche se in precedenza abbiamo caratterizzato gli approcci per espandere HSPCs pur mantenendo un fenotipo primitivo17,18, qui, descriviamo un protocollo che si concentra sul mantenimento di HSCs tramite un minimo (48h) ed è definita ex vivo di cultura.

La modifica efficiente di HSPCs e HSC sottoinsiemi è un obiettivo centrale del presente protocollo. Tra i diversi approcci che abbiamo segnalato, due sono di gran lunga il più studiato in sperimentazioni cliniche: modificazione genetica LV-mediata e nucleasi-mediata del gene editing1,6,19. Strategie di modifica del gene uno di una serie di piattaforme di nucleasi consente di modificare in modo specifico un gene bersaglio di interesse, ad esempio, ricevitore di chemokine C-C tipo 5 (CCR5) per il trattamento di HIV infezione7,19 o Bcl11A per il trattamento di emoglobinopatie6. Qui, ci concentriamo sulla modificazione genetica LV-mediata, in cui carichi transgenici semirandomly integrano il genoma1,8,20. Un vantaggio chiave di approcci di LV è la capacità di fornire grandi quantità di materiale genetico (fino a 8 o 9 kilobasi). Anche se modifica del gene strategie stanno sviluppandi per impostare come destinazione un transgene di interesse a integrare solo in un locus specificato tramite la ricombinazione omologa donatore (HDR), questi metodi richiedono ulteriore sviluppo in vitro e in modelli animali di piccole dimensioni. Al contrario, vettori di LV sono stati ampiamente utilizzati in NHPs e in pazienti21,22. D'importanza, il protocollo descritto qui, che utilizza innescato BM come fonte HSPC iniziale, può essere ampiamente e facilmente adattato, ad esempio, per isolare PBSCs. Come descritto in precedenza, approfittiamo dell'elevato grado di somiglianza genetica tra NHPs e gli esseri umani per usare i reagenti che valgono per entrambe le specie. Infine, questo approccio è stato adattato per modificare altri sottoinsiemi ematopoietici, vale a dire T cellule12,23,24; l'avvento di efficaci approcci di immunoterapia di T-cellula ha fatto affidamento sulla stessa piattaforma LV utilizzata nel presente protocollo. Questi metodi sono adatti per qualsiasi ricercatore interessato in biologia HSPC o modificazione genetica LV-mediata. Ad esempio, il protocollo di purificazione HSPC presentato qui potrebbe essere utilizzato per caratterizzare nuovi sottoinsiemi HSC-arricchito, come descritto in precedenza1,15,25. Allo stesso modo, la trasduzione di LV metodi qui presentati allo stesso modo potrebbero essere applicata e ulteriormente sviluppata per numerosi altri tipi cellulari e domande sperimentali, sia in modelli in vitro ed in vivo.

In sintesi, vi presentiamo metodi per isolare e modificare geneticamente NHP HSPCs. Questi metodi possono essere facilmente adattati per altre specie e altre fonti di HSPCs. Questo protocollo accuratamente controllato Mostra la grande promessa nella modellazione delle terapie efficaci per numerose malattie umane.

Protocollo

Trapianti autologhi NHP, adescamento (mobilizzazione), la raccolta delle cellule e la modificazione genetica sono condotte coerenti con protocolli precedentemente pubblicati26. Tutte le procedure sperimentali sono esaminate e approvate dal comitato di uso del Fred Hutchinson Cancer Research Center e l'Università di Washington e istituzionali Animal Care (protocollo #3235 - 01). Tutti gli studi sono effettuati in conformità con le raccomandazioni della Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health ("la guida"); gli animali sono stati assegnati agli studi.

1. arricchimento di CD34+ HSPCs e cultura durante la notte (giorno -1)

  1. BM di prelievo e condizionarla.
    1. Mobilitare NHPs con fattore distimolazione del granulocyte (GCSF) per 4 giorni come descritto in precedenza26.
    2. Sedare gli animali con 100 mg/kg di ketamina e 0,03 mL/kg di dexmedetomidina (0,5 mg/mL di brodo). Somministrare analgesici (ad es., SR di buprenorfina) al momento del sorteggio.
    3. Utilizzando clippers, radere i capelli dell'animale dall'estremità prossimale dell'omero e/o femore bone(s) e strofinare la pelle con scrub iodato o una simile soluzione antisettica, alternativa con l'alcol e ripetere 3x. Come ulteriore anestetico, infondere il periostio con bupivacaine (2 mg per ogni sito, 5 mg/mL di brodo).
    4. Posizionare l'ago di aspirazione del midollo osseo (16 G) sopra il sito di entrata periosteal (cavità midollare) e forare la pelle, penetrando la cavità midollare con un movimento rotatorio. Rimuovere il mandrino dell'ago aspirazione e prenotarla in un campo sterile per un ulteriore uso.
      Nota: Scegliere il sito periosteal entrata alla cavità midollare in un'area dell'osso che non è coperto dai muscoli e dove il forma/paesaggio dell'osso sia visibile o può essere sentito facilmente attraverso la pelle (comunemente verso l'estremità prossimale o distale dell'osso).
    5. L'ago di BM, collegare una siringa preriempita contenente una miscela di soluzione di destrosio dell'anticoagulante citrato (ACD-A) e l'eparina (20 USP/mL, 1 mL / 9 mL di midollo da raccogliere).
    6. Tirare indietro lo stantuffo mentre delicatamente a dondolo l'arto e ruotandolo, per agitare la siringa per mescolare aspirato e anticoagulante. Ruotare l'ago e riposizionarla in tutto l'aspirazione e il ritiro per accedere una percentuale maggiore di cellule all'interno dello spazio del midollo.
    7. Una volta che il campione è raccolto, rimuovere l'ago e applicare una pressione sul sito di aspirazione fino a quando l'emorragia si ferma.
      Nota: A seconda del volume necessario, del midollo osseo da uno a quattro arti (due omeri, due femori) può essere disegnato durante una singola raccolta. Non più di 20 mL devono essere raccolti da ogni arto, e il volume totale raccolto deve costituire non più del 10% del peso dell'animale (10 mL/kg).
    8. Se ricevi gli aspirati da più arti, combinare e registrare il volume.
    9. Lasciate che la Postanestesia recuperare NHP.
      1. Invertire gli effetti della dexmedetomidina con atipamezolo 0,03 mL/kg (5 mg/mL di brodo) dopo la procedura. Fornire analgesici (ad es., SR di buprenorfina) come prescritto dal personale clinico veterinario per almeno 48 h dopo la procedura o più, a discrezione del veterinario clinico, si basa sui segni clinici.
      2. Restituire l'animale alla sua gabbia a casa dopo la procedura e monitorarlo ogni 15-20 minuti, fino a quando l'animale è in grado di sedersi una propria. Monitorare l'animale ogni giorno dal personale veterinario fino a quando viene stabilito che i siti di aspirazione sono guariti. Inoltre, monitorare eventuali segni di infiammazione, infezione o dolore.
    10. In parallelo alla lavorazione delle celle, condizionano il NHP stesso con myeloablative irradiazione corporea totale (TBI): 1.020 cGy a una velocità di 7 irradiazione cGy/min amministra in dosi frazionate durante i 2 giorni prima dell'infusione delle cellule.
  2. Hemolyze BM.
    1. Dividere il BM in provette coniche da 50 mL (10-12 mL per tubo) e aggiungere emolitico tampone per portare il volume a 50 mL (tabella 1). Incubare le cellule a temperatura ambiente (TA) fino a quando sono lisate ma non più di 7 min. centrifuga a 800 x g per 5 min e aspirare il supernatante dal pellet(s), lasciando 2-5 mL di volume/tubo. Risospendere il pellet nel volume residuo.
      Nota: Campioni con successo lisati cambiare colore, dal rosso scuro al rosso chiaro trasparente.
    2. Aggiungere 10-15 mL di tampone emolitica/pellet. Rimuovere eventuali coaguli di sangue utilizzando filtri di cella 70 µm. Aggiungere emolitica buffer fino a 50 mL, incubare per 5 min a RT e spin a 800 x g per 5 min.
    3. Aspirare il supernatante e risospendere le cellule in 10 mL di tampone di MACS (tabella 1). Filtrare nuovamente attraverso un colino di cella di 70 µm. Sciacquare il tubo e il filtro con 40 mL di MACS tampone fino a 50 mL.
  3. Arricchire il CD34 cellule di+ da emolizzati globuli bianchi (WBCs) utilizzando protocolli standard.
    1. Girare le cellule a 800 x g per 15 min. Check i tubi per assicurarsi che nessun turbinii di cella sono evidenti in alto/medio. Se le cellule sono presenti di sopra del pellet, girare di nuovo a una velocità maggiore (fino a 1.000 x g massimo) e per fino a 10 min.
    2. Aspirare il supernatante e risospendere le in 10 mL o meno di buffer di MACS, notando l'esatto volume. Contare le celle a una diluizione 1: 100 o 1:1,000 utilizzando un contatore automatizzato delle cellule o un emocitometro.
      Nota: Questo totale conteggio di WBC è il pre-arricchimento.
    3. Aggiungere tampone di MACS a ridurre la concentrazione di cellule a 1 x 108 cellule/mL. Se necessario, prima di ripetere i passaggi 1.3.1 - 1.3.2 (ad esempio, a causa di un basso conteggio di pre-arricchimento). Riserva di 5 x 106 cellule nel buffer di MACS per sottoinsieme HSC macchiatura (pre-arricchimento campione).
    4. Aggiungere le restanti celle di pre-arricchimento a una concentrazione finale di 40 µ g/mL (1 x 108 cellule/mL) non coniugata anti-CD34 anticorpo (clone 12.8, Tabella materiali)27 . Incubare la sospensione cellulare a 4 ° C in un rotatore del tubo (Vedi la Tabella materiali) per 25-30 min.
    5. Tampone di MACS di uso per portare il volume a 50 mL e filare le cellule a 800 x g per 5 min. aspirare il supernatante, risospendere le cellule in 50 mL di buffer di MACS e spin nuovamente a 800 x g per 5 min.
    6. Degas 100 mL di tampone di MACS con due tubi filtro, avvolgendo la presa d'aria con carta oleata, per 25-30 minuti o fino a pronto all'uso.
    7. Calcolare il volume necessario di biglie magnetiche: 1 mL di perline/109 celle. Aspirare il supernatante e risospendere le cellule a 108 cellule/mL, dopo aver aggiungono le perline. Ad esempio: 3 x 109 celle + 3 mL di perline + 27 mL di MACS tampone a 30 mL di volume totale.
    8. Incubare la sospensione cellulare a 4 ° C in un rotatore tubo per 25-30 min.
    9. Acquisiscono, nel corso, magneti per le colonne; intende utilizzare 0,6 x 109 celle per ogni colonna. Posizionare le colonne sul magnete e posizionare una provetta conica da 50 mL sotto ogni colonna per raccogliere il flusso attraverso. Preparare una provetta conica da 15 mL e lo stantuffo per ogni colonna per eluizione (passo
    10. Quando l'incubazione nel passaggio 1.3.8 è completa, aggiungere il buffer di MACS a 50 mL e spin a 800 x g per 5 min. aspirare il supernatante e risospendere le cellule in tampone di MACS degassato (2 mL per ogni colonna). Pipettare delicatamente per evitare di introdurre bolle.
    11. Senza consentire la colonna di funzionare a secco, aggiungere 1 mL di tampone di MACS degassato a ogni colonna, seguita da 2 mL di sospensione cellulare. Risciacquare il filtro e il tubo originale con buffer di MACS degassato e dividere la soluzione equamente tra le colonne (6 mL/colonna); quindi, aggiungere 7 mL di tampone di MACS degassato per il lavaggio finale.
    12. Delicatamente tirare la colonna lontano il magnete (riportare la superiore) e raccogliere l'ultima goccia nel tubo di flusso continuo. Aggiungere 5 mL di buffer di MACS degassato a ogni colonna e applicare lo stantuffo per eluire le cellule nella provetta conica sterile dal punto 1.3.9. Non raccogliamo alcun liquido dopo le bolle appaiono.
  4. Contare le celle in entrambi l'arricchito e provette flusso continuo (FT) con un rapporto di diluizione di 01:10. Mantenere le cellule sul ghiaccio. Aliquotare 1 x 106 cellule dalla frazione arricchita di CD34 e 5 x 106 cellule dalle frazioni FT per l'analisi di citometria a flusso. Memorizzare la frazione FT a 4 ° C fino a quando il controllo di qualità (passaggio 2) è concluso.
    Nota: Il numero di CD34+ cellule necessarie per riuscito engraftment multilineare nel NHP è dipendente dalla frequenza dell'arricchita di HSC CD34+CD90+CD45RA sottoinsieme– . Basato su una frequenza media di 3-5% e il requisito minimo di 122.000 CD34++CD45RA CD90– cellule per chilogrammo di corpo peso1, è consigliato di procedere con un totale di almeno 2,5 x 106 e fino a 10 x 10 6 CD34+ cellule per chilogrammo di peso corporeo.
  5. Aggiungere Mac buffer per il CD34+ arricchito di frazione a una 50 mL in totale, girare a 800 x g per 5 min, aspirare il supernatante e risospendere le cellule a 106 cellule/mL in media HSPC (tabella 1).
    1. Le cellule ad una densità di 106 cellule/mL in ventilato, coltura del tessuto (TC) del piatto-trattati boccette di T-75, 10-20 mL per fiaschetta e incubare per una notte in un 37 ° C, 5% CO2 incubator. Riposare le beute longitudinalmente (non in piedi).
      Nota: Se lo si desidera, ulteriori CD34+ cellule o CD34– FT possono essere crioconservati in 90% inattivati siero bovino fetale (FBS) + 10% di dimetilsolfossido (DMSO) ad una concentrazione di 1 x 106 a 5 x 106 cellule/mL, quindi rallentare-raffreddato a - 80 ° C (ad es., utilizzando contenitori di congelamento). Il rendimento di recupero medio di cellule crioconservate è dipendono il CD34+ purezza e comunemente varia dal 50% al 80% con una vitalità di > 80%.

2. controllo di qualità delle cellule CD34-arricchito (giorno -1)

  1. Preparare i campioni per citometria a flusso.
    1. Risospendere i campioni riservati da ogni fase di isolamento cui sopra (pre-arricchimento, FT e frazioni arricchite di CD34) nel buffer di FACS ad una concentrazione di 10 x 106 cellule/mL e trasferire 100 µ l di ogni sospensione di cellule (tabella 1) in una provetta di FACS.
      Nota: Campioni di controllo dovrebbero includere celle non macchiate da ogni fase di isolamento (ad es., cellule di 5 x 105 ) per la regolazione di forward scatter (FSC), side scatter (SSC) e autofluorescenza in ciascun canale di fluorescenza. Inoltre, perle di singolo-macchiato compensazione per ogni anticorpo coniugato fluorocromo saranno necessario regolare per la compensazione tra canali adiacenti (tabella 2 e tabella 3).
    2. Aggiungere gli anticorpi desiderati (ad es., anti-CD45, anti-CD34, anti-CD45RA e anti-CD90), secondo le istruzioni del produttore, per un test (1 x 106 cellule in 100 µ l) (tabella 3). Incubare per 20 min a 4 ° C. Aggiungere 3 mL di buffer di FACS e spin a 800 x g per 5 min, aspirare il supernatante, risospendere in 100 µ l di tampone di FACS e analizzare su un citometro a flusso appropriato (punto 2.2).
  2. Preparare il classificatore del citometro/celle di flusso per l'analisi.
    Nota:     si consiglia di eseguire l'analisi sullo stesso computer che verrà utilizzato per cella ordinamento al punto 2.3.
    1. Generare un protocollo tra cui FSC/SSC, CD45/CD34 e CD45RA/CD90 (tre appezzamenti di flusso). Pulsante destro del mouse su un diagramma di flusso e aggiungere il layout di gerarchia di popolazione .
    2. Sinistro del mouse sulla trama del FSC/SSC, selezionare la funzione di gate di poligono e disegnare un cancello per escludere detriti e cellule morte. Evidenziare il nuovo cancello e rinominarlo in dispersione nella finestra dell'ispettore.
      Nota: Questo è automaticamente definito come P1.
    3. Pulsante destro del mouse al centro della trama del flusso CD45/CD34, passare per mostrare le popolazionie la trama sulla dispersione del cancello. Disegnare un cancello rettangolare intorno il CD45intCD34+ cellule per escludere non-CD34 e cellule non emopoietico, come bene come residuo delle piastrine e degli eritrociti (CD45–). Rinominare il cancello per CD34+.
    4. La trama di flusso CD45RA/CD90 sul CD34 del cancello+ popolazione. Disegnare tre subgates indipendente intorno CD90+CD45RA cellule– (arricchite per HSCs), CD90–CD45RA cellule– (arricchite per progenitori multipotenti ed eritro-mieloidi [MPPs/EMPs]) e CD90–CD45RA + cellule (arricchite per lympho-ematologico [LMPs]). Rinominare i cancelli HSC, MPP-EMPe LMP, rispettivamente.
    5. Al termine, assicurarsi che la gerarchia di popolazione contiene sei voci gerarchicamente organizzate nel seguente ordine: 1) tutti gli eventi; 2) dispersione; 3) CD34+; 4) HSC; 5) MPP-EMP; 6) LMP. Garantire che i diagrammi di flusso e la forma del cancello guardare come illustrato nella Figura 4.
    6. Eseguire non macchiati pre-arricchimento globuli bianchi per regolare la tensione per FSC, SSC e tutti i canali di fluorescenza (tabella 2, esempio 5). Eseguire perline singolo-macchiato compensazione per regolare la compensazione tra canali adiacenti (tabella 2, campioni: 1-4). Esegui tutte le restanti senza macchia e macchiato campioni con il rettificato e compensato protocollo, per documentare l'efficienza di arricchimento di CD34 (tabella 2, campioni 6-9).
      Nota: Mantenere il campione finale (tabella 2, esempio 10) per l'analisi simultanea di flusso e cell sorting al punto 2.4.
  3. Configurare il classificatore celle per la purificazione di sorta di sottoinsiemi di CD34 in saggi formanti colonie di cellulare (CFC).
    Nota:     se una macchina diversa è stata utilizzata per l'analisi (punto 2.2), impostare il protocollo ordinatore delle cellule come precedentemente descritto nella procedura 2.2.1 - 2.2.5.
    1. Regolare l'angolo/tensione per i flussi di sinistra e destra nel software cell sorter di depositare le cellule in provette da 15 mL contenenti CFC mezzo. Configurare l'angolo del flusso per prevenire il disassamento laterale. Graduale, regolare l'angolazione del flusso deviato lato fino a quando le cellule ordinate colpito il mezzo di CFC e non il lato del tubo perché molto poche cellule sono ordinate.
    2. Nel Browser, aprire la cartella di fogli di lavoro globale e creare un nuovo ordinamento-layout utilizzando il pulsante nel menu in alto della finestra del Browser. Modificare la voce nel menu a discesa dispositivo di raccolta per 2 tubi, la voce nel menu a discesa precisione a 4 vie purezza o singola cella e impostare gli eventi Target 800-1.200 celle. Cliccare sul campo di ordinamento-percorso (a sinistra o a destra), selezionare la voce Aggiungi nel menu e scegliere la popolazione per ordinare dal menu.
  4. Ordinare le celle per i dosaggi CFC.
    Nota:     l'ordinamento per i dosaggi CFC viene eseguita solo con cellule dal prodotto CD34-arricchito (tabella 2, esempio 10).
    1. Caricare un esempio 10, registrare eventi di 2.000-3.000 e regolare con precisione i cancelli di sorta per adattare le popolazioni segnale di forza e di destinazione.
    2. Quando l'installazione è completa, acquisire le cellule (tabella 2, esempio 10). Acquisire dati come descritto al punto 2.2.3, regolare la portata a 500-1.000 cellule/s e ordinare celle di 800-1.200 da i) il cancello di Scatter, ii) il CD34+ cancello, iii) il cancello HSC, iv) il cancello MPP-EMP e v) il cancello LMP in provette separate contenenti 3,6 mL di CFC mezzi di comunicazione.
      Nota: Ordinamento per dosaggi CFC viene eseguita solo con cellule dal prodotto CD34-arricchito (tabella 3, esempio 10). Le cellule dalla dispersione e CD34+ cancelli devono essere ordinati singolarmente, considerando che HSCs, MPP-EMPs e LMPs possa essere ordinata contemporaneamente nella posizione di titolare del tubo destro e sinistro.
    3. Vortice e dispensare 1 mL di sospensione cellulare a ciascuno il nontissue sterile, 3 x 3.5 cm, cultura-trattati di Petri. Incubare le cellule a 37 ° C per 10-14 giorni in un contenitore secondario (ad esempio, un 15cm di Petri).
    4. Giorni 10-11 postplating, contare diverse colonie da tutte le tre piastre per condizione, basata sulla morfologia di Colonia.

3. Gene modifica di CD34+ HSPCs e recupero durante la notte (giorno 0)

  1. Diluire 2,5 mL di 1 µ g / µ l di soluzione di CH-296 a 50 µ g/mL in 50 mL di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS, vedere la Tabella materiali).
  2. Preparare boccette per la trasduzione di LV.
    1. Determinare il numero approssimativo di nontissue-cultura (non-TC)-trattati boccette necessari (solitamente dai conteggi delle cellule determinati nel passaggio 1.4). Prevede di 1 x 107 cellule in 10 mL di media per fiaschetta T-75 del piatto (1 x 108 cellule totali richiederebbe 10 boccette) e includere una non-TC-trattati 12-pozzetti piastra (condizione di trasduzione finto). Aggiungere HBSS sterile e 50 µ g/mL di brodo di CH-296 dal passaggio 3.1 per ogni pallone/piastra, ad una concentrazione di 2 µ g/cm2. Per beute T-75, uso 3 mL di 50 µ g/mL di CH-296 + 7 mL di HBSS; per la piastra 12-pozzetti, utilizzare 160 µ l di 50 µ g/mL CH-296 + 340 µ l di HBSS per pozzetto.
    2. Consentire i piatti per sedersi indisturbato a RT su un banco pulito o nella cappa per 2 h. aspirato il CH-296 e sostituirlo con un simile volume di sterile HBSS + 2% albumina di siero bovino (BSA). Incubare a temperatura ambiente per 30 min, HBSS/BSA di aspirare e lavare i piatti con un simile volume di HBSS sterile contenente 2,5% 1 M HEPES, pH 7.0. Aspirare immediatamente prima della placcatura le cellule (punto 3.4).
      Nota: Seguito passo 3.2.2, non consentono le piastre/beute ad asciugare. Piastre contenenti sterile HBSS + 2,5% 1 M HEPES sono tenuti a 4 ° C durante la notte (cioè, preparare il giorno -1).
  3. Raccolto e trasdurre il CD34+ cellule dal giorno -1.
    1. Utilizzando una pipetta 10ml, risciacquate le cellule aderenti senza bloccare il risciacquo delicato, ripetute di ciascun matraccio di cultura con HBSS sterile. Assicurarsi che tutte le celle si staccano (se necessario, toccare/schiaffo la beuta per allentare le cellule).
    2. Centrifugare le cellule a 800 x g per 5 min, aspirare il supernatante e risospendere le cellule in media di trasduzione per una concentrazione di 1 x 106 cellule/mL. Una volta che tutte le cellule sono state raccolte, determinare il numero di celle, utilizzando un emocitometro o contatore di cellule automatizzato.
    3. Aggiungere 1 mL di sospensione cellulare (1 x 106 cellule) in un pozzetto della piastra 12-pozzetti CH-296-coated (per il campione di controllo trasdotte mock). Dividere il resto delle cellule fra le beute T-75 (punto 3.2.2), aggiungere circa 10 mL (1 x 107 cellule) per fiaschetta. Permettono alle cellule di aderire al rivestimento dei CH-296 di incubazione a 37 ° C, 5% CO2 per 30 minuti, con i tappi di sfiato.
    4. Scongelare i supporti virus-condizionato (VCM, Tabella materiali) e determinarne il titolo in unità infettive per millilitro (IU/mL)28,29,30,31,32 . Il volume appropriato di VCM in ciascuna beuta, T-75 dal punto 3.3.3 ed incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO2.
      Nota: Se si esegue un singolo trasduzione, incubare per una notte; Se si esegue un doppio trasduzione, ripetere questo stepapproximately 6 - 8 h dopo la trasduzione prima senza un lavaggio/recupero di fase e, quindi, incubare per una notte. Ad esempio, per una boccetta (1 x 107 cellule) con una molteplicità di desiderata di infezione (MOI) di 10, aggiungere 1 mL di virus titolato a 1 x 108 IU/mL.

4. raccolta e preparazione per infusione (giorno 1) delle cellule

  1. Raccogliere le cellule.
    1. Raccogliere le cellule trasdotte e finte come descritto nei passaggi 3.3.1 - 3.3.2. Eseguire lavaggi sequenziali con 10 mL di HBSS, trasferendo i lavaggi al tubo conico con le cellule. Garantire che tutte le celle sono stati rimossi dai palloni, maschiatura/schiaffeggiando le beute, se necessario.
    2. Centrifugare le sospensioni delle cellule a 800 x g per 5 min, aspirare il supernatante e risospendere il pellet in 1 mL di HBSS. Combinare le provette contenenti cellule dalla stessa condizione. Risciacquare ciascuno con 10 mL di HBSS, aggiungere che alla sospensione di cellule. Determinare i conteggi delle cellule usando un emocitometro. Portare il volume totale delle cellule a 50 mL in HBSS e centrifuga a 800 x g per 5 min.
  2. Impulso della prostaglandina E2 (PGE2) e preparare i reagenti per il prodotto di infusione.
    1. Aspirare il supernatante e risospendere le cellule trasdotte (non finto) a 5 x 106/ml in media HSPC senza citochine. Aggiungere 10 mM PGE2 a una concentrazione finale di 10 µM. Incubare le cellule sul ghiaccio per 2 h, li raggiunga ogni 30 min.
    2. Durante il passaggio 4.2.1, calore-inattivare siero autologo (Tabella materiali), avvolgendo il contenitore in carta oleata e incubando esso a 56 ° C per 30 min. preparare il siero autologo 2% nel mix HBSS (500 µ l di siero inattivato con calore + 24,5 mL di HBSS), bene, e conservare la miscela sul ghiaccio fino all'utilizzo. Inoltre, durante il passaggio 4.2.1, vendemmia cellule trasdotte mock in una piastra 12-pozzetti a pipettare vigorosamente le celle su e giù. Aggiungere la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 mL, lavarli 3 volte con 1 mL di HBSS e aggiungere i lavaggi per lo stesso tubo conico da 15 mL.
    3. Dopo 2 h di incubazione di PGE2, lavare le cellule 2 x da loro centrifugazione a 800 x g per 5 min e scartare il surnatante. Dopo il secondo lavaggio, risospendere le cellule in un volume adeguato di HBSS per il conteggio, utilizzando un contatore automatizzato delle cellule o un emocitometro.
      Nota: Le cellule si aggregano frequentemente dopo un impulso di PGE2, che può fare per i conteggi delle cellule meno affidabili. In questo caso, è possibile utilizzare il conteggio delle cellule dal punto 4.1.2 invece di quello dal punto 4.2.3.
  3. Riserva di cellule trasdotte e finte per il controllo di qualità (passo 5) del prodotto infusione: 5 x 105 a 1 x 106 cellule di flusso cytometry/cella ordinamento (punti 5.1 e 5.3) e circa 1 x 106 cellule per coltura liquida (punto 5.2) e Colonia reazione a catena della polimerasi (PCR) (punto 5.4).
  4. Preparare il prodotto di infusione.
    1. Con il resto delle cellule trasdotte, eseguire un terzo lavaggio in 50 mL di HBSS, aspirare il supernatante e risospendere le cellule in 10 mL di HBSS + 2% siero autologo (preparata al punto 4.2.2). Disegnare i 10 mL di soluzione in una siringa da 20 mL con ago 16,5 G. Lavi il tubo con 10 mL di HBSS + 2% auto siero e disegnare il lavaggio nella stessa siringa per portare il volume totale a 20 mL. Cap la siringa con il cappuccio dell'ago, etichetta della siringa e posizionarlo sul ghiaccio per trasporto/infusione.
    2. Infondere il prodotto delle cellule trasdotte in host autologo, che si trova all'interno di una struttura di ricerca animale accreditati, tramite un catetere venoso centrale33,34. Monitorare i conteggi di globulo completi degli animali trapiantati (CBCs) ed ematochimici ed eseguire specifici dello studio del gene-marcatura saggi su misura per il progetto1,6,19.

5. controllo di qualità

Nota: Il flusso cytometry e ordinamento delle cellule vengono eseguite dopo che le cellule sono infusi negli animali come parte del follow-up descritto al punto 4.4.2. Flusso cytometric dati viene utilizzati immediatamente dopo trapianto per determinare la composizione di fenotipico definita sottoinsiemi di cellule staminali e progenitori del prodotto di infusione (punti 5.1 e 5.3), mentre viene eseguita l'analisi dei dosaggi CFC 12-14 giorni postinfusion per determinare l'efficienza di modificazione genetica di Colonia PCR (punto 5.4).

  1. Eseguire il flusso cytometry e CFC cernita del prodotto infusione.
    1. Analizzare le cellule tramite flusso cytometry e purificare sorta CD34 sottoinsiemi per i dosaggi CFC, come descritto nella sezione 2. Seme CFC dosaggi da finte e trasdotte cellule CD34 (il prodotto di infusione dopo l'impulso di PGE2).
    2. Ordinare un massimo di 800 cellule per condizione e vortice, piastra, cultura e contare le analisi CFC come descritto al punto 2.4. Dopo il conteggio, scegliere le colonie dai dosaggi CFC per eseguire PCR come descritto al punto 5.4 della Colonia.
  2. Coltura liquida
    1. Celle di piastra per coltura liquida in media HSPC a 1 x 106/ml nelle piastre non-TC-trattati. Il posttransduction giorni 2, 5 e 12, raccogliere e contare le celle per citometria a flusso. Cella ordinamento per dosaggi CFC non è necessaria.
    2. Nei giorni 2 e 5, replate 33% delle cellule nei media HSPC freschi a 1 x 106/ml. Congelare il 33% delle cellule nel tampone di estrazione del DNA per PCR quantitativa in tempo reale. Utilizzare il 33% delle cellule per citometria a flusso come descritto ai punti 2.1 e 2.2.
    3. Utilizzare questi dati dal passaggio 5.2.2 per analizzare la composizione fenotipica della progenie ematopoietico. Determinare la frequenza di cellule CD34 + e subset fenotipico definiti come descritto al punto 2.2.2 all'interno di ogni campione. Confrontare la composizione di CD34+ cellule tra le condizioni per determinare l'effetto della modificazione genetica.
      Nota: CD34+ cellule devono mantenere la loro espressione in tutta l'intera cultura e contengono tutti i sottoinsiemi fenotipici. Una perdita di CD90+CD45RA– cellule o una sovrarappresentazione dei sottoinsiemi fenotipiche può indicare gli effetti diretti o indiretti di modificazione genetica.
  3. Quantificare l'espressione del transgene (ad es.., verde fluorescente proteine [GFP]) tramite flusso cytometry (opzionale e a seconda dell'impostazione sperimentale), adattando il protocollo dal punto 2.2.
    1. Aggiungere tre appezzamenti di flusso Risultati SSC/transgene (ad es., SSC/GFP). Cancello il primo appezzamento HSCs, la seconda su MPPs-EMPs e il terzo il LMPs. trama ogni transgene contro (ad es., GFP) e creare porte denominate HSC-GFP+, MPP-EMP-GFP+e LMP-GFP+, rispettivamente.
    2. Al termine, la gerarchia di popolazione deve contenere nove voci gerarchicamente organizzate nel seguente ordine: 1) tutti gli eventi; 2) dispersione; 3) CD34+; 4) HSC; 5) HSC-GFP+; 6) MPP-EMP; 7) MPP-EMP-GFP+; 8) LMP; 9) LMP-GFP+.
      Nota: Qualsiasi espressione del transgene più tardi in coltura liquida (ad esempio, giorni 5 e 12) rispecchieranno meglio l'efficienza di modificazione gene determinata dalla PCR della Colonia al punto 5.4. Punti di tempo precedenti nella coltura liquida possono sovrastimare l'espressione del transgene, a causa di LVs imperfetta. Allo stesso modo, l'ordinamento flusso di cellule GFP+ per dosaggi CFC il giorno 1 si tradurrà in molte colonie di falsi positivi.
  4. Eseguire PCR della Colonia.
    1. Dopo il conteggio nei passaggi 2.4.4 e 5.1.1, scegliere singole colonie in 50 µ l di tampone di estrazione del DNA, utilizzando un µ l 10 o 20 µ l pipetta e pipetta su e giù per trasferire le colonie a un tubo di una PCR 8-tubo striscia tappo. Scegliere otto colonie dalla condizione di finto e 88 colonie dalla condizione trasdotte per generare un completo 96 pozzetti. Aggiungere 50 µ l di tampone di estrazione del DNA ad ogni pozzetto.
    2. Estrarre il DNA dalle colonie, utilizzando un termociclatore e il seguente programma: 65 ° C per 20 minuti e 99 ° C/10 min a 4 ° C tenere. Prevede di spostare il DNA a-20 ° C più presto per una qualità ottimale.
    3. Eseguire la PCR per quantificare le cellule trasdotte LV, confrontando il numero di colonie di LV+ , utilizzando primers Lenti F/R, alle colonie totale, utilizzando primers actina F/R e controllo (Tabella materiali) della Colonia.

Risultati

Il protocollo descritto sopra è stato progettato per isolare e gene-modificare NHP CD34+ HSPCs, che può successivamente essere infuso nuovamente dentro l'host autologo (Figura 1 e Figura 2). Quando seguendo questo protocollo, abbiamo solitamente ottenere fino a 8 x 109 totali globuli bianchi da BM innescata da macachi pigtail e, a volte, raddoppiare tale importo da macachi rhesus. In entrambe le specie, il...

Discussione

Vettore di LV ingegneria è il metodo migliore-caratterizzato da gene-modificare tipi cellulari come CD34+ HSPCs, per il successivo trapianto in vivo. Il protocollo descritto qui è stato progettato per massimizzare il numero di HSPCs gene-modificato che persistono a lungo termine in vivo e fornire benefici clinici ai pazienti con varie malattie maligne, infettive e genetiche. Anche se le strategie di modifica del gene sono emerse nell'ultimo decennio, LV-modificato cellule sono i migliori studiato in vitro, n...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Riconoscimenti

Gli autori ringraziano Helen Crawford per la preparazione di questo manoscritto, la Jim Woolace per la progettazione grafica e la Veronica Nelson e la Devikha Chandrasekaran per partecipare allo sviluppo del protocollo. Lo sviluppo di questo protocollo è stato sostenuto da sovvenzioni da NIH National Institute of Allergy e malattie infettive (R01 AI135953 e AI138329 a H.P.K.) e il National Heart, Lung e Blood Institute (R01 HL136135, HL116217, P01 HL122173 e U19 HL129902 a H.P.K.), come pure di NIH P51 OD010425 e, in parte attraverso il NIH/NCI Cancer Center, supporto Grant P30 CA015704. H.P.K. è un ricercatore di medicina molecolare Markey e ricevuto sostegno come destinatario inaugurale della José Carreras/E. Donnall Thomas dotata di sedia per ricerca sul cancro e la sedia dotata di Fred Hutch per cella e Gene Therapy.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Stemspam SFEM II ("HSPC") MediaStemCell09655
Hank's Balanced Salt SolutionGibco14175095
Phosphate-Buffered SalineGibco14190-144
Penicillin/StreptomycinGibco15140-122
Dimethyl SulfoxideSigma AldrichD2650-100
100% EthanolDecon labsM18027161M
CyclosporineSigma30024-25MG
500 mM EDTAInvitrogen15575-038
Heat-Inactivated Fetal Bovine SerumSigma AldrichPS-0500-A
CH-296/ RetroNectin (2.5 mL, 1 µg/µL)TaKaRAT100B
Bovine Serum AlbuminSigmaA7906-100g
HEPESSigmaH9897
Rat anti-mouse IgM magnetic beadsMiltenyi Biotec130-047-301
Recombinant HumanStem Cell Factor (SCF)Peprotech300-07
Recombinant Human Thrombopoietin (TPO)Peprotech300-18
Recombinant Human FMS-like tyrosine kinase 3 (FLT-3)Peprotech300-19
Protamine sulfateSigmaP-4505
14 mL Polypropylene Round-Bottom TubeCorning352059
Colony Gel 1402ReachBio1402
QuadroMACS SeparatorsMiltenyi Biotec130-090-976
MACS L25 ColumnsMiltenyi biotec130-042-401
10 mM PGE2Cayman Chemical14753-5mg
TC-treated T-75 flasksBioexpressT-3001-2
Non-TC-treated T-75 flasksThermo-Fisher13680-57
20 mL syringesBD Biosciences302830
16.5 G needlesBD Precision305198
Syringe Tip CapBD Biosciences305819
QuickExtract DNA SolutionEpicentreQE09050
8-tube strip cap PCR TubesUSA scientific1402-2708
96-well ThermocyclerThermo-Fisher4375786
Pre-Separation filtersMiltenyi Biotec130-041-407
Strainer, Cell; BD Falcon; Sterile; Nylon mesh; Mesh size: 70um; Color: white; 50/CSfisher scientific352350
Ultracomp ebeadseBioscience01-2222-42
MACSmix Tube RotatorMiltenyi130-090-753
3 mL Luer-Lock SyringesThermo-Fisher14823435
35 mm x 10 mm cell culture dishCorning430165
60 mm x 15 mm cell culture dishCorning430196
150 mm x 25 mm cell culture dishCorning430599
Non TC treated flasksFalcon353133
Qiagen DNA extractionQiagen51104
PE Anti-Human CD90 (Thy1) Clone:5E10Biolegend328110
PE-CF594 Mouse Anti-Human CD34 Clone:563BD horizon562449
APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone: 5H9BD Pharmingen561212
V450 Mouse Anti-NHP CD45 Clone:d058-1283BD Biosciences561291
Autologous SerumCollected from autologous host and cryopreserved prior to mobilization and collection of CD34+ HSPCsN/ABeard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).
Virus-Conditioned Media (VCM)Kiem Lab, FHCRC Co-operative Center for Excellence in Hematology (CCEH)N/ABeard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).
Anti-CD34 antibody, Clone 12.8Kiem LabN/ABeard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).
Lenti F primer: AGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAIntegrated DNA TechnologiesN/APeterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).
Lenti R primer: TGCCTTGGTGGGTGCTACTCCTAAIntegrated DNA TechnologiesN/APeterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).
Actin F primer: TCCTGTGGCACTCACGAAACTIntegrated DNA TechnologiesN/APeterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).
Actin R primer: GAAGCATTTGCGGTGGACGATIntegrated DNA TechnologiesN/APeterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).

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