JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

والهدف من هذا البروتوكول إظهار كيفية حمل الثغور متفاوت المسافات في cotyledons شتلات نبات التمويل بمعاملة الغمر بمحلول متوسطة المحتوية على السكر وكيفية مراقبة هياكل داخل الخلايا مثل المعايشة والليزر microtubules في الخلايا الحرس متفاوت المسافات باستخدام [كنفوكل] مجهرية.

Abstract

حركة stomatal يتوسط تبادل الغازات في النبات، هو أمر ضروري لعملية التمثيل الضوئي والرشح. ستوماتال فتح وإغلاق يتم إنجازه بزيادة كبيرة وانخفاض في حجم الخلية الحرس، على التوالي. نظراً لحدوث النقل المكوكية من الأيونات والماء بين خلايا الحرس وخلايا البشرة المجاورة أكبر أثناء حركة ستوماتال، يعتبر توزيع الثغور النباتية متباعدة توزيع أمثل لحركة ستوماتال. نظم تجريبية لزعزعة نمط متباعدة من الثغور مفيدة لدراسة أهمية على نمط تباعد. وقد حددت عدة الجينات الرئيسية المرتبطة بتوزيع ستوماتال متباعدة، والثغور متفاوت المسافات يمكن أن يتسبب تجريبيا بتغيير هذه الجينات. بدلاً من ذلك، يمكن أن يتسبب أيضا الثغور متفاوت المسافات بالعلاجات الخارجية دون التعديل الوراثي. في هذه المقالة، يصف لنا نظام تعريفية بسيطة الثغور متفاوت المسافات في شتلات نبات التمويل بمعاملة الغمر مع حل متوسطة التي تحتوي على السكروز. لدينا طريقة سهلة وتسري مباشرة على خطوط المحورة وراثيا أو المسخ. وترد المعايشة أكبر كعلامة مميزة خلية بيولوجية الناجمة عن السكروز خلايا الحرس متفاوت المسافات. وبالإضافة إلى ذلك، يظهر صورة مجهرية [كنفوكل] ممثل microtubules القشرية كمثال للمراقبة داخل الخلايا من خلايا الحرس متفاوت المسافات. يتم الاحتفاظ باتجاه شعاعي microtubules القشرية في مجمع الحرس الخلايا كما هو الحال في خلايا الحرس متباعدة في ظروف السيطرة.

Introduction

ستوما النباتات جهازا أساسيا لتبادل الغازات لعملية التمثيل الضوئي والرشح، وهو إنجاز حركة ستوماتال بتغييرات كبيرة في خلايا الحرس عن طريق امتصاص أيون يحركها والإفراج عن المياه. تحت مجهر، يمكننا أن نلاحظ نمط توزيع متباعدة من الثغور على أسطح الأوراق والسيقان. ويعتبر هذا التوزيع متباعدة من الثغور للمساعدة في حركة ستوماتال، والتي يتم تنظيمها بواسطة تبادل الأيونات والماء بين خلايا الحرس والمجاورة لخلايا البشرة1،2. نظم تعريفية تجريبية الثغور متفاوت المسافات مفيدة للتحقيق أهمية توزيع الثغور متباعدة.

وأفيد أن التكتل المكاني من الثغور يمكن أن يتسبب بالتعديل الوراثي للجينات الرئيسية لحراسة الخلية التمايز3،4 أو العلاج مركب الكيميائي5. كذلك أبلغنا أن تستكمل العلاج الغمر بمحلول متوسطة مع السكريات بما في ذلك السكروز، الجلوكوز، وتسبب سكر تجميع ستوماتال في كوتيليدونس من شتلات نبات التمويل 6. ولوحظ كالوسي انخفاض في جدران الخلايا الجديدة فصل ميريستيمويدس وخلايا البشرة في البشرة المعالجة السكروز كوتيليدون، مما يوحي بأن السكروز الحل الغمر العلاج يؤثر سلبا على جدار الخلية، مما يمنع التسرب و العمل خارج الرحم من منتجات الجينات الرئيسية لتمايز خلية الحرس (مثل عوامل النسخ) نحو المتاخمة البشرة الخلايا6. واقترح إليه مماثلة من الدراسات على gsl8/تشور طفرات7،8. لدينا نظام تجريبي لاستنساخه بتحريض من الثغور متفاوت المسافات باستخدام الحلول المتوسطة التي تحتوي على السكروز سهلة ورخيصة جداً. يمكن استخدامه أيضا التحقيق فيها الهياكل داخل الخلايا مثل العضيات وسيتوسكيليتون في خلايا الحرس متفاوت المسافات عند تطبيقه على خطوط المعدلة وراثيا معربا عن علامات نيون أن تسمية هياكل داخل الخلايا9، 10.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1-إعداد موراشيجي 1/2-سكوغ متوسطة 3% الحل التي تحتوي على السكروز

  1. إضافة 1.1 غ أملاح Murashige سكوغ المتوسطة و 15 ز السكروز إلى كوب.
  2. إضافة 490 مل ماء المقطر ويخلط جيدا باستخدام شريط إثارة.
  3. قم بضبط درجة الحموضة إلى 5.8 استخدام كوه.
  4. نقل الحل في زجاجة متوسطة وتمييع إلى 500 مل بالماء المقطر.
  5. تعقيم الحل بالتعقيم (121 درجة مئوية، 20 دقيقة). إذا لم تستخدم مباشرة، قد أبقى هذا الحل في 4 درجات مئوية بعد التعقيم.

2-تنظيم دورات تعريفية الثغور متفاوت المسافات التي تحتوي على السكروز الحل المتوسط الغمر العلاج

  1. تعقيم البذور.
    1. إعداد الحل التعقيم بإضافة 500 ميليلتر من 5% كلور نشط الحل ناكلو و 1 ميليلتر من 10% X-100 تريتون إلى 500 ميليلتر الماء المعقم.
    2. ضع ca. 50 المعدلة وراثيا بذور التمويل (أ) تحمل علامة نيون مثل CT-التجارة والنقل11 أو12 من TUB6 التجارة والنقل في أنبوب 1.5 مل.
    3. أضف 1 مل من محلول الإيثانول 70% ومزيج جيد بعكس خمس مرات. إجازة لمدة 1 دقيقة.
    4. سوف تنزل البذور إلى الجزء السفلي من الأنبوب. على مقاعد البدلاء نظيفة، بلطف إزالة الإيثانول 70% استخدام ميكروبيبيتي، وإضافة 1 مل من محلول التعقيم. مزيج جيد من قبل عكس خمس مرات، وتترك لمدة 5 دقائق.
    5. تغسل البذور. لا تزال تعمل تحت ظروف معقمة على مقاعد البدلاء نظيفة، بلطف إزالة الحل باستخدام ميكروبيبيتي، وإضافة 1 مل الماء المعقم. كرر هذه الخطوة من خمس مرات.
  2. إضافة 1.5 مل من تعقيم 3% يحتوي على السكروز 1/2 Murashige سكوغ المتوسط محلول لكل بئر من صفيحة 24-جيدا على مقاعد البدلاء نظيفة.
  3. إضافة اثنين من بذور معقمة في كل بئر. الشريط غطاء على لوح 24-جيدا باستخدام طبقتين من بارافيلم.
  4. نقل لوحة 24-جيدا لمجموعة دائرة نمو عند 23.5 درجة مئوية مع دورة الضوء الظلام 12-ح/12-ح استخدام µmol 100 م2 ق1 بيضاء خفيفة واحتضان لمدة 14 يوما.

3-الملاحظة مجهرية من الثغور متفاوت المسافات

  1. ميليلتر مكان 30 3% التي تحتوي على السكروز 1/2 Murashige سكوغ المتوسطة الحل من بئر لصفيحة 24-جيدا في وسط شريحة زجاجية (الحجم: 76 × 26 مم، سمك: 1.0-1.2 مم).
  2. إزالة كوتيليدون من شتلات عمره 14 يوما استخدام مقص تشريح. تطفو في كوتيليدون مع الجانب المراقبة مواجهة على إسقاط الحل.
  3. تحضير العينة كوتيليدون وفقا لأن الأسلوب السابق13. أساسا، بوضع 30 ميليلتر من الحل في وسط الزجاج غطاء (حجم: 18 × 18 مم، سمك: 0.12-0.17 ملم). اقلب الزجاج غطاء ووضعه على كوتيليدون برفق. تمحو الزائد المخزن المؤقت باستخدام أنسجة خالية من الوبر.
  4. تعيين عينة على مرحلة مجهر الليزر [كنفوكل] وحدد خلايا الحرس متفاوت المسافات للمراقبة باستخدام الإضاءة الحقل مشرق.
  5. الحصول على الصور [كنفوكل] هياكل داخل الخلايا فلوريسسينتلي توسم وفقا لإرشادات الشركة المصنعة المجهر.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

هنا، تم عرض البروتوكول المتعلق بأسلوب بسيط لحمل المجموعات ستوماتال مع الحل المتوسطة التي تحتوي على السكروز في التمويل ألف شتلة. خلايا الحرس متفاوت المسافات نمت في الحل المتوسط الذي يحتوي على السكروز (الشكل 1ب) لها المعايشة أكبر من خلايا الح?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

وقد قدمنا البروتوكولات لتحريض الثغور متفاوت المسافات في التمويل ألف شتلة بمعاملة الغمر مع حل متوسطة التي تحتوي على السكروز. كما هو موضح هنا، هذا الأسلوب بسيط جداً ويتطلب أي مهارة متخصصة لكن يمكن حمل كفاءة الثغور متفاوت المسافات. تتجمع أكثر من 45 في المائة خلايا الحرس مع 3% السكروز المح?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

ونحن ممتنون للبروفيسور سيشيرو هاسيزاوا على دعمه الكريم لعملنا. أيد هذا العمل المنح المقدمة من "الجمعية اليابانية" لأرقام كاكينهجرانت النهوض بالعلوم (JSPS) 17 ك 19380 ومنح 18 ح 05492، من مؤسسة سوميتومو للحصول على منح "مشاريع بحوث العلوم الأساسية" رقم 160146، و "مؤسسة كانون" T.H. ووضعت هذا النظام التجريبي تحت دعم المالي من عدد كاكينهجرانت JSPS 26891006 إلى أ. ك. ونحن نشكر روبي لويس، ماجستير، من مجموعة ادانز (www.edanzediting.com/ac) لتحرير مسودة للمخطوطة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
24-well plateSumitomo BakeliteMS-0824R
488 nm laserFurukawa DenkoHPU-50101-PFS2
488 nm laserOlympusSapphire488-20/O
510 nm long-pass filterOlympusBA510IF
524 - 546 nm band-pass filterSemrockFF01-535/22-25
530 nm short-pass filterOlympusBA530RIF
561 nm laserCVI Melles Griot85-YCA-025-040
604 - 644 nm band-pass filterSemrockFF01-624/40-25
Confocal laser scanning headYokogawaCSU10
Confocal laser scanning headOlympusFV300
Cooled CCD cameraPhotometricsCoolSNAP HQ2
Image acquisition softwareMolecular DevicesMetaMorph version 7.8.2.0
Image acquisition softwareOlympusFLUOVIEW v5.0
Immersion oilOlympusImmersion Oil Type-Fne = 1.518 (23 degrees)
Inverted microscopeOlympusIX-70
Inverted microscopeOlympusIX-71
Murashige and Skoog Plant Salt MixtureFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation392-00591Murashige T and Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15(3), 473-497.
Objective lens OlympusUPlanApo 100x / 1.35 NA Oil Iris 1.35NA = 1.35
Objective lens OlympusUPlanAPO 40x / 0.85 NANA = 0.85
SucroseFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation196-00015

References

  1. Raschke, K., Fellows, M. P. Stomatal movement in Zea mays: shuttle of potassium and chloride between guard cells and subsidiary cells. Planta. 101 (4), 296-316 (1971).
  2. Higaki, T., Hashimoto-Sugimoto, M., Akita, K., Iba, K., Hasezawa, S. Dynamics and environmental responses of PATROL1 in Arabidopsis subsidiary cells. Plant and Cell Physiology. 55 (4), 773-780 (2013).
  3. Bergmann, D. C., Sack, F. D. Stomatal development. Annual Review of Plant Biology. 58, 163-181 (2007).
  4. Pillitteri, L. J., Torii, K. U. Mechanisms of stomatal development. Annual Review of Plant Biology. 63, 591-614 (2012).
  5. Sakai, Y., et al. The chemical compound bubblin induces stomatal mispatterning in Arabidopsis by disrupting the intrinsic polarity of stomatal lineage cells. Development. 144 (3), 499-506 (2017).
  6. Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. Breaking of plant stomatal one-cell-spacing rule by sugar solution immersion. PLOS One. 8 (9), 72456(2013).
  7. Chen, X. Y., et al. The Arabidopsis callose synthase gene GSL8 is required for cytokinesis and cell patterning. Plant Physiology. 150 (1), 105-113 (2009).
  8. Guseman, J. M., et al. Dysregulation of cell-to-cell connectivity and stomatal patterning by loss-of-function mutation in Arabidopsis chorus (glucan synthase-like 8). Development. 137 (10), 1731-1741 (2010).
  9. Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. Cortical microtubules and fusicoccin response in clustered stomatal guard cells induced by sucrose solution immersion. Plant Signaling and Behavior. 13 (4), 1454815(2018).
  10. Akita, K., Hasezawa, S. Sugar solution induces clustered lips. Cytologia. 79 (2), 125-126 (2014).
  11. Holzinger, A., Buchner, O., Lütz, C., Hanson, M. R. Temperature-sensitive formation of chloroplast protrusions and stromules in mesophyll cells of Arabidopsis thaliana. Protoplasma. 230 (1-2), 23-30 (2007).
  12. Abe, T., Hashimoto, T. Altered microtubule dynamics by expression of modified α-tubulin protein causes right-handed helical growth in transgenic Arabidopsis plants. The Plant Journal. 43 (2), 191-204 (2005).
  13. Higaki, T. Real-time imaging of plant cell surface dynamics with variable-angle epifluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (106), 53437(2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

144

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved