Collection de gamètes et fertilisation in vitro d'Astyanax mexicanus

Résumé

La fécondation in vitro est une technique couramment utilisée avec une variété d'organismes modèles pour maintenir les populations de laboratoire et produire des embryons synchronisés pour des applications en aval. Ici, nous présentons un protocole qui met en œuvre cette technique pour différentes populations du poisson tétra mexicain, Astyanax mexicanus.

Résumé

Astyanax mexicanus est en train d'émerger comme un organisme modèle pour une variété de domaines de recherche en sciences biologiques. Une partie du succès récent de cette espèce de poisson téléostéen est qu'elle possède des populations interfertiles de caverne et de rivière. Cela permet la cartographie génétique des caractères héritables qui ont été fixés lors de l'adaptation aux différents environnements de ces populations. Bien que cette espèce puisse être maintenue et élevée en laboratoire, il est difficile à la fois d'obtenir des embryons pendant la journée et de créer des embryons hybrides entre les souches. La fécondation in vitro (FIV) a été utilisée avec une variété d'organismes modèles différents pour élever avec succès et à plusieurs reprises des animaux en laboratoire. Dans ce protocole, nous montrons comment, en acclimatant A. mexicanus à différents cycles de lumière couplés avec des changements de température de l'eau, nous pouvons déplacer les cycles de reproduction à un moment choisi de la journée. Par la suite, nous montrons comment identifier les poissons parentaux appropriés, recueillir des gamètes sains chez les mâles et les femelles, et produire une progéniture viable à l'aide de la FIV. Cela permet aux procédures connexes telles que l'injection de constructions génétiques ou l'analyse du développement de se produire pendant les heures normales de travail. En outre, cette technique peut être utilisée pour créer des hybrides entre les populations de grottes et de surface, et ainsi permettre l'étude de la base génétique des adaptations phénotypiques à différents environnements.

Introduction

Ces dernières années, Astyanax mexicanus est devenu un organisme modèle dans différents domaines tels que la biologie du développement, la biologie évolutive, la biologie comportementale, et la physiologie^1,2,3^,4 . L'unicité de ce système vient de cette espèce ayant plusieurs morphotypes qui se sont adaptés à des environnements très différents. Le morphotype d'habitation de surface vit dans les rivières où il y a une grande biodiversité et beaucoup de sources de nourriture pour les poissons. En revanche, les morphotypes des grottes de A. mexicanus, le poisson des cavernes, vivent dans des grottes où la biodiversité, les sources alimentaires et l'oxygène sont considérablement diminués¹. Le poisson des cavernes diffère des poissons de surface dans une variété de phénotypes tels que l'absence d'yeux et de pigmentation, la résistance à l'insuline, et la capacité de stocker la graisse^2,3,4. Cependant, les poissons de surface et les poissons des cavernes appartiennent toujours à la même espèce et sont donc interfertiles.

Pour les deux morphotypes, un ensemble de conditions a été défini pour permettre l'entretien et la reproduction de routine dans des conditions de laboratoire^5,6. Cependant, les modifications génétiques, les études de développement embryonnaires appropriées et la création d'hybrides sont encore difficiles pour plusieurs raisons. A. mexicanus fraye principalement pendant les heures de nuit, ce qui est gênant pour les expériences ultérieures sur les premiers stades embryonnaires tels que l'injection de constructions génétiques ou la surveillance des premiers processus de développement embryonnaire. En outre, la génération d'hybrides de surface et de cavernes est difficile en utilisant le frai naturel, puisque les morphotypes de caverne ont un rythme circadien altéré⁷ qui affecte finalement la production des ovules viables. Des procédures de FIV réussies, mais invasives, ont été décrites pour d'autres espèces d'Astyanax, où la production de gamètes et le comportement de frai ont été amorcés à l'aide d'injections hormonales^8,9. Des procédures de FIV moins invasives (c.-à-d. l'obtention de gamètes à partir de frai manuel sans l'injection de préparations hormonales) ont été décrites, mais ne tiennent pas compte des différences dans le cycle de frai entre les morphotypes de grotte et de surface de A. mexicanus ⁶.

D'autres organismes modèles de poissons, comme le poisson zèbre, peuvent facilement être génétiquement modifiés et étudiés à un niveau embryonnaire parce que les obstacles mentionnés ci-dessus ont été résolus avec succès. La mise en œuvre de techniques de reproduction normalisées, la fécondation in vitro et la cryoconservation des spermatozoïdes ont tous poussé le poisson zèbre vers l'avant et solidifié l'utilisation du modèle dans les sciences biologiques¹⁰. Par conséquent, l'extension de ces techniques à A. mexicanus le renforcera davantage en tant que système modèle.

Ici, nous présentons un protocole détaillé pour la FIV qui aidera à rendre A. mexicanus plus accessible. Nous présenterons une configuration de reproduction qui permet de déplacer les cycles de lumière du poisson de jour en nuit afin que les ovules viables puissent être obtenus pendant les heures de jour sans injection de préparations hormonales. Nous fournissons ensuite une description détaillée de la façon d'obtenir les ovules et les milt utilisés pour la FIV. Cette méthode permettra la production d'embryons pendant les heures normales de travail et rendra d'autres applications en aval plus réalisables que l'utilisation d'embryons issus de frai naturel.

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) du Stowers Institute for Medical Research.

1. Manipulation de cycle léger

1. Installez des réservoirs de poissons dans un système aquacole opaque et entièrement clos (protection de la lumière), qui contient plusieurs rangées de réservoirs (figure 1).
   REMARQUE : Le système d'écoulement, tel qu'il est indiqué à la figure 1, utilise l'eau du système pour rincer les déchets à travers le tuyau de support arrière de chaque réservoir et se jette dans un puisard qui se vide dans un drain sanitaire. Dans cette expérience, un taux de change de l'eau d'un gallon (US) par heure par un émetteur au goutte-à-goutte a été utilisé.
2. Maintenir la température de chaque réservoir avec un élément de chauffage indépendant qui est utilisé pour modifier manuellement la température pendant le processus d'amorçage.
3. Configurez des lignes individuelles de manière à activer des photopériodes séparées dans chacune d'elles. Installez des portes sur chaque rangée qui peuvent être fermées pour empêcher la lumière d'entrer ou de s'échapper.
   REMARQUE : Le contrôleur automatisé peut permettre la manipulation de toutes les photopériodes avec le moins de perturbation pour le poisson.
4. Équipez le support d'un feu de travail rouge et de rideaux occultants pour l'accès pendant les heures sombres.

2. Ajustement de la photopériode et de l'amorçage du poisson pour la collecte des gamètes

1. Retirez le poisson désiré (Figure 2a) des grilles du système général et placez-le dans les grilles de reproduction pour permettre l'ajustement de la photopériode 14 jours avant l'amorçage.
   REMARQUE : Cela permet aux poissons de s'acclimater à un nouvel environnement.
2. Maintenez le poisson à 22,8 oC (73 oF) pendant cette période à l'aide du système de chauffage aquatique installé. La photopériode normale est de 6 h à 20 h et de 20 h à 6 h. Pour le support de cycle de lumière, déplacez la photopériode de 22 h à 12 h et de 12 h à 22 h en ajustant la minuterie qui alimente la lumière à l'intérieur du support.
   REMARQUE : Les mâles et les femelles sont logés dans le même réservoir pour permettre des comportements d'amorçage naturels. Bien que le frai puisse avoir lieu dans le réservoir, les poissons peuvent encore être utilisés pour la fécondation in vitro puisque les gamètes sont libérés aux étapes¹¹.
3. Une fois que les poissons sont acclimatés, commencez à amorcer les animaux pour frayer⁵ comme décrit dans les étapes 2.3.1 à 2.3.5.
   REMARQUE : Cette procédure prend six jours au total. Au cours de cette période, modifiez la température pour amorcer la production d'ovules à l'aide d'un système de chauffage aquatique installé. À l'aide des chauffe-eau aquatiques 50W (voir Tableau des matériaux),le chauffe-eau a réglé directement la température (l'échelle sur le chauffe-eau est en Fahrenheit) donnée dans le protocole à chaque étape. Selon la taille du réservoir et le débit de l'eau, le temps d'ajustement de la température peut différer. Dans cette expérience, la température a été ajustée à midi et l'équilibre de température a pris plus de 18 h.
   1. Le jour 1, faites passer la température de 22,8 oC à 24,4 oC (76 oF).
   2. Le jour 2, faites passer la température de 24,4 oC à 26,1 oC (79 oF).
   3. Les jours 3 et 4, maintenir la température à 26,1 oC (79 oF). Les poissons seront prêts à frayer pendant la journée et la FIV peut être effectuée.
      REMARQUE : Selon les poissons individuels, les femelles peuvent frayer le jour 3 et/ou le jour 4. Nous vous recommandons d'essayer d'obtenir des ovules le jour 3 et/ou le jour 4 en fonction du succès de la collection d'ovules.
   4. Le jour 5, abaisser la température de 26,1 oC (79 oF) à 24,4 oC (76 oF).
   5. Le jour 6, abaisser la température de 24,4 oC (76 oF) à 22,8 oC (73 oF).
      REMARQUE : Prévoir un écart de 7 jours avant de répéter ce cycle de température. Il est recommandé de continuer à garder le poisson dans cette photopériode, car cela réduira le temps global nécessaire par les poissons pour s'adapter à ce cycle de lumière décalé.

3. Collection de gamètes féminins

1. Commencez par insérer une lingette de tissu humidifiée dans un couvercle de vaisselle Petri et fermer le plat pour créer une chambre humidifiée et empêcher les ovules de se dessécher pendant le processus de collecte.
2. Choisissez ensuite une femelle pour la collection. Les poissons gravidés avec de grands abdomens saillants seront probablement le meilleur choix pour cette procédure (Figure 2a).
   REMARQUE: Pour différencier entre les mâles et les femelles de l'adulte A. mexicanus, la méthode de la boule de coton a été utilisé¹².
3. Immobiliser une femelle à l'aide d'eau froide et la placer en position de supine dans un porte-éponge humidifié. Pour ce faire, placez les poissons dans de l'eau du système de 4 oC pendant au moins 30 s ou jusqu'à ce que le poisson soit immobilisé (c.-à-d. perte de mouvement branchial, voir Ross et Ross¹³ pour plus de détails).
   REMARQUE : Travaillez rapidement et essayez d'éviter de réchauffer le poisson jusqu'à ce que la procédure soit terminée. Cela peut inclure tremper périodiquement les bouts gantés des doigts dans l'eau froide ou offrir une anesthésie supplémentaire. D'autres méthodes d'anesthésie (p. ex., MS-222¹³) peuvent également être utilisées. En vertu des lignes directrices de l'IACUC de l'Institut Stowers de recherche médicale, la collecte manuelle des ovules est considérée comme une procédure non invasive, qui ne nécessite pas d'anesthésie complète (p. ex., par mS-222).
4. Une fois positionné, effacer le côté ventral du poisson avec une lingette délicate de tissu pendant que le contact avec l'eau causera les ovules pour activer.
5. Tenez la femelle entre le pouce et l'index. Presser doucement contre les côtés latéraux de la cavité coelomic dans la direction de l'ouverture urogénitale tout en roulant légèrement les doigts. Recueillir les ovules exprimés à l'aide d'une spatule jetable.
6. Transférer ces ovules dans le plat Petri humidifié.
   REMARQUE : Plusieurs embrayages d'ovules peuvent être combinés dans le même plat si des données de filiation spécifiques ne sont pas nécessaires. Les ovules peuvent être stockés à 24 oC et sont les meilleurs lorsqu'ils sont utilisés pour la FIV dans les 30-60 minutes après la collecte.
7. Après la collecte, retourner délicatement les poissons dans un réservoir de récupération rempli d'eau du système.
   REMARQUE : Placez le poisson de nouveau dans le réservoir foncé d'armoire pour la collection future d'ovules si nécessaire.

4. Collection de gamètes masculins

1. Choisissez un mâle pour la collection.
   REMARQUE : Il n'y a aucun signe visible extérieurement de la qualité masculine de gamète. Cependant, les poissons doivent apparaître en bonne santé en apparence avant utilisation dans cette procédure. Pour différencier les mâles et les femelles de l'adulte A. mexicanus, la méthode de la boule de coton a été utilisée¹².
2. Immobiliser un mâle à l'aide d'eau froide et le placer en position de supine dans un porte-éponge humidifié. Immobiliser en plaçant le poisson dans l'eau du système de 4 oC pendant au moins 30 secondes ou jusqu'à ce que le poisson soit immobilisé (c.-à-d., perte de mouvement branchial, voir Ross et Ross¹³ pour plus de détails).
   REMARQUE : Travaillez rapidement et essayez d'éviter de réchauffer le poisson jusqu'à ce que la procédure soit terminée. Cela peut inclure tremper périodiquement les bouts gantés des doigts dans l'eau froide ou offrir une anesthésie supplémentaire. D'autres méthodes d'anesthésie (p. ex., MS-222¹³) peuvent également être utilisées ici. En vertu des lignes directrices de l'IACUC de l'Institut Stowers de recherche médicale, la collecte manuelle de spermatozoïdes est considérée comme une procédure non invasive, qui ne nécessite pas d'anesthésie complète (p. ex., par mS-222).
3. Blot le côté ventral du poisson avec une lingette délicate de tissu pendant que le contact avec l'eau activera le milt.
4. Placez délicatement l'extrémité d'un tube capillaire à l'ouverture urogénitale.
5. Expulser milt en appliquant une pression douce sur les côtés du poisson avec le pouce et l'index. Commencez distal aux branchies, se déplaçant vers l'ouverture urogénitale.
6. Recueillir le milt à l'extrémité d'un tube capillaire. Une aspiration douce peut être nécessaire à l'aide d'un tube aspirateur. Évitez les excréments qui peuvent être expulsés avec le milt.
7. Distribuer le milt dans un tube vide de centrifugeuse de 1,5 mL et diluer avec deux fois le volume de Sperm Extender E400 (voir Tableau des matériaux). Restez sur la glace.
   REMARQUE : Le Milt de plusieurs mâles peut être mis en commun si des données de filiation spécifiques ne sont pas nécessaires. Cette étape peut être utilisée pour prolonger le temps de travail du milt pendant plusieurs heures, mais elle n'est pas nécessaire pour une fécondation immédiate.
8. Après la collecte, retourner délicatement les poissons dans un réservoir de récupération rempli d'eau du système.
   REMARQUE : Placez le poisson dans un réservoir sombre pour la collecte future des spermatozoïdes si nécessaire.

5. Fécondation in vitro

1. À l'aide d'une nouvelle pipette pour chaque bouillon, mélanger le sperme par pipetting et/ou agiter le côté du tube avant de fertiliser comme sperme dans le milt peut s'installer dans la solution E400 au fil du temps.
2. Distribuer la solution de milt ou de milt étendu dans les ovules fraîchement récoltés.
3. Ajouter rapidement 1 ml d'eau du système à l'embrayage pour activer le sperme et les ovules pour la fécondation. Évitez de mélanger ou d'agiter le contenu du plat et laissez 2 min pour la fécondation de se produire.
   REMARQUE : Le mélange et l'agitation réduisent considérablement les taux de fécondation et devraient donc être évités¹⁴.
4. Ajouter E2 Embryo Media pour remplir le plat 2/3^rd plein.
   REMARQUE : Selon la procédure subséquente, les embryons peuvent être utilisés immédiatement (p. ex., pour l'injection de constructions génétiques telles que décrites avant¹⁵ans) ou les embryons peuvent être incubés dans E2 Embryo Media à 23 oC jusqu'à ce qu'ils atteignent 5 dpf. À ce stade, transférer les embryons au système de logement principal de recirculation à l'aide de l'eau du système.

Résultats

Le protocole présenté ici est principalement basé sur un protocole précédemment publié⁶. Cependant, puisque A. mexicanus fraye pendant les heures de nuit, nous avons conçu un support de logement pour l'élevage des poissons qui peut changer la photopériode indépendamment des heures de travail (figure 1). Le cycle de lumière des poissons est modifié dans un système aquacole entièrement fermé et fluide contenant tr...

Discussion

Bien que la FIV soit une méthode normalisée pour de nombreux organismes modèles différents tels que le poisson zèbre, les protocoles existants pour A. mexicanus ne tiennent pas compte du fait que cette espèce fraye naturellement pendant les heures de nuit⁶. Étant donné que les poissons des cavernes et les poissons de surface diffèrent considérablement dans leurs rythmes circadiens, le cycle de maturation des ovules diffère également entre les morphotypes de la grotte et ceux d...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Centrifuge Tube	Eppendorf	#22364111
100 mm Petri Dishes	VWR International	#25384-302
Aspirator Tube	Drummond	#2-000-000
Calibrated 1-5 µL Capillary Tubes	Drummond	#2-000-001
Dispolable Spatulas	VWR International	#80081-188
HMA-50S  50W Aquatic Heaters	Finnex	HMA-50S
P1000 Pipette	Eppendorf	#3123000063
P1000 Pipette Tips	Thermo Scientific	#2079E
Sanyo MIR-554 incubator	Panasonic Health Care	MIR-554-PA
Sperm Extender E400			130 mM KCl, 50 mM NaCl, 2 mM CaCl2 (2H2O), 1 mM MgSO4 (7H2O), 10 mM D (+)-Glucose, 30 mM HEPES Adjust to pH 7.9 with  5M KOH and filter sterilize. Solution can be stored at 4 ?C for up to 6 months.
Sponge Animal Holder			Made from scrap foam
System Water			Deionized water supplemented with Instant Ocean Sea Salt [Blacksburg, VA] to reach a specific conductance of 800 µS/cm.  Water quality parameters are maintained within safe limits (Upper limit of total ammonia nitrogen range, 1 mg/L; upper limit of nitrite range, 0.5 mg/L; upper limit of nitrate range, 60 mg/L; temperature, 22 °C; pH, 7.65; dissolved oxygen 100 %)
Tissue Wipes	Kimberly-Clark Professional	#21905-026
ZIRC E2 Embryo Media			15 mM NaCl, 0.5 mM KCl, 1.0 mM MgSO4, 150 µM KH2PO4, 50 µM Na2HPO4, 1.0 mM CaCl2, 0.7 mM NaHCO3. Adjust pH to 7.2 to 7.4 using 2 N hydrochloric acid. Filter sterilize. Stored at room temperature for a maximum of two weeks.