Um ensaio de alta produtividade para a predição da toxicidade química por Automated Caracterização fenotípica de Caenorhabditis elegans

Resumo

Um método quantitativo foi desenvolvido para identificar e prever a toxicidade aguda de substâncias químicas, analisando automaticamente a caracterização fenotípica de Caenorhabditis elegans. Este protocolo descreve como tratar vermes com produtos químicos em uma placa de 384, capturar vídeos e quantificar toxicológicos fenótipos relacionados.

Resumo

Aplicação de testes de toxicidade de produtos químicos em organismos superiores de ordem, tais como ratos ou ratos, é demorado e caro, devido a sua longa vida útil e problemas de manutenção. Pelo contrário, o nematódeo Caenorhabditis elegans (c. elegans) tem vantagens para torná-lo uma escolha ideal para o teste de toxicidade: uma vida curta, fácil cultivo e reprodução eficiente. Aqui, descrevemos um protocolo para a perfilação fenotípica automática de c. elegans em uma placa de 384. Os vermes nematoides são cultivados em uma placa de 384 com tratamento líquido médio e química, e vídeos são tomados de cada poço para quantificar a influência química em 33 características de worm. Resultados experimentais demonstram que as características do fenótipo quantificados podem classificar e prever a toxicidade aguda por compostos químicos e estabelecer uma lista de prioridade para mais testes de avaliação de toxicidade química tradicional em um modelo de roedor.

Introdução

Juntamente com o rápido desenvolvimento de compostos químicos aplicados à produção industrial e o cotidiano das pessoas, é importante estudar a toxicidade testando modelos para os produtos químicos. Em muitos casos, o modelo animal roedor é empregado para avaliar a toxicidade potencial de diferentes substâncias químicas na saúde. Em geral, a determinação da concentração letal (i.e., a analisado 50% dose letal [LD50] de produtos químicos diferentes) é usada como o parâmetro tradicional em um modelo de roedores (rato/mouse) in vivo que é muito caro e demorado. Além disso, devido a reduzir, refinar, ou substituir o princípio (3R) que é central à ética e ao bem-estar dos animal, novos métodos que permitem a substituição de animais superiores são valiosos para a pesquisa científica^1,2,3 . C. elegans é um nemátodo de vida livre que foi isolado do solo. Ele foi amplamente utilizado como um organismo de investigação no laboratório por causa de suas características benéficas, tais como um tempo de vida curto, fácil cultivo e reprodução eficiente. Além disso, muitos caminhos biológicos fundamentais, incluindo os processos fisiológicos básicos e respostas de estresse em c. elegans, são conservados no maior mamíferos^{4,5,6,7 , 8}. em algumas comparações que nós e os outros fizeram, há uma boa concordância entre a toxicidade de c. elegans e a toxicidade observada em roedores⁹. Tudo isso faz c. elegans , um bom modelo para testar os efeitos da toxicidade química in vivo.

Recentemente, alguns estudos quantificar as características fenotípicas de c. elegans. Os recursos podem ser usados para analisar a toxicidade dos produtos químicos,^2,3,10 e o envelhecimento dos vermes¹¹. Também desenvolvemos um método que combina um verme líquido cultivo sistema e um sistema de análise de imagem, na qual os vermes são cultivados em uma placa de 384 sob diferentes tratamentos químicos¹². Esta técnica quantitativa foi desenvolvida para analisar automaticamente os 33 parâmetros de c. elegans após 12-24h de tratamento químico em uma placa com meio líquido de 384. Numa fase de microscópio automatizado é usada para aquisição de vídeo experimental. Os vídeos são processados por um programa de design personalizado, e 33 características relacionadas ao comportamento em movimento dos vermes são quantificadas. O método é usado para quantificar os fenótipos de worm sob o tratamento de 10 compostos. Os resultados mostram que a toxicidades diferentes podem alterar os fenótipos de c. elegans. Estes fenótipos quantificados podem ser usados para identificar e prever a toxicidade aguda de diferentes compostos químicos. O objectivo geral deste método é para facilitar a observação e quantificação fenotípica de experimentos com c. elegans em uma cultura líquida. Este método é útil para a aplicação do c. elegans em avaliações de toxicidade química e quantificações de fenótipo, que ajudam a prever a toxicidade aguda de diferentes compostos químicos e estabelecer uma lista de prioridade para mais tradicional testes de avaliação da toxicidade química em um modelo de roedor. Além disso, esse método pode ser aplicado à toxicidade de triagem e testes de novos produtos químicos ou o composto, como a poluição de agente aditivo de alimento pharmacautical compostos, compostos exógenos ambiental e assim por diante.

Protocolo

O protocolo segue as diretrizes de cuidados com animais do Comitê de ética Animal, do centro de Pequim para prevenção de doenças e controle na China.

1. química preparação

1. Obter produtos químicos (tabela 1 e Tabela de materiais).
2. Determine a maior e menor dosagem dos produtos químicos individuais para uma concentração mínima de letalidade de 100% (LC100, 24 h) e uma concentração máxima de 100% nonlethality (LC0, 24 h) para vermes. Use pelo menos seis diluições da concentração mais elevada (tabela 1).
   Nota: Realizar um teste de letalidade worm preliminar⁹ para explorar LC100 e LC0 para um novo produto químico, para determinar a dosagem.
3. Dilua cada produto químico com K-médias (Tabela de materiais) para 2 x a concentração necessária. Use K-médias como um controle para comparar as alterações do fenótipo causadas por produtos químicos.
   1. Por exemplo, preparar 7 concentrações gradientes de cloreto de cádmio (CdCl₂) (tabela 1). Para preparar 2 x a maior solução concentrada aquosa (4,64) mg/mL, dissolver 92,8 mg de CdCl₂ pó contínuo em 8 mL de K-médias e preencher até 10 mL após dissolver completamente o pó. Prepare os outros níveis de concentração, diluição com K-médias.
4. Prepare oito poços paralelos para cada concentração no gradiente químico. Bem, cada um contém 50 µ l do 2 x solução química. Prepare pelo menos três grupos de oito poços paralelos de K-médias como controles (tabela 2).
   Nota: em breve, um volume de 500 µ l de solução de trabalho de 2x é necessário para uma dose única de cada produto químico.

2. worm preparação

1. Obter o selvagem-tipo N2 worms e estirpes de Escherichia coli OP50 do centro de genética do Caenorhabditis (CGC).
2. Obter sincronizado L4 de vermes.
   1. Escolha uma única colônia de e. coli OP50 da placa de raia. Assepticamente, inocular a colônia em 100 mL de caldo LB e cultivá-lo durante a noite a 37 ° C.
      Nota: A solução de OP50 de e. coli está agora pronta para propagação de placas de nematoides crescimento médio (NGM, Tabela de materiais).
   2. Despeje uma placa de Petri de plástico 90mm NGM. O dia depois de derramar as sementes cada placa com 300 µ l de solução de Escherichia coli OP50. Incube N2 vermes nas placas NGM com OP50 a 20 ° C por cerca de 2-3 dias até que a maioria dos vermes chegaram a fase adulta.
   3. Colheita de vermes grávidas em um tubo de centrifuga conico estéril 15 mL com estéril H₂O. Deixe os vermes sossegar pelo menos 2 min, Aspire o H₂O e adicionar 5 mL de tampão de lixívia (Tabela de materiais).
   4. Vórtice do tubo por 5 min, girar o tubo por 30 s (a 1.300 x g) para os ovos de pelotas e descartar o sobrenadante.
   5. Lave os ovos com 5 mL de estéril H₂O e vortex o tubo para 5 s. centrifugar o tubo por 30 s (a 1.300 x g), remover o sobrenadante e lavar novamente.
   6. Pipete os ovos em um prato novo de NGM com OP50. Incube-os a 20 ° C. Monitorar os vermes L1 hachurados na manhã seguinte; os vermes atingirá o estágio de L4 em aproximadamente 40 h.
3. Lave os vermes L4 fora as placas de Petri de 90 mm com K-médio em um tubo cônico estéril 50 mL. Ajuste a concentração de minhocas para ~ 40 animais por 100 µ l de K-médias sob um estereomicroscópio. Adicione 50 µ l (~ 20 vermes) em cada poço da placa de 384 poços. Esses vermes sincronizados (fase de L4) estão prontos para o seguinte tratamento por produtos químicos.

3. tratamento químico e captura de vídeo

Nota: Em uma placa de 384, vermes (50 µ l em cada poço) são tratados para seis a sete doses de uma substância individual (tabela 1). Prepare oito poços paralelos, cada um contendo 50 µ l do 2 x solução química para cada dosagem (oito poços são preenchidos com a mesma química e a mesma concentração, tabela 2). Todos os vídeos são coletados usando uma câmera digital conectada a um microscópio invertido (Tabela de materiais). A experiência de tratamento químico dura 24h. Não adicione alimentar bacteriana a cada poço durante o experimento de tratamento químico de 24 h.

1. Antes de adicionar os produtos químicos, coloque a placa de 384-bem com os vermes sincronizados no palco automático e vídeos de cada poço com o procedimento de aquisição programada (7 frames por segundo para 2 s; demora ~ 25 min para fazer a varredura de cada placa).
2. Adicione 50 µ l do 2 x ações químicas preparadas de acordo com a seção 1 para cada poço (tabela 2). Defina o tempo como o ponto 0 h.
3. Incubar a placa de 384 a 20 ° C e agitar a 80 rpm em um shaker de incubadora.
4. Retirar a placa da incubadora e transferi-lo para um estágio automático. Pegue vídeos de cada poço da placa inteira, às 12 h e 24 h, para verificar os fenótipos dos vermes para cada tratamento químico específico no K-médias. Aproximadamente 25 min são necessários para a tela de um prato.

4. processamento de vídeo experimento

Nota: Um programa para processamento de imagens e vídeo experimental foi escrito e embalado. Ele pode ser baixado livremente (ver Tabela de materiais). O vídeo experimental é armazenado sob a forma de uma sequência de quadros de imagem, e a sequência do quadro de cada vídeo é armazenada em um diretório específico. O programa pode reconhecer vermes e quantificar fenótipos automaticamente.

1. Na interface de usuário gráfica (GUI, Figura 1), adicione os parâmetros, tais como o diretório de sequência do quadro, o diretório de saída, o parâmetro de tamanho de verme e o parâmetro de limite de movimento. Clique no botão Analyze para processar as imagens experimentais.
   1. Clique no botão selecionar para escolher o diretório de imagens de origem.
   2. Adicione o diretório de resultado médio na interface.
      Nota: Os resultados médios incluem as imagens segmentadas. Estes resultados médios são úteis para a observação visual das imagens processadas.
   3. Adicione o diretório de resultado final na interface.
   4. Adicione o parâmetro de tamanho médio worm na caixa de texto Tamanho do verme na interface.
      Nota: O parâmetro de tamanho utilizado nos experimentos é 2.000.
   5. Adicione o limiar da relação movida na interface.
      Nota: A proporção utilizada nos experimentos é 0,93.
   6. Clique no botão Analyze para iniciar o processamento de imagem. Clique no botão de Reset para limpar os parâmetros adicionados.
      Nota: Existem 33 recursos definidos e quantificados para vermes. Todos os fenótipos definidos são classificados por categorias (listadas na tabela 3). Estas características podem ser quantificadas de imagens experimentais. Uma comparação quantitativa entre diferentes produtos químicos, que possuem toxicidades diferentes, pode ser feita comparando esses recursos.

Resultados

Nós testamos os fenótipos de vermes expostos a diferentes concentrações de mais de 10 produtos químicos¹². No teste, 33 características distintas foram quantificadas para cada produto químico composto em três pontos de tempo (0 h, 12 h e 24 h). Uma comparação entre um manual e uma análise automática de um ensaio de vida útil foi feita previamente,^11,12. Neste ensaio, encontramos que os produtos...

Discussão

As vantagens de c. elegans levaram-se a sua crescente utilização em toxicologia⁹, tanto para estudos mecanicistas e abordagens de seleção da elevado-produção. Um papel acrescido para c. elegans em complementando outros sistemas modelo na pesquisa toxicológica tem sido notável nos últimos anos, especialmente para a avaliação da toxicidade rápida de novas substâncias químicas. Este artigo fornece um novo ensaio de triagem elevado-throughput, quantitativo de worm fenó...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Propanol	Sigma-Aldrich	59300
384-well plates	Throme	142761
Agar	Bacto	214010
Atropine sulfate	Sigma-Aldrich	PHL80892
Bleach buffer			0.5 mL of 10 M NaOH, 0.5 mL of5% NaClO, 9 mL ofultrapure water
Cadmium chloride	Sigma-Aldrich	202908
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	21074
CCD camera	Zeiss	AxioCam HRm	Zeiss microscopy GmbH
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C8667
Copper(II) sulfate	Sigma-Aldrich	451657
Ethanol	Sigma-Aldrich	24105
Ethylene glycol	Sigma-Aldrich	324558
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
K-Medium			3.04 g of NaCl and 2.39 g of KCl in 1 L ultrapure water
LB Broth			10 g/L Tryptone, 5 g/L Yeast Extract, 5 g/L NaCl
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	63140
NGM Plate			3 g ofNaCl, 17 g ofagar, 2.5 g ofpeptone in 1 L of ultrapure water, after autoclave add 1 mL of cholesterol (5 mg/mL in ethanol), 1 mL of MgSO4 (1 M), 1 mL of CaCl2 (1 M), 25 mL of PPB buffer
Peptone	Bacto	211677
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	60130
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	795496
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	795488
PPB buffer			35.6 g of K2HPO4, 108.3 g of KH2PO4 in 1 L ultrapure water
shaker	ZHICHENG	ZWY-200D
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	71382
Sodium fluoride	Sigma-Aldrich	s7920
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	71690
Sodium hypochlorite solution	Sigma-Aldrich	239305
The link of program			https://github.com/weiyangc/ImageProcessForWellPlate
Tryptone	Sigma-Aldrich	T7293
Yeast extract	Sigma-Aldrich	Y1625
Zeiss automatic microscope	Zeiss	AXIO Observer.Z1	Zeiss automatic microsco with peproprietary software Zen2012 and charge coupled device(CCD) camera