아스티야낙스 멕시코의 게임테 컬렉션 및 체외 수정

요약

체외 수정은 실험실 인구를 유지하고 다운스트림 응용을 위한 동기화된 배아를 생성하기 위하여 모형 유기체의 다양한 통용되는 기술입니다. 여기에서는 멕시코 테트라 물고기인 Astyanax멕시코어의 다양한 개체군에 대해 이 기술을 구현하는 프로토콜을 제시합니다.

초록

Astyanax 멕시코는 생물 과학의 다양한 연구 분야에 대한 모델 유기체로 부상하고 있습니다. 이 텔레오스트 물고기 종의 최근 성공의 일부는 방해 동굴과 강 거주 인구를 소유하고 있다는 것입니다. 이것은 이 인구의 다른 환경에 적응하는 도중 고쳐졌다 유전성 형질의 유전 지도를 가능하게 합니다. 이 종은 실험실에서 유지되고 사육될 수 있는 동안, 낮 동안 배아를 얻고 긴장 사이 하이브리드 배아를 만드는 것은 둘 다 도전적입니다. 체외 수정(IVF)은 실험실에서 동물을 성공적으로 반복적으로 사육하기 위해 다양한 모델 유기체와 함께 사용되어 왔다. 이 프로토콜에서는 A. mexicanus를 수온 변화와 함께 다양한 광주기에 적응시킴으로써 번식 주기를 하루 중 선택한 시간으로 전환할 수 있는 방법을 보여줍니다. 그 후, 우리는 적합한 부모 물고기를 식별하는 방법을 보여줍니다, 남성과 여성에서 건강한 gametes를 수집, IVF를 사용하여 실행 가능한 자손을 생산. 이를 통해 유전 적 구조의 주입 이나 정상적인 근무 시간 동안 발생할 수있는 발달 분석과 같은 관련 절차를 가능하게합니다. 또한, 이 기술은 동굴과 표면 주거 인구 사이의 하이브리드를 만드는 데 사용할 수 있으며, 따라서 다른 환경에 대한 자형질 적응의 유전 적 기초의 연구를 가능하게한다.

서문

최근 몇 년 동안, Astyanax 멕시코는 발달 생물학, 진화 생물학, 행동 생물학 및 생리학 1,^2,3, 4와 같은 다른 분야에서 모델 유기체가되었습니다. . 이 시스템의 고유성은 매우 다른 환경에 적응 한 여러 형태형을 갖는이 종에서 온다. 표면 주거 형태는 높은 생물 다양성과 물고기에 대한 음식 소스의 많음이 강에 살고있다. 대조적으로, A.멕시코의 동굴 형태, 동굴 물고기, 생물 다양성, 음식 소스, 산소가 크게 감소 동굴에 살고¹. 동굴형은 눈의 부재와 색소침착, 인슐린 저항성, 지방 2,^3,4등의 다양한 표현형으로 표면물고기와 다르다. 그러나, 표면 물고기와 동굴 물고기는 여전히 같은 종에 속하고, 따라서, 방해입니다.

두 형태형의 경우, 조건의 세트는 실험실 조건^5,6에서일상적인 유지 보수 및 사육을 허용하도록 정의되었습니다. 그러나, 유전 수정, 적당한 배아 발달 연구 결과 및 하이브리드의 창조는 아직도 몇몇 이유를 위해 도전적입니다. A. 멕시코는 주로 유전 구조의 주입 또는 초기 배아 발달 과정의 모니터링과 같은 초기 배아 단계에 대한 후속 실험에 불편 밤 시간 동안 산란. 또한, 표면과 동굴 하이브리드의 생성은 자연 산란을 사용하여 도전, 동굴 형태는 궁극적으로 실행 가능한 난자의 생산에 영향을 미치는 변경 circadian 리듬 7을 가지고 있기 때문에. 성공적이면서도 침습적인 IVF 절차는 다른 아스티야낙스 종에 대해 설명되었으며, 여기서 게임테 생산 및산란 행동은 호르몬 주사8,^9를사용하여 프라이밍되었다. 덜 침습적 IVF 절차 (즉, 호르몬 제제의 주입없이 수동 산란에서 게임tes를 얻는 것)는 기술되었지만 A. mexicanus의 동굴과 표면 형태형 사이의 산란 주기의 차이를 고려하지 않습니다. ⁶.

제브라피시와 같은 다른 물고기 모델 유기체는 위에서 언급한 장애물이 성공적으로 해결되었기 때문에 배아 수준에서 쉽게 유전자 변형 및 연구할 수 있습니다. 표준화된 사육 기술의 구현, 체외 수정 및 정자 동결 보존은 모두 제브라피쉬를 앞으로 밀어내고 생물과학^10에서모델의 사용을 고화시켰다. 따라서 이러한 기술을 A. 멕시코로 확장하면 모델 시스템으로 더욱 강화될 것입니다.

여기에서는 A. 멕시코인을 보다 쉽게 접근할 수 있도록 하는 데 도움이 되는 IVF에 대한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 우리는 호르몬 제제의 주입없이 낮 시간 동안 가능한 난소를 얻을 수 있도록 낮에서 야간에 물고기의 광주기를 이동 할 수있는 번식 설정을 제시 할 예정이다. 그런 다음 IVF에 사용되는 난소 및 밀트를 얻는 방법에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 이 방법은 정상적인 근무 시간 동안 배아의 생산을 가능하게하고 자연 산란에서 배아를 사용하는 방법에 비해 더 다운 스트림 응용 프로그램을 더 실현 할 수 있습니다.

프로토콜

여기에 설명된 모든 방법은 의학 연구를 위한 Stowers 연구소의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.

1. 빛 주기 조작

1. 불투명하고 완전히 밀폐된(빛 보호), 여러 줄의 탱크가 포함된 유동식 양식 시스템내에 어항을 설치합니다(그림 1).
   참고: 그림 1과 같이 유동 계시스템은 시스템 물을 사용하여 각 탱크의 후면 스탠드 파이프를 통해 폐기물을 플러시하고 위생 배수구로 비워지는 기름통으로 흘러들어갑니다. 본 실험에서는 드립 방출기(drip emitter)를 통해 시간당 1 갤런(US)의 물 환율을 사용하였다.
2. 프라이밍 공정 중에 수동으로 온도를 변경하는 데 사용되는 독립적 인 발열체로 각 탱크의 온도를 유지합니다.
3. 개별 행을 각각에 별도의 사진 마침표를 사용하도록 설정합니다. 빛이 들어오거나 빠져나가는 것을 방지하기 위해 닫을 수 있는 각 행에 문을 설치합니다.
   참고 : 자동화 된 컨트롤러는 물고기에 대한 최소한의 방해와 모든 포토 마침표를 조작 할 수 있습니다.
4. 어두운 시간에 액세스 할 수있는 빨간색 작업 등 및 암막 커튼랙을 장착.

2. gamete 컬렉션을위한 포토 기간 및 프라이밍 물고기 조정

1. 원하는 물고기(그림2a)를 일반 시스템 랙에서 제거하고 사육 랙에 배치하여 프라이밍 14일 전에 포토기간을 조정할 수 있도록 합니다.
   참고 : 이것은 물고기가 새로운 환경에 적응 할 수 있습니다.
2. 이 기간 동안 설치된 수중 난방 시스템을 사용하여 22.8 °C (73 °F)에서 물고기를 유지하십시오. 일반적인 포토기간은 오전 6시부터 오후 8시까지, 오후 8시부터 오전 6시까지 입니다. 라이트 사이클 랙의 경우 랙 내의 빛에 전원을 공급하는 타이머를 조정하여 광주기를 오후 10시에서 오후 12시, 오후 12시에서 오후 10시로 어둡게 이동합니다.
   참고: 남성과 암컷은 같은 탱크에 보관되어 있어 자연스러운 프라이밍 동작이 일어날 수 있습니다. 산란은 수조에서 일어날 수 있지만, 게임테스가^11단계로출시되기 때문에 물고기는 여전히 체외 수정에 사용될 수 있다.
3. 물고기가 순응되면, 단계 2.3.1 에서 2.3.5에 설명된 대로 5를 산란하기 위해 동물을 프라이밍하기 시작합니다.
   참고: 이 절차는 총 6일이 소요됩니다. 이 시간 동안, 설치된 수생 난방 시스템을 사용하여 난바 생산을 프라이밍하기 위해 온도를 변경합니다. 50W 수생 히터 (재료 표참조)를 사용하여 각 단계에서 프로토콜에 주어진 온도 (히터의 스케일은 화씨에 있음)로 직접 히터를 설정합니다. 탱크의 크기와 물의 유량속도에 따라 온도 조절 시간이 다를 수 있습니다. 본 실험에서, 온도는 정오에 조정되었고, 온도 평형은 다음 18시간 동안 을 인수하였다.
   1. 1일째에 온도를 22.8°C(73°F)에서 24.4°C(76°F)로 올린다.
   2. 2일째에 온도를 24.4°C(76°F)에서 26.1°C(79°F)로 올린다.
   3. 3일째와 4일째에는 온도를 26.1°C(79°F)로 유지합니다. 물고기는 낮에 산란 할 준비가되어 있으며 IVF를 수행 할 수 있습니다.
      참고: 개별 물고기에 따라 암컷은 3일째 및/또는 4일째에 생성할 수 있습니다. 우리는 ova 수집의 성공에 따라 3 일 및 / 또는 4 일에 난노바를 얻는 것이 좋습니다.
   4. 5일째에 온도를 26.1°C(79°F)에서 24.4°C(76°F)로 낮춥니다.
   5. 6일째에 온도를 24.4°C(76°F)에서 22.8°C(73°F)로 낮춥니다.
      참고: 이 온도 주기를 반복하기 전에 7일 간격을 제공합니다. 이 이동 빛 주기에 적응 하는 물고기에 필요한 전반적인 시간을 줄일 수 있기 때문에이 포토 기간에 물고기를 유지 하는 것이 좋습니다.

3. 여성 게임 컬렉션

1. 습윤 된 조직을 페트리 접시 뚜껑에 닦아 내고 접시를 닫아 가습 챔버를 만들고 수집 과정에서 ova가 건조되는 것을 방지하십시오.
2. 다음으로 컬렉션을 위해 여성을 선택합니다. 큰, 돌출 복부를 가진 gravid 물고기는 아마이 절차에 대한최선의 선택이 될 것입니다 (그림 2a).
   참고 : 성인 A.멕시코의 남성과 여성을 구별하기 위해 면봉 방법을^12개사용하였다.
3. 차가운 물을 사용하여 여성을 고정하고 축축한 스폰지 동물 홀더에 supine 위치에 그녀를 배치합니다. 적어도 30 s에 대 한 4 °C 시스템 물에 물고기를 배치 하 여 또는 물고기가 고정 될 때까지 (즉, 아가미 운동의 손실, 참조 로스와 로스¹³ 자세한 내용은).
   참고 : 신속하게 작동하고 절차가 완료 될 때까지 물고기를 따뜻하게하지 않도록하십시오. 이 주기적으로 차가운 물에 손가락의 장갑 끝을 찍어 또는 보충 마 취를 제공 포함 될 수 있습니다. 다른 마취 방법(예를 들어, MS-222^13)도사용될 수 있다. 의학 연구를 위한 Stowers 연구소의 IACUC 지침에 따라, 난자의 수동 수집은 완전한 마취를 요구하지 않는 비침범성 절차로 간주됩니다 (예를 들면, MS-222를 통해).
4. 일단 위치, 물과 접촉으로 섬세한 조직 닦아 물고기의 복부 측면을 얼룩으로 활성화 하는 ova 발생 합니다.
5. 엄지와 검지 사이에 암컷을 잡습니다. 손가락을 약간 굴리면서 비뇨 생식기 개구부 방향으로 coelomic 구멍의 측면쪽으로 부드럽게 짜냅니다. 일회용 주걱을 사용하여 발현된 난을 수집한다.
6. 이 오바를 가습된 페트리 접시로 옮김.
   참고: 특정 모계 데이터가 필요하지 않은 경우 동일한 접시에 여러 개의 오바 클러치를 결합할 수 있습니다. 난소는 24°C에서 보관될 수 있으며 수집 후 30-60분 이내에 IVF에 사용될 때 가장 좋습니다.
7. 수집 후, 부드럽게 시스템 물로 채워진 복구 탱크에 물고기를 반환합니다.
   참고: 필요할 때 물고기를 어두운 캐비닛 탱크에 다시 놓아 미래의 난자 수집을 위해 놓습니다.

4. 남성 게임 컬렉션

1. 컬렉션에 대 한 남성을 선택 합니다.
   참고: 남성 게임 품질의 겉으로 보이는 징후는 없습니다. 그러나이 절차에서 사용하기 전에 생선이 외모에서 건강하게 나타나야합니다. 성인 A.멕시코인의 남성과 여성을 구별하기 위해 면봉 방법을^12개사용하였다.
2. 차가운 물을 사용하여 남성을 고정시키고 축축한 스폰지 동물 홀더에 그를 supine 위치에 놓습니다. 적어도 30 초 동안 또는 물고기가 움직이지 때까지 4 °C 시스템 물에 물고기를 배치하여 고정 (즉, 아가미 운동의 손실, 자세한 내용은 로스 와 로스^13를 참조하십시오).
   참고 : 신속하게 작동하고 절차가 완료 될 때까지 물고기를 따뜻하게하지 않도록하십시오. 이 주기적으로 차가운 물에 손가락의 장갑 끝을 찍어 또는 보충 마 취를 제공 포함 될 수 있습니다. 다른 마취 방법(예를 들어, MS-222^13)도여기에서 사용될 수 있다. 의학 연구를 위한 Stowers 연구소의 IACUC 지침에 따라, 정자의 수동 수집은 완전한 마취를 요구하지 않는 비침범성 절차로 간주됩니다 (예를 들면, MS-222를 통해).
3. 물과 접촉하면 밀트가 활성화될 때 섬세한 티슈 와이프로 물고기의 복부 쪽을 얼룩지다.
4. 비뇨 생식기 개구부에서 모세관의 끝을 부드럽게 놓습니다.
5. 엄지와 집게 손가락으로 물고기의 측면에 부드러운 압력을 가하여 밀을 추방하십시오. 가미에 말단을 시작, 비뇨 생식기 개구부쪽으로 이동.
6. 모세관 끝에 밀을 수집합니다. 흡입기 튜브를 사용하여 부드러운 흡입이 필요할 수 있습니다. 밀트로 추방 될 수있는 대변을 피하십시오.
7. 빈 1.5 mL 원심 분리 튜브에 밀을 분배하고 정자 익스텐더 E400의 두 배 볼륨으로 희석 (재료 표참조). 얼음에 보관하십시오.
   참고: 특정 부모 데이터가 필요하지 않은 경우 여러 남성의 Milt가 함께 풀러질 수 있습니다. 이 단계는 몇 시간 동안 밀트의 작업 시간을 연장하는 데 사용할 수 있지만, 즉각적인 풍부하게 함이 필요하지 않습니다.
8. 수집 후, 부드럽게 시스템 물로 채워진 복구 탱크에 물고기를 반환합니다.
   참고 : 필요할 때 미래의 정자 수집을 위해 물고기를 어두운 캐비닛 탱크에 다시 놓습니다.

5. 체외 수정

1. 각 주식에 대 한 새로운 파이펫을 사용 하 여, 파이펫 팅 및/또는 밀트에 정자로 수정 하기 전에 튜브의 측면을 교반 하 여 정자를 혼합 시간이 지남에 따라 E400 솔루션에 정착 할 수 있습니다.
2. 밀트 또는 확장 된 밀트 용액을 갓 수집 한 난소에 분배하십시오.
3. 수정을 위해 정자와 계란을 활성화하기 위해 클러치에 1 mL의 시스템 물을 신속하게 추가하십시오. 접시 내용물의 혼합이나 교반을 피하고 수정이 발생할 때까지 2 분 정도 허용하십시오.
   참고 : 혼합과 교반크게 수정 속도를 감소시키고, 따라서,^14을피해야한다 .
4. E2 배아 미디어를 추가하여 접시를 2/3rd 가득 채웁니다.
   참고: 후속 절차에 따라, 배아는 즉시 사용될 수 있다(예를 들어,¹⁵전에 설명된 바와 같이 유전 적 구성물의 주입을 위해) 또는 배아는 5 dpf에 도달할 때까지 23 °C에서 E2 배아 매체에서 배양될 수 있다. 이 시점에서 배아를 시스템 물을 사용하여 주요 재순환 하우징 시스템으로 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 전달한다.

결과

여기에 제시된 프로토콜은 주로 이전에게시된 프로토콜 6을 기반으로 합니다. 그러나 A. 멕시코산란이 야간에 생성되기 때문에, 우리는 노동 시간에 관계없이 포토 기간을 변경할수있는 물고기 사육을위한 하우징 랙을 설계했습니다 (그림 1). 물고기 빛 주기는 3 개의 행의 탱크를 포함하는 완전히 밀폐 된

토론

IVF는 제브라피시와 같은 많은 다른 모형 유기체를 위한 표준화한 방법 인 동안, A. mexicanus에 대한기존 프로토콜은 이 종은 밤 시간 6 도중 자연적으로 산란한다는 것을 고려하지 않습니다. 원시어와 표면 물고기는 circadian 리듬에서 매우 크게 다르다는 것을 감안할 때, 난자의 성숙 주기는 동굴과 표면 형태형 사이에도 다릅니다. 표면 A. 멕시코에 대한 발판 온도와 시...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Centrifuge Tube	Eppendorf	#22364111
100 mm Petri Dishes	VWR International	#25384-302
Aspirator Tube	Drummond	#2-000-000
Calibrated 1-5 µL Capillary Tubes	Drummond	#2-000-001
Dispolable Spatulas	VWR International	#80081-188
HMA-50S  50W Aquatic Heaters	Finnex	HMA-50S
P1000 Pipette	Eppendorf	#3123000063
P1000 Pipette Tips	Thermo Scientific	#2079E
Sanyo MIR-554 incubator	Panasonic Health Care	MIR-554-PA
Sperm Extender E400			130 mM KCl, 50 mM NaCl, 2 mM CaCl2 (2H2O), 1 mM MgSO4 (7H2O), 10 mM D (+)-Glucose, 30 mM HEPES Adjust to pH 7.9 with  5M KOH and filter sterilize. Solution can be stored at 4 ?C for up to 6 months.
Sponge Animal Holder			Made from scrap foam
System Water			Deionized water supplemented with Instant Ocean Sea Salt [Blacksburg, VA] to reach a specific conductance of 800 µS/cm.  Water quality parameters are maintained within safe limits (Upper limit of total ammonia nitrogen range, 1 mg/L; upper limit of nitrite range, 0.5 mg/L; upper limit of nitrate range, 60 mg/L; temperature, 22 °C; pH, 7.65; dissolved oxygen 100 %)
Tissue Wipes	Kimberly-Clark Professional	#21905-026
ZIRC E2 Embryo Media			15 mM NaCl, 0.5 mM KCl, 1.0 mM MgSO4, 150 µM KH2PO4, 50 µM Na2HPO4, 1.0 mM CaCl2, 0.7 mM NaHCO3. Adjust pH to 7.2 to 7.4 using 2 N hydrochloric acid. Filter sterilize. Stored at room temperature for a maximum of two weeks.