Un système d’Induction de stomates groupées par traitement de Immersion de Solution de sucre chez les plantules de Arabidopsis thaliana

Résumé

Ce protocole vise à démontrer comment induire des stomates en cluster dans les cotylédons des plantules de Arabidopsis thaliana en traitement d’immersion avec une solution moyenne contenant du sucre et observer des structures intracellulaires tels que les chloroplastes et les microtubules dans les cellules stomatiques en cluster à l’aide de confocal laser microscopie.

Résumé

Stomates mouvement intervient dans les échanges gazeux plante, qui est essentiel pour la photosynthèse et la transpiration. Stomates d’ouverture et de fermeture sont réalisées par une augmentation significative et diminuent du volume de cellules de garde, respectivement. Navette de transport des ions et l’eau se produit entre les cellules de garde et de plus grandes cellules épidermiques voisines durant le mouvement stomatique, la distribution espacée des stomates de la plante est considérée comme une distribution optimale de mouvement stomatique. Des systèmes expérimentaux pour perturber le modèle espacé des stomates sont utiles pour examiner l’importance de l’enchaînement d’espacement. Plusieurs gènes clés associées à la distribution de stomates espacée ont été identifiés, et les stomates en cluster peuvent être induites expérimentalement en altérant ces gènes. Alternativement, des stomates en cluster peuvent être également induites par les traitements exogènes sans modification génétique. Dans cet article, nous décrivons un système simple induction pour cluster stomates chez Arabidopsis thaliana plantules par traitement d’immersion avec une solution moyenne contenant du saccharose. Notre méthode est simple et directement applicables aux lignes transgéniques ou mutants. Plus gros chloroplastes sont présentés comme une caractéristique biologique cellulaire des cellules de garde en cluster induite par le saccharose. En outre, une image microscopique confocale représentative des microtubules corticaux est montrée comme un exemple d’observation intracellulaire des cellules de garde en cluster. L’orientation radiale des microtubules corticaux est maintenue dans les cellules de garde en cluster comme des cellules stomatiques espacés dans des conditions de contrôle.

Introduction

La stomie de plante est un organe essentiel pour l’échange de gaz pour la photosynthèse et la transpiration, et déplacement stomatique est réalisé par des changements significatifs dans les cellules de garde par adoption pilotée par l’ion et une sortie d’eau. Au microscope, on peut observer un modèle de distribution espacés de stomates sur les surfaces des feuilles et des tiges. Cette répartition espacée des stomates est considérée pour aider le mouvement stomatique, qui est régi par échange d’ions et l’eau entre les cellules de garde et les voisins des cellules épidermiques^1,2. Systèmes d’induction expérimentale de stomates en cluster sont utiles pour étudier l’importance de la distribution espacée de stomates.

Il a été signalé que le regroupement spatial des stomates peut être induit par une modification génétique des gènes principaux pour la différentiation de cellules de garde^3,4 ou un traitement avec un composé chimique⁵. Nous avons également rapporté que traitement d’immersion avec une solution moyenne additionné de sucres y compris le saccharose, glucose, et fructose causé stomatique clustering dans les cotylédons des plantules de Arabidopsis thaliana ⁶. Réduit de callose dans nouvelles parois séparant les méristémoïdes et les cellules épidermiques a été observée dans l’épiderme de cotylédon imprégnées de saccharose, ce qui suggère que le saccharose solution immersion traitement affecte négativement la paroi cellulaire, ce qui empêche les fuites et action ectopique des produits des gènes clés pour la différenciation des cellules de garde (par exemple les facteurs de transcription) vers adjacentes épidermique cellules⁶. Un mécanisme similaire a été proposé d’études sur les gsl8/chor des mutants^7,8. Notre système expérimental pour l’induction reproductible des stomates en cluster à l’aide de la solution moyenne contenant du saccharose est assez facile et bon marché. Il peut également être utilisé pour étudier les structures intracellulaires comme les organites et le cytosquelette dans les cellules stomatiques cluster lorsqu’il est appliqué à des lignées transgéniques exprimant des marqueurs fluorescents cette étiquette structures intracellulaires^{9, 10}.

Protocole

1. préparation de la Solution moyen 3 % contenant du saccharose 1/2 Murashige-Skoog

1. Ajouter 1,1 g de sels milieu Murashige-Skoog et 15 g de saccharose dans un bécher.
2. Ajouter 490 mL d’eau distillée et mélanger bien à l’aide d’une barre de remuer.
3. Ajuster le pH de 5,8 à l’aide de KOH.
4. Diluer dans 500 mL d’eau distillée et transvaser la solution dans une bouteille moyenne.
5. Stérilisez la solution par autoclavage (121 ° C, 20 min). Si ne pas utilisée immédiatement, cette solution peut-être être conservée à 4 ° C après la stérilisation.

2. induction des stomates en cluster par contenant du saccharose Solution moyenne Immersion traitement

1. Stériliser les graines.
   1. Préparer la solution de stérilisation en ajoutant 1 µL de 10 % et de 500 µL de 5 % de chlore actif NaClO solution Triton X-100 à 500 µL d’eau stérile.
   2. Placez env. 50 transgéniques a. thaliana seeds transportant un marqueur fluorescent comme CT-GFP¹¹ ou¹² de la GFP-TUB6 dans un tube de 1,5 mL.
   3. Ajouter 1 mL de solution d’éthanol à 70 % et mélanger bien en inversant les cinq fois. Laissez pendant 1 min.
   4. Les graines vont couler au fond du tube. Sur un banc propre, Retirez doucement l’éthanol à 70 % à l’aide d’une micropipette et ajouter 1 mL de solution de stérilisation. Bien mélanger en retournant cinq fois et laisser pendant 5 min.
   5. Laver les graines. Toujours travailler dans des conditions aseptiques sur un banc propre, Retirez doucement la solution à l’aide d’une micropipette et ajouter 1 mL d’eau stérile. Répétez cette opération cinq fois.
2. Ajouter 1,5 mL de stérilisé contenant du saccharose 1/2 Murashige-Skoog moyenne solution à 3 % dans chaque puits d’une plaque de 24 puits sur un banc propre.
3. Ajouter deux graines stérilisées dans chaque puits. Scotchez le couvercle sur la plaque 24 puits à l’aide de deux couches de parafilm.
4. Transférer la plaque 24 puits à un ensemble de chambre de croissance à 23,5 ° C avec un cycle lumière-obscurité de h-12 h/12 100 µmol m⁻² s⁻¹ blanc lumière et incuber pendant 14 jours.

3. microscopique Observation des stomates en cluster

1. Place 30 µL de 1/2 3 % de sucrose-contenante Murashige-Skoog solution moyenne provenant d’un puits de la plaque 24 puits au centre d’une lame de verre (taille : 76 x 26 mm, épaisseur : 1,0 à 1,2 mm).
2. Retirer un cotylédon un semis âgés de 14 jours à l’aide de ciseaux de dissection. Flotter le cotylédon avec le côté d’observation vers le haut sur la goutte de la solution.
3. Préparer le spécimen de cotylédon selon notre méthode précédente¹³. Essentiellement, placez 30 µL de la solution sur le centre d’un couvercle en verre (taille : 18 × 18 mm, épaisseur : 0,12-0,17 mm). Retournez le couvercle en verre et placez-le délicatement sur les cotylédons. Essuyer l’excès de tampon à l’aide d’un chiffon non pelucheux.
4. Définir un spécimen sur la scène d’un microscope confocal laser et sélectionnez les cellules de garde en cluster pour l’observation à l’aide d’éclairement lumineux zone.
5. Acquérir des images confocales de structures intracellulaires fluorescent étiquetés conformément aux instructions du fabricant du microscope.

Résultats

Ici, le protocole pour une simple méthode d’induction de stomates clustering avec contenant du saccharose de la solution moyenne chez les plantules d’a. thaliana a été présenté. Les cellules stomatiques cluster cultivés en solution moyenne contenant du saccharose (Figure 1B) ont des chloroplastes plus grandes que les cellules stomatiques cultivés dans des conditions de contrôle sans sucrose (Figure 1<...

Discussion

Nous avons présenté des protocoles pour l’induction des stomates en cluster dans les semis d’a. thaliana par traitement d’immersion avec une solution moyenne contenant du saccharose. Comme indiqué ici, cette méthode est très simple et ne nécessite aucun compétences spécialisées, mais peut induire efficacement les stomates en cluster. Plus de 45 % des cellules stomatiques sont groupés avec 3 % contenant du saccharose solution moyenne (valeurs moyennes de plus de 20 observations indépendantes)

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well plate	Sumitomo Bakelite	MS-0824R
488 nm laser	Furukawa Denko	HPU-50101-PFS2
488 nm laser	Olympus	Sapphire488-20/O
510 nm long-pass filter	Olympus	BA510IF
524 - 546 nm band-pass filter	Semrock	FF01-535/22-25
530 nm short-pass filter	Olympus	BA530RIF
561 nm laser	CVI Melles Griot	85-YCA-025-040
604 - 644 nm band-pass filter	Semrock	FF01-624/40-25
Confocal laser scanning head	Yokogawa	CSU10
Confocal laser scanning head	Olympus	FV300
Cooled CCD camera	Photometrics	CoolSNAP HQ2
Image acquisition software	Molecular Devices	MetaMorph version 7.8.2.0
Image acquisition software	Olympus	FLUOVIEW v5.0
Immersion oil	Olympus	Immersion Oil Type-F	ne = 1.518 (23 degrees)
Inverted microscope	Olympus	IX-70
Inverted microscope	Olympus	IX-71
Murashige and Skoog Plant Salt Mixture	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	392-00591	Murashige T and Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15(3), 473-497.
Objective lens	Olympus	UPlanApo 100x / 1.35 NA Oil Iris 1.35	NA = 1.35
Objective lens	Olympus	UPlanAPO 40x / 0.85 NA	NA = 0.85
Sucrose	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	196-00015