JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Цель настоящего Протокола заключается в демонстрации как побудить кластерных устьиц в семядоли Arabidopsis thaliana саженцев погружения лечение с раствором сахара содержащих средних и как соблюдать внутриклеточных структур, таких как хлоропласты и микротрубочек в кластерных гвардии ячейки, используя Конфокальная лазерная микроскопия.

Аннотация

Устьичного движение опосредует завод газового обмена, которая необходима для фотосинтеза и транспирации. Устьиц открытия и закрытия достигнуто значительное увеличение и уменьшение объема клетки гвардии, соответственно. Потому что трансфер транспорт ионов и воды происходит между гвардии клетки и крупных соседних клеток эпидермиса во время движения устьиц, расположенными распределение растений устьиц считается оптимальное распределение для устьичной движения. Экспериментальные системы нарушается расположенными шаблон устьиц полезно изучить шаблон интервалы значимости. Были определены несколько ключевых генов, связанных с расположенными устьичного распределением, и кластерный устьиц можно экспериментально вызванных изменения этих генов. В качестве альтернативы кластерных устьиц может быть также вызвана экзогенных лечения без генетических изменений. В этой статье мы описываем простой индукционной системы для кластерных устьиц в проростках Arabidopsis thaliana погружения лечение среднего раствором сахарозы содержащих. Наш метод легко и непосредственно применимо к трансгенных или мутантных линий. Хлоропластов больше представлены в качестве отличительной биологических клеток сахарозы индуцированной кластерных гвардии клеток. Кроме того представитель конфокальный микроскопических изображений корковых микротрубочек показано как пример внутриклеточных наблюдения кластерных гвардии клеток. В кластерных гвардии клетки как интервал гвардии клеток в условиях управления поддерживается радиальные ориентации корковых микротрубочек.

Введение

Стома завод является важным органом для газового обмена для фотосинтеза и транспирации, и устьичного движение сопровождается значительные изменения в клетках гвардии через Ион driven поглощения и выпуска воды. Под микроскопом мы можем наблюдать расположенными распределение устьиц на поверхности листьев и стеблей. Считается, что этот интервал распределение устьиц помочь устьичного движение, которое регулируется обмен ионов и воды между гвардии клетки и соседних клеток эпидермиса1,2. Экспериментальный индукционной системы для кластерных устьиц полезны для расследования значение интервал распределения устьиц.

Сообщается, что пространственные кластеризации устьиц может быть вызвана генетической модификации ключевых генов для дифференциации клеток гвардии3,4 или лечение с химического соединения5. Мы также сообщали, что лечение погружения с раствором средних дополнена включая сахарозы, глюкозы, сахара и фруктоза устьичного кластеризации в семядоли Arabidopsis thaliana саженцы6. Снижение callose в новой стены клетки, разделение meristemoids и эпидермальных клеток наблюдалось в сахарозы лечение Семядоля эпидермиса, предполагая, что лечение погружения раствора сахарозы отрицательно сказывается на клеточной стенки, который предотвращает утечку и Внематочная действий ключевых генов продуктов для дифференцировки клеток гвардии (например , факторы транскрипции) направлении прилегающих эпидермальных клеток6. Аналогичный механизм было предложено от исследований по gsl8/Чор мутантов7,8. Наша экспериментальная система для воспроизводимых индукции кластерных устьиц, используя сахарозу содержащих средних решение довольно легко и дешево. Он может также использоваться для изучения внутриклеточных структур, таких как органеллы и Цитоскелет в кластерных гвардии клеток при применении к трансгенных линий, выражая флуоресцентные маркеры что лейбл внутриклеточных структур9, 10.

протокол

1. Подготовка решение средних 1/2 фотосинтетическую Скуг сахарозы содержащие 3%

  1. Добавьте 1.1 g фотосинтетическую Скуг средних солей и 15 г сахарозы в стакан.
  2. Добавить 490 мл дистиллированной воды и перемешать хорошо с помощью бар stir.
  3. Отрегулируйте пэ-аш до 5,8, используя Кох.
  4. Разбавляют до 500 мл дистиллированной водой и передача решения в средних бутылку.
  5. Стерилизация автоклавированием (121 ° C, 20 мин) решение. Если не используется сразу, это решение может храниться при температуре 4 ° C после стерилизации.

2. индукция кластерных устьиц, содержащих сахарозу решение средних погружения лечение

  1. Стерилизуйте семена.
    1. Приготовляют раствор стерилизации, добавив 500 мкл 5% активного хлора раствора NaClO и 1 мкл 10% Тритон X-100 до 500 мкл стерильной водой.
    2. Место ОК. 50 трансгенных семян A. thaliana ношение флуоресцентные маркер например CT-GFP11 или GFP-TUB612 в 1,5 мл.
    3. Добавьте 1 мл 70% этанола раствор и перемешать хорошо, инвертирование пять раз. Оставьте на 1 мин.
    4. Семена будут опускаться на дно трубки. На лавочке чистой аккуратно удалить 70% этанол, с использованием микропипеткой и добавить 1 мл раствора стерилизации. Смесь хорошо, инвертирование пять раз и оставить на 5 мин.
    5. Вымойте семена. Все еще работает в асептических условиях на лавочке чистой, аккуратно удалить решения с помощью микропипеткой и добавить 1 мл стерильной воды. Повторите этот шаг пять раз.
  2. Добавьте 1,5 мл раствора стерилизованные 3% сахарозы содержащих 1/2 фотосинтетическую Скуг средних в каждой скважине 24-ну плиты на лавочке чистой.
  3. Добавьте два стерилизованные семена в каждой скважине. Лентой крышку на 24-ну пластину, используя два слоя парафина.
  4. Передать набор рост палата на 23,5 ° C 24-ну пластины с 12/12-ч цикла свето тени, используя 100 мкмоль m−2 s−1 белый свет и инкубировать в течение 14 дней.

3. микроскопические наблюдения кластерных устьиц

  1. Место 30 мкл 3% сахарозы содержащих 1/2 фотосинтетическую Скуг средних раствора из скважины пластину 24-Ну на центр на стеклянное скольжение (размер: 76 × 26 мм, толщина: 1,0-1,2 мм).
  2. Удаление Семядоля из 14-дневных Рассада рассечения ножницами. Поплавок Семядоля наблюдения стороной вверх на падение решения.
  3. Подготовка образца Семядоля согласно нашего предыдущего метода13. По сути, место 30 мкл раствора в центре крышки стекла (размер: 18 × 18 мм, толщина: 0.12-0,17 мм). Стекло покровное перевернуть вверх дном и поместите его на Семядоля осторожно. Вытрите избыток буфер с помощью безворсовой ткани.
  4. Установите образец на сцене конфокальный лазерный микроскоп и выберите кластерный гвардии клетки для наблюдения, используя яркие области освещения.
  5. Приобрести конфокальный изображения дневно помечены внутриклеточных структур согласно инструкциям производителя Микроскоп.

Результаты

Здесь был представлен протокол для простой способ заставить устьичного кластеризации раствором сахарозы содержащих средних в A. thaliana. Кластерный гвардии клетки, выращенных в решение средних содержащих сахарозу (рис. 1Б) имеют большие хло?...

Обсуждение

Мы представили протоколы для индукции кластерных устьиц в A. thaliana погружения лечение среднего раствором сахарозы содержащих. Как показано здесь, этот метод очень прост и не требует специальных навыков, но может эффективно стимулировать кластерных устьиц. Более 45% клеток гвардии, о?...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Мы благодарны профессор Сеичиро Hasezawa за его любезную поддержку нашей работы. Эта работа была поддержана грантов от японского общества для поощрения науки (JSP) KAKENHgrant насчитывает 17K 19380 и 18 H 05492, от Sumitomo фонда на грант для основных исследовательских проектов науки номер 160146 и Canon фонд предоставить т.х. Эта экспериментальная система была разработана при финансовой поддержке от числа страниц JSP KAKENHgrant 26891006 к к. а. Мы благодарим Robbie Льюис, MSc, из группы Edanz (www.edanzediting.com/ac) для редактирования черновика рукописи.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
24-well plateSumitomo BakeliteMS-0824R
488 nm laserFurukawa DenkoHPU-50101-PFS2
488 nm laserOlympusSapphire488-20/O
510 nm long-pass filterOlympusBA510IF
524 - 546 nm band-pass filterSemrockFF01-535/22-25
530 nm short-pass filterOlympusBA530RIF
561 nm laserCVI Melles Griot85-YCA-025-040
604 - 644 nm band-pass filterSemrockFF01-624/40-25
Confocal laser scanning headYokogawaCSU10
Confocal laser scanning headOlympusFV300
Cooled CCD cameraPhotometricsCoolSNAP HQ2
Image acquisition softwareMolecular DevicesMetaMorph version 7.8.2.0
Image acquisition softwareOlympusFLUOVIEW v5.0
Immersion oilOlympusImmersion Oil Type-Fne = 1.518 (23 degrees)
Inverted microscopeOlympusIX-70
Inverted microscopeOlympusIX-71
Murashige and Skoog Plant Salt MixtureFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation392-00591Murashige T and Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15(3), 473-497.
Objective lens OlympusUPlanApo 100x / 1.35 NA Oil Iris 1.35NA = 1.35
Objective lens OlympusUPlanAPO 40x / 0.85 NANA = 0.85
SucroseFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation196-00015

Ссылки

  1. Raschke, K., Fellows, M. P. Stomatal movement in Zea mays: shuttle of potassium and chloride between guard cells and subsidiary cells. Planta. 101 (4), 296-316 (1971).
  2. Higaki, T., Hashimoto-Sugimoto, M., Akita, K., Iba, K., Hasezawa, S. Dynamics and environmental responses of PATROL1 in Arabidopsis subsidiary cells. Plant and Cell Physiology. 55 (4), 773-780 (2013).
  3. Bergmann, D. C., Sack, F. D. Stomatal development. Annual Review of Plant Biology. 58, 163-181 (2007).
  4. Pillitteri, L. J., Torii, K. U. Mechanisms of stomatal development. Annual Review of Plant Biology. 63, 591-614 (2012).
  5. Sakai, Y., et al. The chemical compound bubblin induces stomatal mispatterning in Arabidopsis by disrupting the intrinsic polarity of stomatal lineage cells. Development. 144 (3), 499-506 (2017).
  6. Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. Breaking of plant stomatal one-cell-spacing rule by sugar solution immersion. PLOS One. 8 (9), 72456 (2013).
  7. Chen, X. Y., et al. The Arabidopsis callose synthase gene GSL8 is required for cytokinesis and cell patterning. Plant Physiology. 150 (1), 105-113 (2009).
  8. Guseman, J. M., et al. Dysregulation of cell-to-cell connectivity and stomatal patterning by loss-of-function mutation in Arabidopsis chorus (glucan synthase-like 8). Development. 137 (10), 1731-1741 (2010).
  9. Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. Cortical microtubules and fusicoccin response in clustered stomatal guard cells induced by sucrose solution immersion. Plant Signaling and Behavior. 13 (4), 1454815 (2018).
  10. Akita, K., Hasezawa, S. Sugar solution induces clustered lips. Cytologia. 79 (2), 125-126 (2014).
  11. Holzinger, A., Buchner, O., Lütz, C., Hanson, M. R. Temperature-sensitive formation of chloroplast protrusions and stromules in mesophyll cells of Arabidopsis thaliana. Protoplasma. 230 (1-2), 23-30 (2007).
  12. Abe, T., Hashimoto, T. Altered microtubule dynamics by expression of modified α-tubulin protein causes right-handed helical growth in transgenic Arabidopsis plants. The Plant Journal. 43 (2), 191-204 (2005).
  13. Higaki, T. Real-time imaging of plant cell surface dynamics with variable-angle epifluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (106), 53437 (2015).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

144Arabidopsis thaliana

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены