مجموعة جاميت والإخصاب في المختبر من أسيتاناكس المكسيكية

Summary

الإخصاب في المختبر هو تقنية شائعة الاستخدام مع مجموعة متنوعة من الكائنات الحية النموذجية للحفاظ على مجموعات المختبرات وإنتاج الأجنة المتزامنة للتطبيقات النهائية. هنا، نقدم بروتوكول اطبق هذه التقنية لمختلف مجموعات الأسماك المكسيكية رباعي، Astyanax mexicanus.

Abstract

Astyanax mexicanus آخذ في الظهور ككائن حي نموذجي لمجموعة متنوعة من مجالات البحث في العلوم البيولوجية. جزء من النجاح أخيرة من هذا [تلّوست] سمكة نوع أنّ يملك هو يملك [إنترفيتيل] كهف و [ريفر-رلأيشن] مجموعة. وهذا يمكّن من رسم الخرائط الجينية للصفات القابلة للوراثة التي تم إصلاحها أثناء التكيف مع البيئات المختلفة لهذه التجمعات السكانية. في حين يمكن الحفاظ على هذا النوع وتربيته في المختبر، فإنه من الصعب على حد سواء الحصول على الأجنة خلال النهار وخلق الأجنة الهجينة بين سلالات. وقد استخدم الإخصاب في المختبر (IVF) مع مجموعة متنوعة من الكائنات الحية النموذجية المختلفة لتربية الحيوانات بنجاح وبشكل متكرر في المختبر. في هذا البروتوكول، نبين كيف، من خلال التأقلم مع A. mexicanus إلى دورات الضوء المختلفة إلى جانب التغيرات في درجة حرارة المياه، يمكننا تحويل دورات تربية إلى وقت مختار من اليوم. في وقت لاحق، نعرض كيفية تحديد الأسماك الأبوية المناسبة، وجمع الجيمات صحية من الذكور والإناث، وإنتاج ذرية قابلة للحياة باستخدام التلقيح الاصطناعي. وهذا يمكّن الإجراءات ذات الصلة مثل حقن المنشآت الوراثية أو تحليل النمو من أن تحدث خلال ساعات العمل العادية. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام هذه التقنية لخلق هجين بين الكهوف والسكان الذين يعيشون على السطح، وبالتالي تمكين دراسة الأساس الوراثي للتكيفات الفينوتية إلى بيئات مختلفة.

Introduction

في السنوات الأخيرة، أصبحت Astyanax mexicanus كائن حي نموذجي في مجالات مختلفة مثل البيولوجياالتنموية، والبيولوجيا التطورية، والبيولوجيا السلوكية، وعلم وظائف الأعضاء 1،^2،3،4 . تفرد هذا النظام يأتي من هذا النوع وجود العديد من morphotypes التي تكيفت مع بيئات مختلفة جدا. يعيش النمط المورفي للمسكن السطحي في الأنهار حيث يوجد تنوع بيولوجي كبير والكثير من المصادر الغذائية للأسماك. وعلى النقيض من ذلك، فإن أنواع الكهوف من A. mexicanus، وسمك الكهف ، تعيش في الكهوف حيث التنوع البيولوجي ، ومصادر الغذاء ، والأكسجين تتضاءل بشكل كبير¹. أسماك الكهف تختلف عن الأسماك السطحية في مجموعة متنوعة من الأنماط الظاهرية مثل غياب العينينوالتصبغ، ومقاومة الأنسولين، والقدرة على تخزين الدهون 2،^3،4. ومع ذلك، فإن الأسماك السطحية وأسماك الكهف لا تزال تنتمي إلى نفس النوع، وبالتالي فهي التداخلية.

لكل من المورفوتاي، تم تحديد مجموعة من الشروط للسماحبالصيانة الروتينية والتكاثر في ظل الظروف المختبرية 5،^6. ومع ذلك، لا تزال التعديلات الوراثية، والدراسات التنموية الجنينية السليمة، وخلق الهجينة تشكل تحديا لعدة أسباب. A. المكسيكية تفرخ في المقام الأول خلال ساعات الليل وهو أمر غير مريح للتجارب اللاحقة على المراحل الجنينية المبكرة مثل حقن المنشآت الوراثية أو رصد عمليات النمو الجنيني المبكر. وبالإضافة إلى ذلك، جيل من الهجينة السطحية والكهف هو التحدي باستخدام التفريخ الطبيعي، منذ morphotypes الكهف لديها إيقاع circadian تغيير⁷ التي تؤثر في نهاية المطاف على إنتاج البويضة قابلة للحياة. وقد تم وصف إجراءات التلقيح الاصطناعي الناجحة، ولكن الغازية، لأنواع أخرى من Astyanax، حيث تم إعداد إنتاج الجاميت والسلوك التفريخ باستخدام الحقن الهرمونية^8،9. وقد تم وصف إجراءات التلقيح الاصطناعي أقل الغازية (أي الحصول على gametes من التفريخ اليدوي دون حقن الاستعدادات الهرمونية) ولكن لا تنظر في الاختلافات في دورة التفريخ بين الكهف والأنماط المورفولوجية السطحية من A. mexicanus ⁶.

ويمكن بسهولة تعديل الكائنات الحية النموذجية الأخرى للأسماك، مثل سمك الحمار الوحشي، ودراستها وراثيا على المستوى الجنيني لأن العقبات المذكورة أعلاه قد تم حلها بنجاح. وقد دفع تنفيذ تقنيات التربية الموحدة، والإخصاب في المختبر، والحفاظ على الحيوانات المنوية بالتبريد جميعها سمك الحمار الوحشي إلى الأمام وعزز استخدام النموذج في العلوم البيولوجية¹⁰. ولذلك، فإن توسيع نطاق هذه التقنيات إلى A. mexicanus سيزيد من تعزيزها كنظام نموذجي.

هنا، نقدم بروتوكول مفصل للإخصاب خارج الرحم من شأنها أن تساعد على جعل A. mexicanus أكثر سهولة. وسوف نقدم إعداد تربية التي تمكن من تحويل دورات الضوء من الأسماك من النهار إلى الليل بحيث يمكن الحصول على البويضة قابلة للحياة خلال ساعات النهار دون حقن المستحضرات الهرمونية. ثم نقدم وصفا مفصلا لكيفية الحصول على ova وmilt المستخدمة في التلقيح الاصطناعي. وستمكن هذه الطريقة من إنتاج الأجنة خلال ساعات العمل العادية وتجعل المزيد من التطبيقات النهائية أكثر جدوى مقارنة باستخدام الأجنة من التفريخ الطبيعي.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) التابعة لمعهد أبراج للبحوث الطبية.

1. ضوء دورة التلاعب

1. إنشاء خزانات الأسماك داخل غير شفاف، مغلقة بالكامل (حماية الضوء)، وتدفق منخلال نظام تربية الأحياء المائية التي تحتوي على صفوف متعددة من الدبابات (الشكل 1).
   ملاحظة: يستخدم نظام التدفق من خلال كما هو موضح في الشكل 1 مياه النظام لطرد النفايات من خلال الأنابيب الخلفية من كل خزان ويتدفق إلى مستنقع يفرغ في استنزاف صحي. وفي هذه التجربة، استخدم سعر صرف المياه غالون واحد (الولايات المتحدة) في الساعة من خلال باعث بالتنقيط.
2. الحفاظ على درجة حرارة كل خزان مع عنصر التدفئة المستقلة التي تستخدم لتغيير درجة الحرارة يدويا أثناء عملية فتيلة.
3. قم بإعداد صفوف فردية بطريقة لتمكين فترات ضوئية منفصلة في كل منها. تثبيت الأبواب على كل صف التي يمكن إغلاقها لمنع الضوء من الدخول أو الهروب.
   ملاحظة: يمكن تمكين وحدة التحكم التلقائية معالجة كافة الفترات الضوئية مع أقل اضطراب في الأسماك.
4. جهز الحامل بضوء عمل أحمر وستائر تعتيم للوصول خلال ساعات الظلام.

2. ضبط photoperiod وفتيلة الأسماك لجمع gamete

1. إزالة الأسماك المطلوبة(الشكل 2أ)من رفوف النظام العام ووضعها في رفوف تربية للسماح لتعديل الفترة الضوئية 14 يوما قبل فتيلة.
   ملاحظة: هذا يسمح للأسماك للتأقلم مع بيئة جديدة.
2. الحفاظ على الأسماك في 22.8 درجة مئوية (73 درجة فهرنهايت) خلال هذه الفترة باستخدام نظام التدفئة المائية المثبتة. والفترة الضوئية العادية هي من الساعة 00/6 إلى الساعة 00/20، ومن الساعة 00/20 إلى الساعة 00/6 في الظلام. بالنسبة لرف دورة الضوء، قم بتحويل الفترة الضوئية إلى الساعة 10 مساءً إلى الساعة 12 ظهراً وضوء الساعة 12 ظهراً إلى الساعة 10 مساءً في الظلام عن طريق ضبط جهاز ضبط الساعة الذي يقوي الضوء داخل الرف.
   ملاحظة: يتم إيواء الذكور والإناث في نفس الخزان للسماح لسلوكيات فتيلة الطبيعية أن يحدث. في حين أن التفريخ قد يحدث في الخزان، لا يزال يمكن استخدام الأسماك للإخصاب في المختبر منذ يتم الإفراج عن اللجام في مراحل¹¹.
3. وبمجرد أن يتم التأقلم مع الأسماك، ابدأ في تحضير الحيوانات لتفرخ⁵ على النحو المبين في الخطوات 2-3-1 إلى 2-3-5.
   ملاحظة: يستغرق هذا الإجراء ستة أيام في المجموع. خلال هذا الوقت، تغيير درجة الحرارة إلى رئيس إنتاج البويضة باستخدام نظام التدفئة المائية المثبتة. باستخدام سخانات المائية 50W (انظر جدولالمواد)، تعيين سخان مباشرة إلى درجة الحرارة (مقياس على سخان هو في فهرنهايت) نظرا في البروتوكول في كل خطوة. اعتمادا على حجم الخزان ومعدل التدفق من خلال المياه، قد يختلف وقت تعديل درجة الحرارة. في هذه التجربة، تم تعديل درجة الحرارة عند الظهر والمساواة في درجة الحرارة استغرق أكثر من 18 ساعة المقبل.
   1. في اليوم الأول، ارفع درجة الحرارة من 22.8 درجة مئوية (73 درجة فهرنهايت) إلى 24.4 درجة مئوية (76 درجة فهرنهايت).
   2. في اليوم 2، رفع درجة الحرارة من 24.4 درجة مئوية (76 درجة فهرنهايت) إلى 26.1 درجة مئوية (79 درجة فهرنهايت).
   3. في اليوم 3 و 4، والحفاظ على درجة الحرارة عند 26.1 درجة مئوية (79 درجة فهرنهايت). الأسماك ستكون جاهزة لتفرخ خلال النهار ويمكن إجراء التلقيح الاصطناعي.
      ملاحظة: اعتمادا على الأسماك الفردية، يمكن للإناث تفرخ في اليوم 3 و / أو اليوم 4. نوصي بمحاولة الحصول على أوفا في اليوم 3 و / أو اليوم 4 اعتمادا على نجاح جمع ova.
   4. في اليوم 5، خفض درجة الحرارة من 26.1 درجة مئوية (79 درجة فهرنهايت) إلى 24.4 درجة مئوية (76 درجة فهرنهايت).
   5. في اليوم 6، خفض درجة الحرارة من 24.4 درجة مئوية (76 درجة فهرنهايت) إلى 22.8 درجة مئوية (73 درجة فهرنهايت).
      ملاحظة: توفير فجوة 7 أيام قبل تكرار دورة درجة الحرارة هذه. فمن المستحسن الاستمرار في الحفاظ على الأسماك في هذه الفترة الضوئية لأن هذا سوف يقلل من الوقت الإجمالي الذي تحتاجه الأسماك للتكيف مع هذه الدورة الخفيفة تحول.

3. جمع الجيمت الإناث

1. ابدأ بإدخال مناديل مبللة في غطاء طبق بيتري وإغلاق الطبق لإنشاء غرفة رطبة ومنع البويضة من الجفاف أثناء عملية الجمع.
2. المقبل اختيار أنثى لجمع. الأسماك الجاذبة مع البطن كبيرة، جاحظ من المرجح أن يكون الخيار الأفضل لهذا الإجراء (الشكل2a).
   ملاحظة: للتمييز بين الذكور والإناث من الكبار A. mexicanus، تم استخدام طريقة الكرة القطنية¹².
3. تعطيل أنثى باستخدام الماء المبرد ووضعها في موقف supine في حامل الحيوان الإسفنج مبللة. القيام بذلك عن طريق وضع الأسماك في 4 درجة مئوية نظام المياه لمدة 30 ق على الأقل أو حتى يتم تعطيل الأسماك (أي، فقدان حركة الخياشيم، انظر روس وروس¹³ لمزيد من التفاصيل).
   ملاحظة: العمل بسرعة ومحاولة تجنب ارتفاع درجة حرارة الأسماك حتى يتم الانتهاء من الإجراء. وقد يشمل ذلك غمس أطراف الأصابع المحبوبة بشكل دوري في الماء البارد أو تقديم التخدير التكميلي. ويمكن أيضا استخدام أساليب التخدير الأخرى (على سبيل المثال، MS-222^13). بموجب المبادئ التوجيهية للمعهد الدولي للبحوث الطبية، يعتبر الجمع اليدوي للأوا إجراء غير جراحي، والذي لا يتطلب تخديرًا كاملًا (على سبيل المثال، من خلال MS-222).
4. مرة واحدة في وضع، وصمة عار الجانب البطني من الأسماك مع مسح الأنسجة الحساسة كما الاتصال بالماء سوف يسبب البويضة لتنشيط.
5. عقد الأنثى بين الإبهام والسبابة. الضغط بلطف ضد الجانبين الجانبي من تجويف coelomic في اتجاه فتح الجهاز البولي التناسلي في حين المتداول الأصابع قليلا. جمع البويضة أعرب باستخدام ملعقة المتاح.
6. نقل هذه البويضة إلى طبق بيتري المرطبة.
   ملاحظة: قد يتم دمج العديد من براثن ova في نفس الطبق إذا لم تكن هناك حاجة إلى بيانات النسب محددة. يمكن تخزين البويضة في 24 درجة مئوية وهي الأفضل عند استخدامها للإخصاب خارج الرحم في غضون 30-60 دقيقة بعد جمعها.
7. بعد جمع، إعادة بلطف الأسماك إلى خزان الانتعاش مليئة المياه النظام.
   ملاحظة: ضع السمك مرة أخرى في خزان مجلس الوزراء الظلام لجمع البويضة في المستقبل عند الضرورة.

4. جمع gamete الذكور

1. اختيار ذكر لجمع.
   ملاحظة: لا توجد علامات مرئية ظاهرياً من نوعية gamete الذكور. ومع ذلك، يجب أن تظهر الأسماك صحية في المظهر قبل استخدامها في هذا الإجراء. للتمييز بين الذكور والإناث من الكبار A. mexicanus، تم استخدام طريقة الكرة القطنية¹².
2. تعطيل الذكور باستخدام الماء المبرد ووضعه في موقف supine في حامل الحيوان الإسفنج مبللة. تعطيل عن طريق وضع الأسماك في 4 درجة مئوية نظام المياه لمدة 30 ثانية على الأقل أو حتى يتم تعطيل الأسماك (أي، فقدان حركة الخياشيم، انظر روس وروس¹³ لمزيد من التفاصيل).
   ملاحظة: العمل بسرعة ومحاولة تجنب ارتفاع درجة حرارة الأسماك حتى يتم الانتهاء من الإجراء. وقد يشمل ذلك غمس أطراف الأصابع المحبوبة بشكل دوري في الماء البارد أو تقديم التخدير التكميلي. يمكن استخدام طرق التخدير الأخرى (على سبيل المثال، MS-222¹³⁾هنا أيضًا. بموجب المبادئ التوجيهية IACUC من معهد أبراج للبحوث الطبية، ويعتبر الجمع اليدوي للنمنوة إجراء غير الغازية، والتي لا تتطلب التخدير الكامل (على سبيل المثال، من خلال MS-222).
3. لطخة الجانب البطني من الأسماك مع مسح الأنسجة الحساسة كما الاتصال بالماء سوف تنشيط ميلت.
4. وضع بلطف نهاية أنبوب الشعرية في افتتاح الجهاز البولي التناسلي.
5. طرد milt عن طريق تطبيق ضغط لطيف على جانبي الأسماك مع الإبهام والسبابة. بدء البعد إلى الخياشيم، والانتقال نحو فتح الجهاز البولي التناسلي.
6. جمع milt في نهاية أنبوب الشعرية. قد يكون الشفط اللطيف ضروريًا باستخدام أنبوب الأسبرين. تجنب أي براز التي قد تكون طرد مع ميلت.
7. الاستغناء عن milt في أنبوب الطرد المركزي فارغة 1.5 مل وتخفيف مع ضعف حجم الحيوانات المنوية الموسع E400 (انظر جدولالمواد). حافظ على الثلج
   ملاحظة: Milt من الذكور متعددة قد يتم تجميع معاً إذا لم تكن هناك حاجة إلى بيانات النسب محددة. ويمكن استخدام هذه الخطوة لتمديد وقت عمل milt لعدة ساعات، ولكن ها هو غير مطلوب للإخصاب الفوري.
8. بعد جمع، إعادة بلطف الأسماك إلى خزان الانتعاش مليئة المياه النظام.
   ملاحظة: وضع الأسماك مرة أخرى في خزان مجلس الوزراء الظلام لجمع الحيوانات المنوية في المستقبل عند الضرورة.

5. الإخصاب في المختبر

1. باستخدام ماصة جديدة لكل سهم، مزيج الحيوانات المنوية عن طريق الأنابيب و / أو تحريك جانب الأنبوب قبل تخصيب الحيوانات المنوية في milt يمكن أن يستقر في الحل E400 مع مرور الوقت.
2. الاستغناء عن milt أو تمديد milt الحل في البويضة التي تم جمعها حديثا.
3. بسرعة إضافة 1 مل من مياه النظام إلى مخلب لتنشيط الحيوانات المنوية والبيض للإخصاب. تجنب خلط أو تحريك محتويات الطبق والسماح 2 دقيقة للإخصاب أن يحدث.
   ملاحظة: خلط وإثارة يقلل إلى حد كبير من معدلات الإخصاب، وبالتالي، ينبغي^تجنب14.
4. إضافة E2 الوسائط الجنين لملء طبق 2/3^rd كامل.
   ملاحظة: اعتمادا على الإجراء اللاحق، يمكن استخدام الأجنة إما على الفور (على سبيل المثال، لحقن المنشآت الوراثية كما هو موضح قبل¹⁵⁾أو يمكن احتضان الأجنة في E2 الجنين وسائل الإعلام في 23 درجة مئوية حتى تصل إلى 5 ديسيبل. عند هذه النقطة نقل الأجنة إلى نظام الإسكان الرئيسي إعادة تدوير باستخدام مياه النظام.

النتائج

ويستند البروتوكول المعروض هنا أساسا إلى بروتوكول سبق نشره⁶. ومع ذلك، منذ A. المكسيكية تفرخ خلال ساعات الليل، قمنا بتصميم رف الإسكان لتربية الأسماك التي يمكن أن تغير الفترة الضوئية مستقلة عن ساعات العمل (الشكل1). يتم تغيير دورة ضوء الأسماك ...

Discussion

في حين أن التلقيح الاصطناعي هو طريقة موحدة للعديد من الكائنات الحية النموذجية المختلفة مثل حمار وحشي، والبروتوكولات القائمة لA. mexicanus لا تأخذ في الاعتبار أن هذا النوع يفرخ بشكل طبيعي خلال ساعات الليل⁶. وبالنظر إلى أن أسماك الكهف والأسماك السطحية تختلف اختلافا جذريا في إي?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Centrifuge Tube	Eppendorf	#22364111
100 mm Petri Dishes	VWR International	#25384-302
Aspirator Tube	Drummond	#2-000-000
Calibrated 1-5 µL Capillary Tubes	Drummond	#2-000-001
Dispolable Spatulas	VWR International	#80081-188
HMA-50S  50W Aquatic Heaters	Finnex	HMA-50S
P1000 Pipette	Eppendorf	#3123000063
P1000 Pipette Tips	Thermo Scientific	#2079E
Sanyo MIR-554 incubator	Panasonic Health Care	MIR-554-PA
Sperm Extender E400			130 mM KCl, 50 mM NaCl, 2 mM CaCl2 (2H2O), 1 mM MgSO4 (7H2O), 10 mM D (+)-Glucose, 30 mM HEPES Adjust to pH 7.9 with  5M KOH and filter sterilize. Solution can be stored at 4 ?C for up to 6 months.
Sponge Animal Holder			Made from scrap foam
System Water			Deionized water supplemented with Instant Ocean Sea Salt [Blacksburg, VA] to reach a specific conductance of 800 µS/cm.  Water quality parameters are maintained within safe limits (Upper limit of total ammonia nitrogen range, 1 mg/L; upper limit of nitrite range, 0.5 mg/L; upper limit of nitrate range, 60 mg/L; temperature, 22 °C; pH, 7.65; dissolved oxygen 100 %)
Tissue Wipes	Kimberly-Clark Professional	#21905-026
ZIRC E2 Embryo Media			15 mM NaCl, 0.5 mM KCl, 1.0 mM MgSO4, 150 µM KH2PO4, 50 µM Na2HPO4, 1.0 mM CaCl2, 0.7 mM NaHCO3. Adjust pH to 7.2 to 7.4 using 2 N hydrochloric acid. Filter sterilize. Stored at room temperature for a maximum of two weeks.