클러스터 Stomata 애기 thaliana 묘에 설탕 솔루션 집중 치료에 의해 위한 유도 시스템

요약

이 프로토콜의 목표는 포함 하는 설탕 중간 솔루션으로 집중 치료에 의해 애기 thaliana 묘 cotyledons 클러스터 stomata를 유도 하는 방법 및 엽록체와 같은 세포내 구조를 관찰 하는 방법 그리고 confocal를 사용 하 여 클러스터 된 가드 셀에 microtubules 레이저 현미경 검사 법.

초록

Stomatal 운동 중재 공장 가스 교환, 광합성과 증발을 위해 필수적 이다. Stomatal 열고 닫는 중요 한 증가 의해 달성 되 고 각각 가드 셀 볼륨 감소. 때문에 이온과 물의 셔틀 수송 가드 셀과 큰 이웃 상피 세포 간의 stomatal 운동 하는 동안, 식물 stomata의 간격된 분포 stomatal 움직임을 위해 최적의 배포를 간주 됩니다. Stomata의 간격된 패턴 perturbing에 대 한 실험 시스템은 간격 패턴의 의미를 검사 하는 데 유용 합니다. 간격된 stomatal 배포와 관련 된 몇 가지 핵심 유전자 확인 되었습니다, 그리고 클러스터 stomata를 실험적으로이 유전자를 변경 하 여 유도 될 수 있다. 또는 클러스터 stomata 또한 유전 수정 없이 exogenous 치료에 의해 유도 될 수 있다. 이 문서에서는, 우리 자당 포함 된 중간 솔루션으로 집중 치료에 의해 클러스터 stomata 애기 thaliana 묘 목에 대 한 간단한 유도 시스템을 설명합니다. 우리의 방법은 간단 하 고 유전자 변형 또는 돌연변이 라인에 직접 적용 합니다. 더 큰 엽록체 자당 유도 된 클러스터 가드 셀의 셀 생물 학적 특징으로 표시 됩니다. 또한, 대뇌 피 질의 microtubules의 대표적인 confocal 현미경 이미지 클러스터 된 가드 세포의 세포내 관찰의 예제로 표시 됩니다. 대뇌 피 질의 microtubules의 레이디얼 방향 간격된 가드 셀 제어 조건에서와 같이 클러스터 된 가드 셀에 유지 됩니다.

서문

공장 stoma는 광합성과 증발, 가스 교환에 대 한 필수적인 기관 이다 그리고 stomatal 운동 이온 기반 통풍 관 및 물의 출시를 통해 감시 세포에 중요 한 변화에 의해 수행 됩니다. 현미경, 우리는 나뭇잎과 줄기의 표면에는 stomata의 간격된 분포 패턴을 관찰할 수 있다. Stomata의이 간격된 분포 stomatal 운동, 가드 셀과 표 피 세포^1,2이웃 간의 이온 그리고 물 교류에 의해 규제 됩니다 있도록 간주 됩니다. 클러스터 된 stomata에 대 한 실험 유도 시스템은 stomata의 간격된 분포의 중요성을 조사 하는 데 유용 합니다.

그것은 그 stomata의 공간 클러스터링 유도 될 수 있다 감시 세포 감 별 법^3,4 또는⁵화학 복합 치료에 대 한 핵심 유전자의 유전 수정에 의해 보고 되었습니다. 우리는 또한 중간 솔루션으로 집중 치료 설탕 자당, 포도 당를 포함 하 여 보충 및과 당 발생 stomatal 클러스터링 cotyledons 애기 thaliana 묘⁶의에서 보고 했다. 자당 솔루션 집중 치료는 누설을 방지 하는 세포 벽을 부정적인 영향을 제안 자당 취급 떡 표 피에서 감소 callose meristemoids와 표 피 세포를 분리 하는 새로운 세포 벽에 관찰 하 고 표 피 인접으로 가드 세포 분화 (예: 녹음 방송 요인)에 대 한 주요 유전자 제품의 소성 행동⁶세포. 비슷한 메커니즘은 gsl8/쵸 돌연변이^7,8에 대 한 연구에서 제안 했다. 자당 포함 된 중간 솔루션을 사용 하 여 클러스터 된 stomata의 재현 유도 대 한 우리의 실험 시스템은 매우 간단 하 고 저렴 한. 그것은 또한 세포 및 표현 형광 마커 그 레이블 세포내 구조^9, 유전자 변형 라인에 적용 될 때 클러스터 된 가드 셀에 골격 같은 세포내 구조를 조사 하 사용할 수 있습니다. ¹⁰.

프로토콜

1. 3% 자당 포함 된 1/2 重 Skoog 중간 솔루션의 준비

1. 비 커에 1.1 g 重 Skoog 중간 소금의 고 자당의 15 g을 추가 합니다.
2. 490 mL 증류수를 추가 하 고 잘 저 어 막대를 사용 하 여 혼합.
3. 코를 사용 하 여 5.8에 pH를 조정 합니다.
4. 500 mL 증류수와 묽 게 하십시오 그리고 중간 병으로 솔루션을 전송.
5. 압력가 마로 소독 (121 ° C, 20 분) 하 여 솔루션을 소독. 즉시 사용 하지이 솔루션 살 균 후 4 ° C에서 보관 될 수 있습니다.

2. 유도 자당을 포함 하 여 클러스터 된 Stomata의 중간 솔루션 집중 치료

1. 씨앗을 소독.
   1. 5% 활성 염소 NaClO 솔루션의 500 µ L 10%의 1 µ L을 추가 하 여 살 균 솔루션 준비 500 µ L 살 균 물 트라이 톤 X-100.
   2. 장소 ca. 50 유전자 변형 A. thaliana 씨앗 1.5 mL 튜브에 CT GFP¹¹ 등 GFP TUB6¹² 형광 마커를 들고.
   3. 잘 5 번을 반전 하 여 70% 에탄올 솔루션와 섞어 1 mL를 추가 합니다. 1 분 동안 둡니다.
   4. 씨는 튜브의 하단 싱크대 것입니다. 깨끗 한 벤치에 부드럽게 micropipette를 사용 하 여 70% 에탄올을 제거 하 고 살 균 솔루션의 1 mL을 추가. 5 번을 반전 하 여 잘 혼합 하 고 5 분 동안 둡니다.
   5. 씨앗을 씻어. 여전히 깨끗 한 벤치에 무 균 조건 하에서 작동, 부드럽게 micropipette를 사용 하 여 솔루션을 제거 하 고 살 균 물의 1 mL을 추가. 5 번이이 단계를 반복 합니다.
2. 깨끗 한 벤치에 24-잘 접시의 각 우물을 소독된 3% 자당 포함 된 1/2 重 Skoog 중간 솔루션의 1.5 mL를 추가 합니다.
3. 각 음에 두 소독된 씨앗을 추가 합니다. Parafilm의 두 레이어를 사용 하 여 24-잘 접시에 뚜껑 테이프.
4. 100 µmol m^{−2의 − 1} 흰색 빛을 사용 하 여 12/12-h 빛 어두운 주기와 성장 챔버 세트 23.5 ° C에서 24-잘 접시를 전송 하 고 14 일에 품 어.

3. 클러스터 된 Stomata의 현미경 관찰

1. 3% 자당 포함 된 1/2 重 Skoog 중간 솔루션의 유리 슬라이드 중심에 24-잘 접시의 우물에서 장소 30 µ L (크기: 76 × 26 mm, 두께: 1.0-1.2 m m).
2. 해가 위를 사용 하 여 14 일 된 묘에서 한 떡을 제거 합니다. 관찰 면이 솔루션 방울에는 떡을 부동.
3. 우리의 이전 방법¹³에 따라 떡 견본을 준비 합니다. 기본적으로, 커버 유리의 센터에 솔루션의 30 µ L를 배치 (크기: 18 × 18 m m, 두께: 0.12-0.17 m m). 뒤집어서 커버 유리를 부드럽게는 떡에 넣습니다. 보풀이 티슈를 사용 하 여 초과 버퍼를 닦아내십시오.
4. 공초점 레이저 현미경의 스테이지 표본을 설정 하 고 밝은 분야 조명을 사용 하 여 관찰에 대 한 클러스터 된 가드 셀을 선택 합니다.
5. Confocal 현미경 제조업체의 지침에 따라 붙일 이라는 세포내 구조 이미지를 취득 합니다.

결과

여기, A. thaliana 묘에 자당 포함 된 중간 솔루션 stomatal 클러스터링 유도의 간단한 방법에 대 한 프로토콜 제시 하고있다. 자당 포함 된 중간 솔루션 (그림 1B) 성장 클러스터 된 가드 셀 가드 셀 자당 무료 제어 조건 (그림 1A)에서 성장 보다 더 큰 엽록체 있다. 엽록체의 확대와 CT GFP¹¹

토론

우리는 제시한 클러스터 stomata의 유도 대 한 프로토콜 A. thaliana 묘에 자당 포함 된 중간 솔루션으로 집중 치료. 다음과 같이,이 방법은 매우 간단 하 고 없는 전문된 기술이 필요로 하지만 효율적으로 클러스터 stomata를 일으킬 수 있다. 가드 셀의 45% 이상 3% 자당 포함 된 클러스터는 중간 솔루션 (20 개 이상의 독립적인 관측의 평균 값)⁶. 또한,이 실험 시스템 적용할 수 있는 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well plate	Sumitomo Bakelite	MS-0824R
488 nm laser	Furukawa Denko	HPU-50101-PFS2
488 nm laser	Olympus	Sapphire488-20/O
510 nm long-pass filter	Olympus	BA510IF
524 - 546 nm band-pass filter	Semrock	FF01-535/22-25
530 nm short-pass filter	Olympus	BA530RIF
561 nm laser	CVI Melles Griot	85-YCA-025-040
604 - 644 nm band-pass filter	Semrock	FF01-624/40-25
Confocal laser scanning head	Yokogawa	CSU10
Confocal laser scanning head	Olympus	FV300
Cooled CCD camera	Photometrics	CoolSNAP HQ2
Image acquisition software	Molecular Devices	MetaMorph version 7.8.2.0
Image acquisition software	Olympus	FLUOVIEW v5.0
Immersion oil	Olympus	Immersion Oil Type-F	ne = 1.518 (23 degrees)
Inverted microscope	Olympus	IX-70
Inverted microscope	Olympus	IX-71
Murashige and Skoog Plant Salt Mixture	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	392-00591	Murashige T and Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15(3), 473-497.
Objective lens	Olympus	UPlanApo 100x / 1.35 NA Oil Iris 1.35	NA = 1.35
Objective lens	Olympus	UPlanAPO 40x / 0.85 NA	NA = 0.85
Sucrose	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	196-00015