Un saggio di High-throughput per la previsione di tossicità chimica di Automated fenotipica profilatura di Caenorhabditis elegans

Riepilogo

Un metodo quantitativo è stato sviluppato per identificare e prevedere la tossicità acuta dei prodotti chimici analizzando automaticamente l'analisi fenotipica dei Caenorhabditis elegans. Questo protocollo descrive come trattare vermi con prodotti chimici in una piastra 384 pozzetti, catturare video e quantificare tossicologici fenotipi correlati.

Abstract

L'applicazione di test di tossicità delle sostanze chimiche negli organismi superiori di ordine, come topi o ratti, è lungo e costoso, grazie alla loro lunga durata di vita e problemi di manutenzione. Al contrario, il nematode Caenorhabditis elegans (c. elegans) presenta vantaggi per renderlo la scelta ideale per i test di tossicità: una vita relativamente breve, facile coltivazione e riproduzione efficiente. Qui, descriviamo un protocollo per la profilazione fenotipica automatica di c. elegans in una piastra 384 pozzetti. I vermi del nematode sono coltivati in una piastra 384 pozzetti con trattamento medio e chimico liquidi e video è presi di ciascun pozzetto per quantificare l'influenza chimica su 33 caratteristiche di verme. Risultati sperimentali dimostrano che le caratteristiche di fenotipo quantificati possono classificare e prevedere la tossicità acuta di diversi composti chimici e stilare un elenco di priorità per ulteriori prove di valutazione di tossicità chimica tradizionale in un modello del roditore.

Introduzione

Con il rapido sviluppo di composti chimici applicato alla produzione industriale e la vita quotidiana delle persone, è importante studiare la tossicità test di modelli per le sostanze chimiche. In molti casi, il modello animale roditore è impiegato per valutare la potenziale tossicità di diverse sostanze chimiche sulla salute. In generale, la determinazione delle concentrazioni letali (cioè, la dosati 50% dose letale [LD50] di diverse sostanze chimiche) è utilizzata come parametro tradizionale in un modello di roditore (ratto/topo) in vivo, che è molto costoso e richiede tempo. Inoltre, a causa della riduzione, affinare, o sostituire il principio di (3R) che è centrale per etica e sul benessere degli animali, nuovi metodi che consentono per la sostituzione degli animali superiori sono preziose per la ricerca scientifica^1,2,3 . C. elegans è un nematode dissipato che è stato isolato dal suolo. È stato ampiamente utilizzato come un organismo di ricerca in laboratorio per le sue caratteristiche benefiche, come una vita relativamente breve, facile coltivazione e riproduzione efficiente. Inoltre, molte vie biologiche fondamentali, tra cui processi fisiologici di base e le risposte di sforzo in c. elegans, sono conservate nei più alti mammiferi^{4,5,6,7 , 8}. in un paio di confronti noi ed altri abbiamo fatto, c'è una buona concordanza tra tossicità di c. elegans e tossicità osservati in roditori⁹. Tutto ciò fa di c. elegans un buon modello per testare gli effetti di tossicità chimica in vivo.

Recentemente, alcuni studi quantificato le caratteristiche fenotipiche di c. elegans. Le caratteristiche possono essere utilizzate per analizzare la tossicità dei prodotti chimici^2,3,10 e l'invecchiamento dei vermi¹¹. Abbiamo anche sviluppato un metodo che combina un verme liquido coltura sistema e un sistema di analisi di immagine, in cui i vermi sono coltivati in una piastra 384 pozzetti in diversi trattamenti chimici¹². Questa tecnica quantitativa è stata sviluppata per analizzare automaticamente i 33 parametri di c. elegans dopo 12-24h di trattamento chimico in una piastra 384 pozzetti con mezzo liquido. Una fase di microscopio automatizzato viene utilizzata per l'acquisizione dei video sperimentali. I video vengono elaborati da un programma di misura, e sono quantificati 33 caratteristiche relazionati al comportamento commovente ai vermi. Il metodo viene utilizzato per quantificare i fenotipi di vite senza fine nell'ambito del trattamento di 10 composti. I risultati mostrano che le diverse tossicità possono alterare i fenotipi di c. elegans. Questi fenotipi quantificati possono essere utilizzati per identificare e prevedere la tossicità acuta di diversi composti chimici. L'obiettivo generale di questo metodo è quello di facilitare l'osservazione e la quantificazione fenotipica degli esperimenti con c. elegans in una coltura liquida. Questo metodo è utile per l'applicazione di c. elegans in valutazioni di tossicità chimica e quantificazioni di fenotipo, che aiutano a prevedere la tossicità acuta di diversi composti chimici e stabilire una lista di priorità per ulteriori tradizionale test di valutazione di tossicità chimica in un modello del roditore. Inoltre, questo metodo può essere applicato alla tossicità di screening e test di nuove sostanze chimiche o il composto come l'inquinamento agente additivo alimentare, composti farmaceutici, composti esogeni ambientali e così via.

Protocollo

Il protocollo segue le indicazioni di cura degli animali del Comitato di etica animale del centro di Pechino per la prevenzione e il controllo in Cina.

1. preparazione chimica

1. Ottenere prodotti chimici (tabella 1 e Tabella materiali).
2. Determinare il dosaggio più alto e più basso dei singoli prodotti chimici per una concentrazione minima di 100% letalità (LC100, 24 h) e una concentrazione massima del 100% nonlethality (LC0, 24 h) alle viti senza fine. Utilizzare almeno sei diluizioni della più alta concentrazione (tabella 1).
   Nota: Condurre un verme preliminare letalità prova⁹ per esplorare LC100 e LC0 per un nuovo prodotto chimico, per determinare il dosaggio.
3. Diluire ciascuna sostanza chimica con K-medie (Tabella materiali) a 2 volte la concentrazione necessaria. Utilizzare K-medie come controllo per confrontare le alterazioni del fenotipo causate dai prodotti chimici.
   1. Ad esempio, preparare gradiente 7 concentrazioni di cloruro di cadmio (CdCl₂) (tabella 1). Per preparare 2 x soluzione acquosa concentrata più alta (4,64 mg/mL), sciogliere 92,8 mg di CdCl₂ polvere solida in 8 mL di K-medie e riempire fino a 10 mL dopo la polvere si è sciolta completamente. Preparare gli altri livelli di concentrazione mediante diluizione con K-medie.
4. Preparare otto pozzi paralleli per ogni concentrazione del gradiente chimico. Ciascun pozzetto contiene 50 µ l di soluzione chimica di 2x. Preparare almeno tre gruppi di otto pozzi paralleli di K-medie come controlli (tabella 2).
   Nota: In breve, un volume di 500 µ l di soluzione di lavoro: 2x è necessario per una dose singola di ogni prodotto chimico.

2. preparazione verme

1. Ottenere il selvaggio-tipo N2 worm e ceppi di Escherichia coli OP50 da Caenorhabditis Genetics Center (CGC).
2. Ottenere sincronizzato L4 vermi.
   1. Scegliere una singola colonia di Escherichia coli OP50 dalla piastra di striscia. Asetticamente inoculare la Colonia in 100 mL di brodo LB e crescere in una notte a 37 ° C.
      Nota: La soluzione di e. coli OP50 è ora pronta per la semina a piatti di mezzo (NGM, Tabella materiali) di sviluppo del nematode.
   2. Versare NGM in una plastica piastra di Petri di 90 mm. Semi di ogni piatto con 300 µ l di soluzione di Escherichia coli OP50 il giorno dopo la colata. Incubare N2 vermi sulle piastre NGM con OP50 a 20 ° C per circa 2-3 giorni fino a quando la maggior parte dei vermi hanno raggiunto lo stadio adulto.
   3. Worm gravid raccolto in una provetta sterile conica per centrifuga 15 mL con sterile H₂O. Lasciate che i vermi stabilirsi per almeno 2 min, aspirare l' H₂O e aggiungere 5 mL di tampone di candeggina (Tabella materiali).
   4. Vortex la provetta per 5 minuti, girare il tubo per 30 s (a 1.300 x g) per le uova di pellet e scartare il surnatante.
   5. Lavare le uova con 5 mL di H₂O sterile e vortexare la provetta per 5 s. Centrifugare la provetta per 30 s (a 1.300 x g), rimuovere il surnatante e lavare nuovamente.
   6. Le uova su un piatto nuovo NGM con OP50 una pipetta. Li Incubare a 20 ° C. Monitorare i vermi L1 tratteggiati la mattina successiva; i vermi raggiungerà la fase L4 in circa 40 h.
3. Lavare i vermi L4 fuori le piastre di Petri di 90 mm con K-medie in una provetta conica sterile 50 mL. Regolare la concentrazione di vermi a ~ 40 animali per 100 µ l di K-medie sotto un microscopio stereoscopico. Aggiungere 50 µ l (~ 20 vermi) in ciascun pozzetto della piastra 384 pozzetti. Questi vermi sincronizzati (fase L4) sono pronti per il seguente trattamento di sostanze chimiche.

3. chimica trattamento e acquisizione video

Nota: In un piatto di 384 pozzetti, vermi (50 µ l in ogni pozzetto) sono trattati a sei a sette dosi di una sostanza chimica individuale (tabella 1). Preparare otto pozzi paralleli, ciascuno contenente 50 µ l di 2x soluzione chimica per ogni dosaggio (otto pozzi sono riempiti con lo stesso prodotto chimico e la stessa concentrazione, tabella 2). Tutti i video sono raccolti utilizzando una fotocamera digitale collegata al microscopio invertito (Tabella materiali). L'esperimento di chimica trattamento dura per 24 h. Non aggiungere cibo batterico in ciascun pozzetto durante l'esperimento di trattamento chimico di 24 h.

1. Prima di aggiungere i prodotti chimici, porre la piastra 384 pozzetti con i vermi sincronizzati sulla scena automatico e prendere i video di ciascun pozzetto con la procedura di acquisizione programmata (7 fotogrammi al secondo per 2 s; prende ~ 25 min per eseguire la scansione ogni piatto).
2. Aggiungere 50 µ l di 2x chimica brodo preparato conformemente al punto 1 per ciascun pozzetto (tabella 2). Impostare il tempo come il punto h 0.
3. Incubare la piastra 384 pozzetti a 20 ° C e agitare a 80 rpm in un agitatore incubatore.
4. Rimuovere la piastra dall'incubatrice e trasferirlo in una fase automatica. Prendere i video di ciascun pozzetto della piastra intera, alle ore 12 e a 24 h, per controllare i fenotipi dei vermi per ogni specifico trattamento chimico in K-medie. Circa 25 min sono necessari per schermo piatto.

4. elaborazione video esperimento

Nota: Un programma per elaborazione di immagini e video sperimentali è stato scritto e confezionato. Può essere liberamente scaricato (Vedi Tabella materiali). Il video sperimentale è memorizzato sotto forma di una sequenza di frame di immagine, e la sequenza di fotogrammi di ogni video è memorizzata in una directory specifica. Il programma è in grado di riconoscere il worm e quantificare fenotipi automaticamente.

1. Nell'interfaccia utente grafica (GUI, Figura 1), aggiungere i parametri, ad esempio la directory di sequenza di frame, la directory di output, il parametro di dimensione del verme e il parametro di soglia di movimento. Fare clic sul pulsante Analyze per elaborare le immagini sperimentali.
   1. Fare clic sul pulsante Seleziona per scegliere la directory di immagini di origine.
   2. Aggiungere la directory di risultato intermedio nell'interfaccia.
      Nota: I risultati centrali includono le immagini segmentate. Questi risultati centrali sono utili per l'osservazione visiva delle immagini elaborate.
   3. Aggiungere la directory di risultato finale nell'interfaccia.
   4. Aggiungere il parametro di dimensione medio verme nella casella Dimensione del verme nell'interfaccia.
      Nota: Il parametro di dimensione utilizzato negli esperimenti è 2.000.
   5. Aggiungere la soglia del rapporto spostato nell'interfaccia.
      Nota: Il rapporto utilizzato negli esperimenti è 0,93.
   6. Fare clic sul pulsante analizza per avviare l'elaborazione di immagini. Fare clic sul pulsante Reset per cancellare i parametri aggiunti.
      Nota: Ci sono 33 caratteristiche definito e quantificato per i vermi. Tutti i fenotipi definiti sono ordinati per categorie (riportate nella tabella 3). Queste caratteristiche possono essere quantificate dalle immagini sperimentali. Un confronto quantitativo tra diverse sostanze chimiche, che hanno diversa tossicità, può essere fatto confrontando queste caratteristiche.

Risultati

Abbiamo testato i fenotipi di vermi esposti a diverse concentrazioni di più di 10 prodotti chimici¹². Nel test, 33 caratteristiche distinte sono state quantificate per ogni composto a tre intervalli di tempo (h 0, 12h e 24h) chimico. In precedenza, un confronto tra un manuale e un'analisi automatica di un test di durata della vita è stato fatto^11,12. In questa analisi, abbiamo trovato che prodotti chimici...

Discussione

I vantaggi di c. elegans hanno portato al suo utilizzo crescente in tossicologia⁹, sia per studi meccanicistici e approcci di screening ad alta resa. Un ruolo maggiore per c. elegans nell'integrare altri sistemi di modello nella ricerca tossicologica è stato notevole negli ultimi anni, soprattutto per la valutazione della tossicità rapida di nuove sostanze chimiche. Questo articolo fornisce una nuova analisi di screening ad alta resa, quantitativa del worm fenotipi in una piast...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Propanol	Sigma-Aldrich	59300
384-well plates	Throme	142761
Agar	Bacto	214010
Atropine sulfate	Sigma-Aldrich	PHL80892
Bleach buffer			0.5 mL of 10 M NaOH, 0.5 mL of5% NaClO, 9 mL ofultrapure water
Cadmium chloride	Sigma-Aldrich	202908
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	21074
CCD camera	Zeiss	AxioCam HRm	Zeiss microscopy GmbH
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C8667
Copper(II) sulfate	Sigma-Aldrich	451657
Ethanol	Sigma-Aldrich	24105
Ethylene glycol	Sigma-Aldrich	324558
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
K-Medium			3.04 g of NaCl and 2.39 g of KCl in 1 L ultrapure water
LB Broth			10 g/L Tryptone, 5 g/L Yeast Extract, 5 g/L NaCl
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	63140
NGM Plate			3 g ofNaCl, 17 g ofagar, 2.5 g ofpeptone in 1 L of ultrapure water, after autoclave add 1 mL of cholesterol (5 mg/mL in ethanol), 1 mL of MgSO4 (1 M), 1 mL of CaCl2 (1 M), 25 mL of PPB buffer
Peptone	Bacto	211677
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	60130
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	795496
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	795488
PPB buffer			35.6 g of K2HPO4, 108.3 g of KH2PO4 in 1 L ultrapure water
shaker	ZHICHENG	ZWY-200D
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	71382
Sodium fluoride	Sigma-Aldrich	s7920
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	71690
Sodium hypochlorite solution	Sigma-Aldrich	239305
The link of program			https://github.com/weiyangc/ImageProcessForWellPlate
Tryptone	Sigma-Aldrich	T7293
Yeast extract	Sigma-Aldrich	Y1625
Zeiss automatic microscope	Zeiss	AXIO Observer.Z1	Zeiss automatic microsco with peproprietary software Zen2012 and charge coupled device(CCD) camera