مقايسة الفائق "التنبؤ بالسمية الكيميائية" "الآلي التنميط المظهرية" من ايليجانس كاينورهابديتيس

Summary

وقد وضعت أسلوب كمي لتحديد وتوقع السمية الحادة للمواد الكيميائية من خلال تحليل تلقائياً تحديد سمات المظهرية ايليجانس كاينورهابديتيس. ويصف هذا البروتوكول كيفية علاج الديدان مع المواد الكيميائية في صفيحة 384-جيدا، والتقاط الفيديو، والتحديد الكمي للسمية ذات الصلة تعمل.

Abstract

تطبيق اختبار السمية للمواد الكيميائية في أعلى ترتيب الكائنات، مثل الفئران أو الجرذان، مضيعة للوقت وباهظة التكاليف، نظراً لعمر طويل ومسائل الصيانة. على العكس من ذلك، وديدان أسطوانية ايليجانس كاينورهابديتيس (C. ايليجانس) مزايا لجعله خياراً مثاليا لاختبار السمية: عمر قصيرة وزراعة السهل، وكفاءة الإنجاب. هنا، نحن وصف بروتوكول التلقائي التنميط المظهرية من C. ايليجانس في صفيحة 384-جيدا. تربى الديدان السلكية في صفيحة 384-جيدا مع معالجة متوسطة والكيميائية السائلة، وأخذت أشرطة الفيديو لكل بئر التحديد الكمي لتأثير المواد الكيميائية على ميزات دودة 33. وتبين النتائج التجريبية أن ميزات النمط الظاهري كمياً يمكن تصنيف والتنبؤ بالسمية الحادة للمركبات الكيميائية المختلفة ووضع قائمة أولويات لتقييم السمية الكيميائية التقليدية إجراء مزيد من الاختبارات في نموذج القوارض.

Introduction

جنبا إلى جنب مع التطور السريع للمركبات الكيميائية التي تطبق على الإنتاج الصناعي والحياة اليومية للناس، من المهم دراسة سمية اختبار نماذج للمواد الكيميائية. في كثير من الحالات، يستخدم نموذج الحيوان القوارض لتقييم السمية المحتملة لمختلف المواد الكيميائية على الصحة. بشكل عام، يستخدم تحديد التركيزات المميتة (أي أساييد 50% جرعة مميتة [LD50] للمواد الكيميائية المختلفة) كمعلمة التقليدية في نموذج القوارض (فأر/الماوس) الحية، وتستغرق وقتاً طويلاً ومكلفة للغاية. وبالإضافة إلى ذلك، بسبب تخفيض، صقل، أو استبدال مبدأ (3R) المركزي للرفق بالحيوان، والأخلاقيات، والأساليب الجديدة التي تسمح لاستبدال الحيوانات أعلى قيمة للبحث العلمي^1،،من²³ . C. ايليجانس هو ديدان أسطوانية الشرانق التي ظلت معزولة من التربة. قد استخدمت على نطاق واسع ككائن بحث في المختبر بسبب خصائصه المفيدة، مثل عمر قصيرة، وزراعة سهلة وكفاءة الإنجاب. وبالإضافة إلى ذلك، العديد من الممرات البيولوجية الأساسية، بما في ذلك العمليات الفسيولوجية الأساسية واستجابات الإجهاد في C. ايليجانس، هي المحافظة في أعلى الثدييات^4،،^،من^{56،7 , 8}-يوجد في بضع مقارنات جعلت نحن وآخرون، توافق جيد بين C. ايليجانس السمية والسمية التي لوحظت في القوارض⁹. كل هذا يجعل C. ايليجانس نموذج جيد لاختبار آثار المجراة في المواد الكيميائية السمية.

في الآونة الأخيرة، بعض الدراسات الكمية السمات المظهرية من C. ايليجانس. يمكن استخدام الميزات لتحليل السمية للمواد الكيميائية^2،،من³¹⁰ وشيخوخة الديدان¹¹. كما وضعنا أيضا أسلوب الذي يجمع بين دودة سائل استزراع النظام ونظام تحليل صورة، التي تربى الديدان في لوحة 384-البئر تحت علاجات كيميائية مختلفة¹². وقد وضعت هذا الأسلوب الكمي لتحليل معلمات 33 C. ايليجانس تلقائياً بعد 12-24 ساعة علاج الكيميائي في صفيحة 384-جيدا مع السائلة المتوسطة. يتم استخدام مرحلة مجهر الآلي لاقتناء الفيديو التجريبية. أشرطة الفيديو يتم معالجتها بواسطة برنامج مصمم خصيصا، وكمياً 33 الميزات المتصلة بالسلوك الديدان المتحركة. الأسلوب يستخدم لقياس تعمل الدودة تحت العلاج 10 مركبات. وتبين النتائج أن السمية مختلفة يمكن أن يغير تعمل من C. ايليجانس. يمكن استخدام هذه الكمية تعمل التعرف والتنبؤ بالسمية الحادة للمركبات الكيميائية المختلفة. والهدف العام لهذا الأسلوب لتسهيل المراقبة والقياس الكمي المظهرية للتجارب مع C. ايليجانس في ثقافة سائل. يعد هذا الأسلوب مفيداً لتطبيق C. ايليجانس في تقييمات السمية الكيميائية والنمط الظاهري كوانتيفيكيشنز، التي تساعد على التنبؤ بالسمية الحادة للمركبات الكيميائية المختلفة ووضع قائمة بأولويات لمزيد التقليدية اختبارات تقييم السمية الكيميائية في نموذج القوارض. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تطبيق هذا الأسلوب لسمية الفحص والاختبار لمواد كيميائية جديدة أو المجمع التلوث عامل المضافات الغذائية ومركبات فارماكوتيكال، مجمع خارجية بيئية، وهلم جرا.

Protocol

البروتوكول المبادئ التوجيهية الرعاية الحيوانية من "لجنة الأخلاقيات الحيوان" من مركز بكين للوقاية من المرض ومكافحته في الصين.

1-إعداد الأسلحة الكيميائية

1. الحصول على المواد الكيميائية (الجدول 1 و الجدول للمواد).
2. تحديد الجرعة أعلى وأدنى من المواد الكيميائية الإفرادية لتركيز الحد أدنى من الفتك 100% (LC100، 24 ساعة) وتركيز الحد أقصى من 100% نونليثاليتي (LC0، 24 ساعة) للديدان. استخدام تخفيف ستة على الأقل من أعلى تركيز (الجدول 1).
   ملاحظة: إجراء اختبار قوة فتك دودة أولية⁹ استكشاف LC100 و LC0 لمادة كيميائية جديدة، لتحديد الجرعة.
3. تمييع كل مادة كيميائية مع كالمتوسطه (جدول المواد) إلى 2 × التركيز المطلوب. استخدام K-المتوسطة كعنصر تحكم لمقارنة النمط الظاهري التعديلات الناجمة عن المواد الكيميائية.
   1. على سبيل المثال، تعد 7 تركيزات متدرجة من كلوريد الكادميوم (كدكل₂) (الجدول 1). إعداد 2 x حل 92.8 مغ كدكل مسحوق₂ الصلبة في 8 مل كمتوسطه أعلى المحلول مركزة (4.64 مغ/مل)، وملء يصل إلى 10 مل بعد المسحوق قد حلت تماما. إعداد مستويات تركيز أخرى بإضعاف مع كالمتوسطه.
4. إعداد ثمانية آبار موازية لكل تركيز في التدرج الكيميائية. كذلك يتضمن كل 50 ميليلتر من 2 × الحل الكيميائية. إعداد على الأقل ثلاث مجموعات من ثمانية آبار موازية من K والمتوسطة كعناصر تحكم (الجدول 2).
   ملاحظة: بإيجاز، حجم 500 ميليلتر من 2 × الحل العمل أمر ضروري لجرعة واحدة من كل مادة كيميائية.

2-دودة إعداد

1. الحصول على البرية من نوع N2 الديدان وسلالات الإشريكيّة القولونية OP50 من مركز علم الوراثة كاينورهابديتيس (كجك).
2. الحصول على متزامنة L4 الديدان.
   1. اختيار مستعمرة واحدة من OP50 كولاي من لوحة متواصلة. أسيبتيكالي تطعيم المستعمرة في 100 مل مرق رطل وأنها تنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: الحل OP50 كولاي جاهز الآن للبذر لنمو السلكية لوحات متوسطة (NGM، الجدول للمواد).
   2. صب NGM بلاستيك 90 مم طبق بيتري. البذور كل لوحة مع 300 ميليلتر لحل OP50 كولاي اليوم بعد سكب. احتضان الديدان N2 على لوحات NGM مع OP50 في 20 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام حتى أكثر من الديدان قد وصل إلى مرحلة الكبار.
   3. الديدان جرابيد الحصاد في أنبوب الطرد مركزي مخروطية عقيمة 15 مل مع العقيمة H₂o. واسمحوا الديدان تستقر لمدة 2 دقيقة على الأقل، ونضح ح₂س، وإضافة 5 مل من المخزن المؤقت للتبييض (جدول المواد).
   4. دوامة الأنبوب لمدة 5 دقائق، تدور أنبوب لمدة 30 ثانية (في س 1,300 ز) بيليه البيض، وتجاهل المادة طافية.
   5. أغسل البيض مع 5 مل ح₂س العقيمة ودوامه الأنبوب للطرد المركزي س. 5 الأنبوبة 30 s (في س 1,300 ز) وإزالة المادة طافية، والمياه والصرف الصحي مرة أخرى.
   6. "الماصة؛" البيض على صفيحة NGM جديدة مع OP50. احتضان لهم عند 20 درجة مئوية. رصد الديدان L1 مظلل في صباح اليوم التالي؛ الديدان وسوف تصل إلى مرحلة L4 في حوالي 40 ح.
3. أغسل الديدان L4 قبالة لوحات بيتري 90 ملم مع كالمتوسطه في أنبوب 50 مل مخروطية عقيمة. ضبط تركيز الديدان للحيوانات ~ 40 الواحد 100 ميليلتر من K والمتوسطة تحت ستيريوميكروسكوبي. إضافة 50 ميليلتر (الديدان ~ 20) في كل من لوحة 384-جيدا جيدا. هذه الديدان متزامنة (مرحلة L4) على استعداد لمعالجة المواد الكيميائية التالية.

3-الأسلحة الكيميائية العلاج والتقاط الفيديو

ملاحظة: في لوحة 384، حسنا، تعامل الديدان (50 ميليلتر في كل بئر) إلى ستة إلى سبعة لجرعات من مادة كيميائية فردية (الجدول 1). إعداد ثمانية آبار موازية، كل منها يحتوي على 50 ميليلتر من 2 × الحل الكيميائية لكل جرعة (ثمانية آبار مليئة بنفس المادة الكيميائية وتركيز نفسه، الجدول 2). يتم جمع كل أشرطة الفيديو باستخدام كاميرا رقمية إرفاقه مجهر مقلوب (جدول المواد). تجربة العلاج الكيميائي يستمر لمدة 24 ساعة. لا تقم بإضافة الغذاء البكتيرية لكل بئر خلال التجربة العلاج الكيميائي ح 24.

1. قبل إضافة المواد الكيميائية، تعيين لوحة 384-جيدا مع الديدان متزامنة في مرحلة التلقائية واتخاذ أشرطة الفيديو لكل بئر مع إجراءات اقتناء المبرمجة (7 إطارات في الثانية 2 s؛ فإنه يأخذ ~ 25 دقيقة لمسح كل لوحة).
2. إضافة 50 ميليلتر من 2 × الكيميائية الأوراق المالية المعدة وفقا للمادة 1 لكل بئر (الجدول 2). تعيين الوقت كنقطة ح 0.
3. احتضان لوحة 384-جيدا عند 20 درجة مئوية واهتز 80 لفة في الدقيقة في شاكر حاضنة.
4. إزالة اللوحة من الحاضنة ونقلها إلى مرحلة تلقائية. أن أشرطة الفيديو لكل بئر من لوحة كاملة، في ح 12 وفي ح 24، للتحقق من تعمل الديدان لكل معاملة كيميائية محددة في كالمتوسطه. حوالي 25 دقيقة مطلوبة من أجل شاشة لوحة واحدة.

4-تجربة معالجة الفيديو

ملاحظة: كتابة برنامج لمعالجة الصور والفيديو التجريبية وتعبئتها. يمكن تحميلها بحرية (انظر الجدول للمواد). يتم تخزين الفيديو التجريبية في شكل تسلسل الإطار صورة، وتسلسل الإطار كل الفيديو المخزنة في دليل محدد. البرنامج يمكن الاعتراف بالديدان والتحديد الكمي لتعمل تلقائياً.

1. في واجهة المستخدم الرسومية (واجهة المستخدم الرسومية، الشكل 1)، إضافة المعلمات، مثل الدليل تسلسل الإطار، دليل الإخراج، معلمة الحجم دودة، وحركة عتبة المعلمة. انقر فوق الزر تحليل لمعالجة الصور التجريبية.
   1. انقر فوق الزر تحديد اختيار الدليل الصور المصدر.
   2. إضافة الدليل نتيجة متوسطة في الواجهة.
      ملاحظة: النتائج المتوسطة التي تشمل الصور مجزأة. هذه النتائج المتوسطة مفيدة للمراقبة البصرية لمعالجة الصور.
   3. إضافة الدليل النتيجة النهائية في الواجهة.
   4. إضافة معلمة دودة متوسط الحجم في مربع نص حجم الدودة في الواجهة.
      ملاحظة: هو معلمة الحجم المستخدمة في التجارب 2,000.
   5. إضافة عتبة نسبة تم نقله في الواجهة.
      ملاحظة: هي النسبة المستخدمة في التجارب 0.93.
   6. انقر فوق الزر تحليل للبدء في معالجة الصور. انقر فوق الزر إعادة تعيين إلى مسح معلمات إضافية.
      ملاحظة: هناك ميزات 33 تعريفها وقياسها كمياً للديدان. يتم فرز جميع تعمل المعرفة حسب فئات (المدرجة في الجدول 3). هذه الميزات يمكن قياسها كمياً من الصور التجريبية. مقارنة كمية بين المواد الكيميائية المختلفة، التي لديها السمية مختلفة، يمكن أن يتم عن طريق مقارنة هذه الميزات.

النتائج

قد اختبرنا تعمل الديدان يتعرضون لتركيزات مختلفة من المواد الكيميائية أكثر من 10¹². في الاختبار، وتم قياس كمية 33 سمات مميزة لكل مادة كيميائية مركبة في ثلاث نقاط زمنية (ح 0 وح 12 و 24 ساعة). سابقا، تم إجراء مقارنة بين دليل وتحليل تلقائي مقايسة عمر^11،

Discussion

مزايا C. ايليجانس أدت إلى أن الاستخدام المتزايد في علم السموم⁹، سواء بالنسبة للدراسات الميكانيكية والنهج الفرز الفائق. زيادة دور C. ايليجانس في استكمال النظم النموذجية الأخرى في الأبحاث السمية كان ملحوظا في السنوات الأخيرة، خاصة بالنسبة للتقييم السريع سمية المواد ا?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Propanol	Sigma-Aldrich	59300
384-well plates	Throme	142761
Agar	Bacto	214010
Atropine sulfate	Sigma-Aldrich	PHL80892
Bleach buffer			0.5 mL of 10 M NaOH, 0.5 mL of5% NaClO, 9 mL ofultrapure water
Cadmium chloride	Sigma-Aldrich	202908
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	21074
CCD camera	Zeiss	AxioCam HRm	Zeiss microscopy GmbH
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C8667
Copper(II) sulfate	Sigma-Aldrich	451657
Ethanol	Sigma-Aldrich	24105
Ethylene glycol	Sigma-Aldrich	324558
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
K-Medium			3.04 g of NaCl and 2.39 g of KCl in 1 L ultrapure water
LB Broth			10 g/L Tryptone, 5 g/L Yeast Extract, 5 g/L NaCl
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	63140
NGM Plate			3 g ofNaCl, 17 g ofagar, 2.5 g ofpeptone in 1 L of ultrapure water, after autoclave add 1 mL of cholesterol (5 mg/mL in ethanol), 1 mL of MgSO4 (1 M), 1 mL of CaCl2 (1 M), 25 mL of PPB buffer
Peptone	Bacto	211677
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	60130
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	795496
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	795488
PPB buffer			35.6 g of K2HPO4, 108.3 g of KH2PO4 in 1 L ultrapure water
shaker	ZHICHENG	ZWY-200D
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	71382
Sodium fluoride	Sigma-Aldrich	s7920
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	71690
Sodium hypochlorite solution	Sigma-Aldrich	239305
The link of program			https://github.com/weiyangc/ImageProcessForWellPlate
Tryptone	Sigma-Aldrich	T7293
Yeast extract	Sigma-Aldrich	Y1625
Zeiss automatic microscope	Zeiss	AXIO Observer.Z1	Zeiss automatic microsco with peproprietary software Zen2012 and charge coupled device(CCD) camera