Ein High-Throughput-Assay für die Vorhersage der chemischen Toxizität durch automatisierte phänotypischen Profilierung von Caenorhabditis elegans

Zusammenfassung

Eine quantitative Methode wurde entwickelt, um zu identifizieren und die akute Toxizität von Chemikalien durch die automatisch analysieren die phänotypische Profilierung von Caenorhabditis ElegansVorhersagen. Dieses Protokoll beschreibt die Würmer mit Chemikalien zu behandeln, in einem 384-Well-Platte, Videos aufzunehmen und toxikologischen Verwandte Phänotypen zu quantifizieren.

Zusammenfassung

Toxizitätstests von Chemikalien in der höheren Ordnung Organismen, wie Mäusen oder Ratten, die Anwendung ist zeitaufwändig und teuer, wegen ihrer langen Lebensdauer und Wartungsprobleme. Im Gegenteil, der Fadenwurm Caenorhabditis Elegans (C. Elegans) hat Vorteile machen es ideal für Toxizitätstests: eine kurze Lebensdauer, einfache Kultivierung und effiziente Reproduktion. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die automatische phänotypischen Profilierung von C. Elegans in einem 384-Well-Platte. Die Fadenwürmer sind kultiviert in einem 384-Well-Platte mit flüssigen Mittel und chemische Behandlung und Videos stammen von jedem Bohrloch zur Quantifizierung des chemischen Einfluss auf 33 Wurm-Funktionen. Experimentelle Ergebnisse zeigen, dass die quantifizierten Phänotyp-Features können klassifizieren und, die akute Toxizität für verschiedene chemische Verbindungen Vorhersagen und eine Prioritätenliste für weitere traditionelle chemische Toxizität Assessment-Tests in einem Nagetier Modell zu etablieren.

Einleitung

Zusammen mit der rasanten Entwicklung von chemischen Verbindungen, die auf industrielle Produktion und Menschen das tägliche Leben angewendet ist es wichtig, die Toxizitätstests Modelle für die Chemie zu studieren. In vielen Fällen ist das Nagetiere Tiermodell eingesetzt, um die mögliche Toxizität von Chemikalien auf die Gesundheit zu bewerten. Im Allgemeinen dient die Bestimmung der tödliche Konzentrationen (d. h., die vermutlich 50 % tödliche Dosis [LD50] verschiedener chemischer Stoffe) als traditionelle Parameter in einem in-vivo, Nager (Ratte/Maus) Modell ist aufwendig und sehr teuer. Darüber hinaus durch die Reduzierung zu verfeinern Sie, oder ersetzen Sie (3R) Prinzip, das den Tierschutz und Ethik im Mittelpunkt steht, neue Methoden, mit denen für der Ersatz von höheren Tieren sind wertvolle wissenschaftliche Forschung^1,2,3 . C. Elegans ist eine freilebende Nematoden, die aus dem Boden isoliert wurde. Es wurde weithin als Organismus Forschung im Labor aufgrund seiner vorteilhaften Eigenschaften, wie eine kurze Lebensdauer, einfache Kultivierung und effiziente Reproduktion verwendet. Darüber hinaus sind viele grundlegende biologischer Signalwege, darunter grundlegende physiologische Prozesse und Stressreaktionen in C. Elegans in höheren Säugetiere^4,5,6,7 konserviert. ^{, 8}. in ein paar Vergleiche wir und andere haben, gibt es eine gute Übereinstimmung zwischen C. Elegans Toxizität und Toxizität bei Nagetieren⁹beobachtet. All dies macht C. Elegans ein gutes Modell, die Auswirkungen der chemischen Toxizität in vivo zu testen.

Vor kurzem, einige Studien quantifiziert die phänotypische Merkmale von C. Elegans. Die Funktionen können verwendet werden, um die Toxizität von Chemikalien^2,3,10 und die Alterung der Würmer¹¹zu analysieren. Wir entwickelten auch eine Methode, die kombiniert einen flüssigen Wurm Kultivierung System und eine Bild-Analyse-System, in dem die Würmer in einem 384-Well-Platte unter verschiedenen chemischen Behandlungen¹²kultiviert sind. Dieses quantitative Verfahren wurde entwickelt, um die 33 Parameter von C. Elegans automatisch nach 12-24 h chemische Behandlung in einem 384-Well-Platte mit flüssigen Medium zu analysieren. Eine automatisierte Mikroskoptisch dient zur experimentellen Videoerfassung. Die Videos werden von einem maßgeschneiderten Programm verarbeitet, und 33 Funktionen im Zusammenhang mit den Würmern beweglichen Verhalten quantifiziert. Die Methode wird verwendet, um den Wurm Phänotypen unter der Behandlung von 10 Verbindungen zu quantifizieren. Die Ergebnisse zeigen, dass unterschiedliche Toxizitäten der Phänotypen von C. Elegansverändern können. Diese quantifizierten Phänotypen können verwendet werden, zu identifizieren und vorherzusagen, die akute Toxizität von verschiedenen chemischen Verbindungen. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist die Beobachtung und phänotypischen Quantifizierung von Experimenten mit C. Elegans in einer flüssigen Kultur zu erleichtern. Diese Methode eignet sich für den Einsatz von C. Elegans in chemische Toxizität Auswertungen und Phänotyp Quantifizierungen, die helfen, vorherzusagen, die akute Toxizität von verschiedenen chemischen Verbindungen und etablieren eine Prioritätenliste für weitere traditionelle chemische Toxizität Assessment-Tests in einem Nagetier-Modell. Darüber hinaus kann diese Methode auf die Toxizität screening und Erprobung von neuen Chemikalien oder die Verbindung als Lebensmittel Zusatzstoff Agent Verschmutzung, Pharmacautical Verbindungen, ökologische exogene Substanz und So weiter angewendet werden.

Protokoll

Das Protokoll folgt den Tierbetreuung Richtlinien der Tier-Ethik-Kommission des Peking-Zentrums für die Prävention und die Kontrolle in China.

1. chemische Aufbereitung

1. Chemikalien (Tabelle 1 und Tabelle of Materials) erhalten.
2. Bestimmen Sie die höchste und die niedrigste Dosierung der einzelnen Chemikalien für eine minimale Konzentration von 100 % Letalität (LC100, 24 h) und eine maximale Konzentration von 100 % Nonlethality (LC0, 24 h) nach Worms. Verwenden Sie mindestens sechs Verdünnungen der höchsten Konzentration (Tabelle 1).
   Hinweis: Führen Sie eine vorläufige Wurm Letalität Test⁹ to explore LC100 and LC0 für ein neues chemisches, um die Dosierung zu bestimmen.
3. Jede chemische Substanz mit K-Medium (Table of Materials) 2 x die erforderliche Konzentration zu verdünnen. Verwenden Sie K-Medium als ein Steuerelement, um den Phänotyp Veränderungen durch die Chemikalien zu vergleichen.
   1. Bereiten Sie beispielsweise 7 gradient Konzentrationen von Cadmium Chlorid (CdCl₂) (Tabelle 1). 2 X vorbereiten die höchsten konzentrierte wässrige Lösung (4,64 mg/mL) auflösen 92,8 mg CdCl₂ solide Pulver in 8 mL K-Medium und bis zu 10 mL zu füllen, nachdem das Pulver vollständig aufgelöst hat. Bereiten Sie die anderen Ebenen der Konzentration durch Verdünnung mit K-Medium.
4. Bereiten Sie acht parallele Brunnen für jede Konzentration in den chemischen Gradienten. Jedes enthält gut 50 µL 2 x chemische Lösung. Bereiten Sie mindestens drei Gruppen von acht parallele Vertiefungen der K-Medium als Steuerelemente (Tabelle 2).
   Hinweis: In Kürze ist ein Volumen von 500 µL 2 x funktionierende Lösung für eine einzelne Dosis von jeder Chemikalie erforderlich.

2. Wurm Vorbereitung

1. Wildtyp N2 Würmer und Escherichia coli OP50-Stämme von Caenorhabditis Genetik Center (CGC) erhalten.
2. Erhalten Sie synchronisierte L4 Würmer.
   1. Wählen Sie eine einzelne Kolonie von E. Coli OP50 aus der Streifen-Platte. Aseptisch impfen Sie die Kolonie in 100 mL LB Brühe und wachsen sie über Nacht bei 37 ° C.
      Hinweis: Die E. Coli OP50 Lösung ist jetzt bereit für die Aussaat auf Nematoden Wachstumsfugen Medium (NGM, Table of Materials).
   2. Gießen Sie NGM in einem 90 mm Kunststoff Petri Teller. Säen Sie jede Platte mit 300 µL E. Coli OP50 Lösung am Tag nach dem Gießen. Ca. 2-3 Tage, bis die meisten der Würmer erwachsenen Stadium erreicht haben inkubieren Sie N2 Würmer auf der NGM-Platten mit OP50 bei 20 ° C.
   3. Ernte trächtigen Würmer in 15 mL sterile konische Zentrifugenröhrchen mit sterilen H₂O. Lassen Sie die Würmer für mindestens 2 min niederzulassen, Aspirieren H₂O, und 5 mL Bleichmittel Puffer (Table of Materials).
   4. Wirbel der Röhre für 5 min, drehen das Rohr für 30 s (bei 1.300 X g), pellet-die Eier, und entsorgen Sie den überstand.
   5. Waschen Sie die Eier mit 5 mL sterilem H₂O und Wirbel der Röhre für 5 S. Zentrifuge das Rohr für 30 s (bei 1.300 X g), entfernen der Überstand und waschen wieder.
   6. Die Eier auf einen neuen NGM-Teller mit OP50 Pipette. Inkubieren sie bei 20 ° C. Am nächsten Morgen die geschlüpften L1 Würmer zu überwachen; die Würmer werden das L4-Stadium in ca. 40 h erreichen.
3. Waschen Sie die L4-Würmer ab 90 mm Petri Platten mit K-Medium in ein 50 mL sterile konische Rohr. Passen Sie die Konzentration der Würmer zu ~ 40 Tieren pro 100 µL K-Medium unter einem Stereomikroskop. Fügen Sie 50 µL (~ 20 Würmer) in jede Vertiefung von 384-Well-Platte. Diese synchronisierte Würmer (L4-Stadium) sind bereit für den Anschluss an die Behandlung durch Chemikalien.

3. chemische Behandlung und Videoaufnahme

Hinweis: In einem 384-Well-Platte sind Würmer (in jede Vertiefung 50 µL) sechs bis sieben Dosierungen von einer einzelnen Chemikalie (Tabelle 1) behandelt. Bereiten Sie acht parallele Brunnen, jeweils 50 µL 2 x chemische Lösung für jede Dosierung (acht Brunnen sind gefüllt mit der gleichen chemischen und die gleiche Konzentration, Tabelle 2). Alle Videos werden mit einer digitalen Kamera angebracht zu einem inversen Mikroskop (Table of Materials) gesammelt. Die chemische Behandlung Experiment dauert 24 Stunden. Fügen Sie keine bakterielle Nahrung in jede Vertiefung während des 24 h-chemische Behandlung-Experiments.

1. Vor dem Hinzufügen von Chemikalien, 384-Well-Platte mit den synchronisierten Würmern auf die automatische Bühne und nehmen Sie Videos von jeder gut mit dem programmierten Erwerb-Verfahren (7 Bilder pro Sekunde für 2 s; es dauert ~ 25 min zu jeder Platte Scannen).
2. Fügen Sie 50 µL 2 x chemische Lager zubereitet nach Absatz 1 für jede Vertiefung (Tabelle 2). Stellen Sie die Zeit, als die 0 h-Punkt.
3. 384-Well-Platte bei 20 ° C inkubieren und bei 80 u/min in einem Inkubator-Shaker schütteln.
4. Entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator und überträgt es auf einem automatischen Stadium. Nehmen Sie Videos von jeder gut die ganze Platte um 12 h und 24 h, die Phänotypen der Würmer für jede spezifische chemische Behandlung in K-Medium zu überprüfen. Ca. 25 min sind erforderlich für eine Platte Bildschirm.

4. Experiment Videoverarbeitung

Hinweis: Ein Programm für experimentelles Video und Bilder Verarbeitung entstand und verpackt. Es kann frei heruntergeladen werden (siehe Tabelle der Materialien). Das experimentelle Video in Form einer Bildsequenz Frame gespeichert, und die Bildfolge von jedem Video wird in einem bestimmten Verzeichnis gespeichert. Das Programm erkennt Würmer und Phänotypen automatisch zu quantifizieren.

1. Fügen Sie in der grafischen Benutzeroberfläche (GUI, Abb. 1) die Parameter, wie die Frame-Sequenz-Verzeichnis, das Ausgabeverzeichnis und Wurm-Size-Parameter der Bewegung Schwelle Parameter. Klicken Sie auf die Schaltfläche analysieren um die experimentelle Bilder zu bearbeiten.
   1. Klicken Sie auf Wählen Sie wählen Sie das Quellverzeichnis Bilder.
   2. Die mittleren Ergebnis-Verzeichnis in der Schnittstelle hinzufügen.
      Hinweis: Die mittleren Ergebnisse enthalten die segmentierte Bilder. Diese mittleren Ergebnisse eignen sich für die visuelle Beobachtung der bearbeiteten Bilder.
   3. Das Endergebnis-Verzeichnis in der Schnittstelle hinzufügen.
   4. Fügen Sie die durchschnittliche Wurm-Size-Parameter in der Wurm Größe Textbox in der Schnittstelle.
      Hinweis: Der Size-Parameter, die in den Experimenten ist 2.000.
   5. Fügen Sie die Schwelle des verschobenen Verhältnis in der Schnittstelle.
      Hinweis: Das Verhältnis in den Experimenten verwendeten beträgt 0,93.
   6. Klicken Sie auf die Schaltfläche analysieren , um die Bildbearbeitung zu starten. Klicken Sie auf die Schaltfläche Zurücksetzen , um die zusätzlichen Parameter zu löschen.
      Hinweis: Es gibt 33 Funktionen definiert und quantifiziert für Würmer. Die definierten Phänotypen sind sortiert nach Kategorien (siehe Tabelle 3). Diese Funktionen können vom experimentellen Bilder quantifiziert werden. Ein quantitativer Vergleich unter verschiedenen Chemikalien, die unterschiedliche Toxizitäten, kann durch den Vergleich dieser Eigenschaften erfolgen.

Ergebnisse

Wir haben die Phänotypen von Würmern ausgesetzt, unterschiedliche Konzentrationen von mehr als 10 Chemikalien¹²getestet. Im Test waren 33 besondere Merkmale für jede chemische Verbindung zu drei Zeitpunkten (0 h, 12 h und 24 h) quantifiziert. Zuvor erfolgte ein Vergleich zwischen einer manuellen und einer automatischen Analyse eines Lebensdauer Assays^11,12. In diesem Test fanden wir, dass Chemikalien und...

Diskussion

Die Vorteile von C. Elegans führten zu seiner zunehmenden Verwendung in Toxikologie⁹, sowohl für mechanistische Studien und Hochdurchsatz-Screening Ansätze. Eine stärkere Rolle für C. Elegans in Ergänzung zu anderen Modellsysteme in der toxikologischen Forschung hat in den letzten Jahren, vor allem für die schnelle Toxizität Bewertung neuer Chemikalien beachtlich. Dieser Artikel enthält eine neue quantitative Hochdurchsatz-Screening von Wurm-Assay Phänotypen in einem 38...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Propanol	Sigma-Aldrich	59300
384-well plates	Throme	142761
Agar	Bacto	214010
Atropine sulfate	Sigma-Aldrich	PHL80892
Bleach buffer			0.5 mL of 10 M NaOH, 0.5 mL of5% NaClO, 9 mL ofultrapure water
Cadmium chloride	Sigma-Aldrich	202908
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	21074
CCD camera	Zeiss	AxioCam HRm	Zeiss microscopy GmbH
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C8667
Copper(II) sulfate	Sigma-Aldrich	451657
Ethanol	Sigma-Aldrich	24105
Ethylene glycol	Sigma-Aldrich	324558
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
K-Medium			3.04 g of NaCl and 2.39 g of KCl in 1 L ultrapure water
LB Broth			10 g/L Tryptone, 5 g/L Yeast Extract, 5 g/L NaCl
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	63140
NGM Plate			3 g ofNaCl, 17 g ofagar, 2.5 g ofpeptone in 1 L of ultrapure water, after autoclave add 1 mL of cholesterol (5 mg/mL in ethanol), 1 mL of MgSO4 (1 M), 1 mL of CaCl2 (1 M), 25 mL of PPB buffer
Peptone	Bacto	211677
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	60130
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	795496
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	795488
PPB buffer			35.6 g of K2HPO4, 108.3 g of KH2PO4 in 1 L ultrapure water
shaker	ZHICHENG	ZWY-200D
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	71382
Sodium fluoride	Sigma-Aldrich	s7920
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	71690
Sodium hypochlorite solution	Sigma-Aldrich	239305
The link of program			https://github.com/weiyangc/ImageProcessForWellPlate
Tryptone	Sigma-Aldrich	T7293
Yeast extract	Sigma-Aldrich	Y1625
Zeiss automatic microscope	Zeiss	AXIO Observer.Z1	Zeiss automatic microsco with peproprietary software Zen2012 and charge coupled device(CCD) camera