Un test haut débit pour la prévision de la toxicité chimique de profilage phénotypique automatisé de Caenorhabditis elegans

Résumé

Une méthode quantitative a été développée pour identifier et prédire la toxicité aiguë de substances chimiques en analysant automatiquement la détermination des caractéristiques phénotypiques de Caenorhabditis elegans. Ce protocole décrit comment traiter les vers avec des produits chimiques dans une plaque 384 puits, capturer des vidéos et quantifier les phénotypes associés toxicologiques.

Résumé

Essais de toxicité des produits chimiques chez les organismes supérieurs de commande, tels que les souris ou les rats, l’application, c’est long et coûteux, en raison de leur longue durée de vie et les problèmes d’entretien. Au contraire, le nématode Caenorhabditis elegans (c. elegans) a des avantages à en font un choix idéal pour les essais de toxicité : une courte durée de vie, une culture facile et de reproduction efficace. Nous décrivons ici un protocole pour le profilage phénotypique automatique de c. elegans dans une plaque 384 puits. Les vers nématodes sont cultivées dans une plaque 384 puits avec traitement moyen et chimique liquides et vidéos sont prises de chaque puits de quantifier l’influence chimique sur 33 caractéristiques de ver. Les résultats expérimentaux montrent que les caractéristiques de phénotype chiffrés peuvent classer et prédire la toxicité aiguë pour les différents composés chimiques et établir une liste de priorités pour les tests d’évaluation plus traditionnelle de la toxicité chimique dans un modèle de rongeur.

Introduction

Avec le développement rapid des composés chimiques appliqués à la production industrielle et de la vie quotidienne du peuple, il est important d’étudier la toxicité à l’essai des modèles pour les produits chimiques. Dans de nombreux cas, le modèle animal rongeur est employé pour évaluer la toxicité potentielle des différents produits chimiques sur la santé. En règle générale, la détermination des concentrations létales (c.-à-d. la dosé 50 % dose létale [DL50] de différents produits chimiques) est utilisée comme paramètre dans un modèle de rongeur (rat/souris) in vivo, traditionnel qui est long et très coûteux. En outre, en raison de la réduire, affiner ou remplacer (3R) principe qui est au cœur de l’éthique et du bien-être animal, de nouvelles méthodes qui permettent le remplacement des animaux supérieurs sont précieux pour la recherche scientifique^1,2,3 . C. elegans est un nématode libre qui a été isolé du sol. Il a été largement utilisé comme un organisme de recherche en laboratoire en raison de ses caractéristiques bénéfiques, notamment une courte durée de vie, une culture facile et de reproduction efficace. En outre, plusieurs voies biologiques fondamentaux, y compris les processus physiologiques de base et les réactions de stress chez c. elegans, sont conservées dans les mammifères supérieurs^{4,5,6,7 , 8}. dans quelques comparaisons nous et autres avons fait, il y a une bonne concordance entre le c. elegans ou toxique observé chez les rongeurs,⁹. Tout cela fait c. elegans , un bon modèle pour tester les effets de la toxicité chimique in vivo.

Récemment, certaines études quantifié les caractéristiques phénotypiques de c. elegans. Les caractéristiques peuvent être utilisés pour analyser la toxicité des produits chimiques^2,3,10 et le vieillissement vers¹¹. Nous avons également développé une méthode qui combine un ver liquid culture système et un système d’analyse image, où les vers sont cultivées dans une plaque 384 puits sous différents traitements chimiques¹². Cette technique quantitative a été développée pour analyser automatiquement les 33 paramètres de c. elegans après 12 à 24 heures de traitement chimique dans une plaque 384 puits avec un milieu liquide. Une platine du microscope automatisé est utilisé pour l’acquisition vidéo expérimentale. Les vidéos sont traitées par un programme sur-mesure, et 33 caractéristiques liées au comportement de déplacement du ver sont quantifiées. La méthode est utilisée pour quantifier les phénotypes de ver dans le traitement des 10 composés. Les résultats montrent que les différentes toxicités peuvent altérer les phénotypes de c. elegans. Ces phénotypes quantifiées peuvent être utilisés pour identifier et prédire la toxicité aiguë de différents composés chimiques. L’objectif général de cette méthode est de faciliter l’observation et la quantification phénotypique des expériences avec le c. elegans en milieu liquide. Cette méthode est utile pour l’application de c. elegans dans les évaluations de la toxicité chimique et analyses quantitatives phénotype, ce qui aident à prédire la toxicité aiguë de différents composés chimiques et établir une liste de priorités pour les plus traditionnels tests d’évaluation de la toxicité chimique dans un modèle de rongeur. En outre, cette méthode peut être appliquée à la toxicité de dépistage et de tester de nouveaux produits chimiques ou le composé comme la pollution agent additif alimentaire, composés de pharmacautical, environnement composé exogène et ainsi de suite.

Protocole

Le protocole suit les directives de protection des animaux du comité d’éthique animale du centre de Pékin pour la prévention et de contrôle en Chine.

1. préparation chimique

1. Obtenir des produits chimiques (tableau 1 et Table des matières).
2. Déterminer la dose maximale et minimale des produits chimiques individuelle pour une concentration minimale de 100 % de létalité (LC100, 24 h) et une concentration maximale de 100 % nonlethality (CL0, 24h) à worms. Utiliser au moins six dilutions de la plus forte concentration (tableau 1).
   Remarque : Effectuer un ver préliminaire létalité test⁹ pour explorer LC100 et CL0 pour un nouveau produit chimique, afin de déterminer la posologie.
3. Diluer chaque produit chimique avec K-médium (Table des matières) à 2 x la concentration requise. Utilisez K-médium comme témoin pour comparer les altérations de phénotype causées par les produits chimiques.
   1. Par exemple, préparer 7 concentrations gradients de chlorure de cadmium (CdCl₂) (tableau 1). Pour préparer 2 x la plus haute solution aqueuse concentrée (4,64 mg/mL), dissoudre 92,8 mg de CdCl poudre pleine de₂ à 8 mL de K-médium et compléter jusqu'à 10 mL lorsque la poudre est complètement dissout. Préparer les autres niveaux de concentration par dilution avec K-moyennes.
4. Préparer huit puits parallèles pour chaque concentration du gradient chimique. Eh bien, chacun contient 50 µL de la 2 x solution chimique. Préparer au moins trois groupes de huit puits parallèles de K-médium comme témoins (tableau 2).
   Remarque : en bref, un volume de 500 µL de 2 x solution de travail est nécessaire pour une dose unique de chaque produit chimique.

2. préparation de la vis sans fin

1. Obtenir sauvage N2 vers et des souches de Escherichia coli OP50 de la centre de génétique de Caenorhabditis (CCG).
2. Obtenir synchronisée vers L4.
   1. Prélever une colonie unique d’e. coli OP50 de la plaque de la strie. Ensemencer la colonie dans 100 mL de bouillon LB de façon aseptique et cultiver une nuit à 37 ° C.
      Remarque : La solution OP50 d’e. coli est maintenant prête pour l’ensemencement aux plaques de nématode croissance moyenne (NGM, Table des matières).
   2. Versez NGM dans un plastique de 90 mm de pétri. Graines de chaque plaque avec 300 µL de solution d’e. coli OP50 au lendemain de la coulée. Incuber N2 vers sur les plaques NGM avec OP50 à 20 ° C pendant environ 2-3 jours jusqu'à ce que la plupart vers ont atteint le stade adulte.
   3. Récolte vers gravides dans un tube à centrifuger conique stérile 15 mL stérile H₂O. Laissez les vers s’installent pendant au moins 2 min, aspirer l’H₂O et ajouter 5 mL de tampon d’eau de Javel (Table des matières).
   4. Vortex le tube pendant 5 minutes, tourner le tube pendant 30 s (à 1 300 x g) pour les oeufs de granule et éliminer le surnageant.
   5. Laver les oeufs avec 5 mL stérile H₂O et vortex le tube pendant 5 s. centrifuger le tube 30 s (à 1 300 g), enlever le surnageant et lavage à nouveau.
   6. Déposer les oeufs sur une nouvelle plaque de NGM avec OP50. Les incuber à 20 ° C. Surveiller les vers L1 éclos le lendemain matin ; les vers atteindront le stade L4 dans environ 40 h.
3. Laver les vers L4 hors les plats de pétri de 90 mm avec K-médium dans un tube conique stérile de 50 mL. Ajuster la concentration de worms à ~ 40 animaux par 100 µL de K-médium sous un stéréomicroscope. Ajouter 50 µL (~ 20 vers) dans chaque puits de la plaque 384 puits. Ces vers synchronisé (stade L4) sont prêts pour le traitement suivant par des produits chimiques.

3. traitement chimique et capture vidéo

Remarque : Dans une plaque 384 puits, worms (50 µL à chaque puits) sont traités à six à sept doses d’un substance chimique individuel (tableau 1). Préparer huit puits parallèles, chacune contenant 50 µL de la 2 x solution chimique pour chaque dosage (huit puits sont remplis avec le même produit chimique et la même concentration, tableau 2). Toutes les vidéos sont recueillies à l’aide d’un appareil photo numérique attaché à un microscope inversé (Table des matières). L’expérience de traitement chimique dure pendant 24 h. N’ajoutez pas de nourriture bactérienne dans chaque puits pendant l’expérience de traitement chimique de 24h.

1. Avant d’ajouter les produits chimiques, mettre la plaque de 384 puits avec les vers synchronisé sur la scène automatique et de prendre des vidéos de chaque puits avec la procédure d’acquisition programmée (7 images par seconde pour 2 s ; il faut environ 25 min pour analyser chaque plaque).
2. Ajouter 50 µL de la 2 x stock chimique préparé conformément à l’article 1 pour chaque puits (tableau 2). Réglez l’heure comme le point h 0.
3. Incuber les plaques 384 puits à 20 ° C et l’agiter à 80 tr/min dans un shaker incubateur.
4. Retirez la plaque de l’incubateur et transférez-le vers un stade automatique. Prendre des vidéos de chaque puits de la plaque entière, à 12 h et 24h, pour vérifier les phénotypes vers pour chaque traitement chimique spécifique au K-médium. Environ 25 min sont nécessaires pour l’écran d’une seule plaque.

4. traitement vidéo expérience

Remarque : Un programme pour la vidéo expérimentale et traitement des images a été écrit et emballé. Il peut être librement téléchargé (voir Table des matières). La vidéo expérimentale est stockée sous la forme d’une séquence d’image image, et la séquence d’images de chaque vidéo est stockée dans un répertoire spécifique. Le programme peut reconnaître les vers et quantifier les phénotypes automatiquement.

1. Dans l’interface utilisateur graphique (GUI, Figure 1), ajoutez des paramètres, tels que le répertoire de séquence de trame, le répertoire de sortie, le paramètre de taille de vis sans fin et le paramètre de seuil de mouvement. Cliquez sur le bouton Analyze pour traiter les images expérimentales.
   1. Cliquez sur le bouton sélectionner pour choisir le répertoire d’images source.
   2. Ajoutez le répertoire résultat intermédiaire dans l’interface.
      Remarque : Les résultats moyens incluent les images segmentées. Ces résultats moyens sont utiles pour l’observation visuelle des images traitées.
   3. Ajoutez le répertoire résultat final dans l’interface.
   4. Ajoutez le paramètre de taille moyenne ver dans la zone de texte Taille de ver dans l’interface.
      Remarque : Le paramètre de taille utilisé dans les expériences est de 2 000.
   5. Ajouter le seuil du ratio déplacé dans l’interface.
      NOTE : Le ratio utilisé dans les expériences est de 0,93.
   6. Cliquez sur le bouton Analyze pour commencer le traitement de l’image. Cliquez sur le bouton Reset pour effacer les paramètres ajoutés.
      Remarque : Il y a 33 éléments définis et quantifiés pour les vers. Tous les phénotypes définis sont triés par catégories (énumérées dans le tableau 3). Ces fonctionnalités peuvent être quantifiées d’images expérimentales. Une comparaison quantitative entre les différents produits chimiques, qui ont des toxicités différentes, peut être faite en comparant ces fonctionnalités.

Résultats

Nous avons testé les phénotypes vers exposés à différentes concentrations de plus de 10 produits chimiques¹². Dans le test, 33 caractéristiques distinctes ont été quantifiées pour chaque produit chimique composé à trois points dans le temps (0 h, 12 h et 24h). Une comparaison entre un manuel et une analyse automatique d’un test de durée de vie a été faite auparavant,^11,12. Dans ce test, nous...

Discussion

Les avantages de c. elegans ont conduit à son utilisation croissante en toxicologie⁹, tant pour les études mécanistiques et approches de criblage à haut débit. Un rôle accru pour le c. elegans en complément des autres systèmes de modèle dans la recherche toxicologique a été remarquable ces dernières années, en particulier pour l’évaluation de la toxicité rapide de nouveaux produits chimiques. Cet article fournit une nouvelle méthode de dosage de criblage haut d?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Propanol	Sigma-Aldrich	59300
384-well plates	Throme	142761
Agar	Bacto	214010
Atropine sulfate	Sigma-Aldrich	PHL80892
Bleach buffer			0.5 mL of 10 M NaOH, 0.5 mL of5% NaClO, 9 mL ofultrapure water
Cadmium chloride	Sigma-Aldrich	202908
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	21074
CCD camera	Zeiss	AxioCam HRm	Zeiss microscopy GmbH
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C8667
Copper(II) sulfate	Sigma-Aldrich	451657
Ethanol	Sigma-Aldrich	24105
Ethylene glycol	Sigma-Aldrich	324558
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
K-Medium			3.04 g of NaCl and 2.39 g of KCl in 1 L ultrapure water
LB Broth			10 g/L Tryptone, 5 g/L Yeast Extract, 5 g/L NaCl
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	63140
NGM Plate			3 g ofNaCl, 17 g ofagar, 2.5 g ofpeptone in 1 L of ultrapure water, after autoclave add 1 mL of cholesterol (5 mg/mL in ethanol), 1 mL of MgSO4 (1 M), 1 mL of CaCl2 (1 M), 25 mL of PPB buffer
Peptone	Bacto	211677
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	60130
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	795496
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	795488
PPB buffer			35.6 g of K2HPO4, 108.3 g of KH2PO4 in 1 L ultrapure water
shaker	ZHICHENG	ZWY-200D
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	71382
Sodium fluoride	Sigma-Aldrich	s7920
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	71690
Sodium hypochlorite solution	Sigma-Aldrich	239305
The link of program			https://github.com/weiyangc/ImageProcessForWellPlate
Tryptone	Sigma-Aldrich	T7293
Yeast extract	Sigma-Aldrich	Y1625
Zeiss automatic microscope	Zeiss	AXIO Observer.Z1	Zeiss automatic microsco with peproprietary software Zen2012 and charge coupled device(CCD) camera