アスティアナックスメキシコのガメテコレクションと体外受精

要約

体外受精は、ラボ集団を維持し、下流アプリケーション用に同期胚を生成するために、様々なモデル生物と一般的に使用される技術です。ここでは、メキシコのテトラ魚、アスティアナックスメキシコの異なる集団のためにこの技術を実装するプロトコルを提示します。

要約

アスティアナックス・メキシカヌスは、生物科学の様々な研究分野のモデル生物として出現しています。このテレオスト魚種の最近の成功の一部は、それが相互不妊洞窟と川に住む人口を所有していることである。これは、これらの集団の異なる環境への適応中に固定された遺伝的形質の遺伝的マッピングを可能にする。この種はラボで維持され、飼育することができますが、昼間に胚を得て、株間にハイブリッド胚を作ることは困難です。体外受精(IVF)は、実験室で動物を正常かつ繰り返し繁殖させるために、様々な異なるモデル生物と共に使用されてきた。このプロトコルでは、水温の変化と相まって異なる光サイクルにA.メキシコを順応させることによって、繁殖サイクルを1日の選択した時間にシフトする方法を示す。その後、適切な親魚を同定し、オスとメスから健康なゲームを採取し、IVFを用いて生存可能な子孫を生み出す方法を示す。これにより、遺伝子構成体の注入や発達解析などの関連する手順が通常の勤務時間中に発生します。さらに、この技術は、洞窟と表面に住む集団との間にハイブリッドを作成し、それによって異なる環境へのプチピック適応の遺伝的基礎の研究を可能にするために使用することができる。

概要

近年、アスティアナックス・メキシカヌスは、発生生物学、進化生物学、行動生物学、生理学1、2、3、4などの異なる分野のモデル生物となっています。.このシステムのユニークさは、非常に異なる環境に適応しているいくつかの形態を有するこの種から来ています。表面の住居モルフォタイプは、生物多様性が高く、魚の食料源が豊富な川に住んでいます。対照的に、A.メキシコの洞窟形態、洞窟魚は、生物多様性、食料源、および酸素が大幅に減少する洞窟に住んでいます1.洞窟魚は、目や色素沈着の不在、インスリン抵抗性、および脂肪2、3、4を保存する能力などの様々な表現型の表面魚とは異なります。しかし、表面の魚や洞窟魚はまだ同じ種に属し、したがって、相互不妊です。

両方の形態タイプについて、実験室条件5、6の下で定期的なメンテナンスおよび繁殖を可能にする一連^の条件が定義されている。しかし、遺伝子改変、適切な胚発生研究、ハイブリッドの作成は、いくつかの理由から依然として困難です。A. メキシコ人は、主に夜間に産卵し、遺伝的構造の注入や初期胚発生過程のモニタリングなど、初期胚の初期段階でのその後の実験には不便である。さらに、表面と洞窟のハイブリッドの生成は、洞窟の形態が最終的に生存可能な卵の生産に影響を与える変更された概日^リズム7を持っているので、自然な産卵を使用して困難です。成功した、まだ侵襲的な、IVF手順は、他のアスティアナックス種のために記載されており、そこでは、ゲームの産生および産卵行動がホルモン注射8、9を用いてプライミングされた。侵襲性の低いIVF手順(すなわち、ホルモン製剤の注入なしに手動産卵からゲームを得る)が記載されているが、A.メキシコの洞窟と表面形態の間の産卵サイクルの違いを考慮していない。 ⁶.

ゼブラフィッシュのような他の魚モデル生物は、上記の障害が正常に解決されたので、遺伝的に遺伝子改変し、胚レベルで研究することができます。標準化された繁殖技術の実装、体外受精、および精子凍結保存は、すべてゼブラフィッシュを前方に押し出し、生物科学におけるモデルの使用を固^めた10。したがって、これらの技術をA.メキシコに拡張することは、モデルシステムとしてさらに強化される。

ここでは、A.メキシコ人をよりアクセスしやすくするのに役立つ IVF の詳細なプロトコルを紹介します。ホルモン製剤を注入することなく日中に生存可能な卵巣を得られるように、魚の光サイクルを昼間から夜間にシフトできる繁殖セットアップを紹介します。その後、IVFに使用される卵巣とミルトを取得する方法の詳細な説明を提供します。この方法は、通常の労働時間中に胚の生産を可能にし、自然産卵からの胚を使用するよりも、さらに下流のアプリケーションをより実現可能にします。

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プロトコル

ここに記載されているすべての方法は、スタワーズ医学研究所の機関動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されています。

1. 光サイクル操作

1. 不透明で完全に囲まれた(光保護)、複数のタンク列を含むフロースルー養殖システム内に魚のタンクを設定します(図1)。
   注:図1に示すように、フロースルーシステムは、システム水を使用して各タンクのバックスタンドパイプを通して廃棄物を洗い流し、衛生排水管に注がれるサンプに流れ込みます。この実験では、点滴エミッタを介して1時間あたり1ガロン(US)の水交換レートを使用した。
2. プライミングプロセス中に手動で温度を変更するために使用される独立した加熱要素を持つ各タンクの温度を維持します。
3. 個々の行を設定して、それぞれに個別のフォトピリオドを有効にします。光が入ったり逃げたりするのを防ぐために、閉じることができる各行にドアを取り付けます。
   注:自動コントローラは、魚への最も少ない妨害ですべての光周期の操作を可能にすることができます。
4. 暗い時間帯にアクセスするための赤い作業灯と停電カーテンをラックに装備します。

2. フォトピリオドの調整とゲームコレクション用の魚のプライミング

1. 一般的なシステムラックから所望の魚(図2a)を取り出し、プライミングの14日前に光周期の調整を可能にするために、繁殖ラックに置きます。
   注:これは魚が新しい環境に順応することを可能にします。
2. この期間中は、水生加熱システムを使用して22.8 °C(73 °F)で魚を保管してください。通常の光周期は、午前6時から午後8時まで、午後8時から午前6時までです。ライト サイクル ラックの場合は、ラック内のライトに電力を与えるタイマーを調整して、光周期を午後 10 時から午後 12 時、午後 12 時から午後 10 時にシフトします。
   注:男性と女性は、自然なプライミング動作が行われることを可能にするために、同じタンクに収容されています。産卵はタンク内で行われるかもしれませんが、ゲームテスは^{ステージ11}で放出されるので、魚は体外受精に使用することができます。
3. 魚が順応したら、ステップ2.3.1から2.3.5に記載されているように、5を産卵するための動物のプライミングを開始します。
   注: この手順には合計で 6 日間かかります。この時間をかけて、インストールされた水生加熱システムを使用してova生産をプライムに温度を変更します。50W水生ヒーター(材料の表を参照)を使用して、各ステップでプロトコルで与えられた温度(ヒーターのスケールは華氏)に直接ヒーターを設定します。タンクの大きさや水の流量に応じて、温度調整の時間が異なる場合があります。この実験では、正午に温度を調整し、温度平衡は次の18時間を引き継いだ。
   1. 1日目に、温度を22.8 °C(73 °F)から24.4 °C(76°F)に上げます。
   2. 2日目に、温度を24.4 °C(76 °F)から26.1 °C(79°F)に上げます。
   3. 3日目と4日目は、26.1 °C(79°F)の温度を保ちます。魚は日中に産卵する準備ができて、IVFを行うことができます。
      注:個々の魚に応じて、雌は3日目と4日目に産卵することができます。私たちは、ovaコレクションの成功に応じて、3日目および/または4日目にovaを取得しようとすることをお勧めします。
   4. 5日目に、温度を26.1 °C(79 °F)から24.4 °C(76°F)に下げます。
   5. 6日目に、温度を24.4 °C(76 °F)から22.8 °C(73°F)に下げます。
      注:この温度サイクルを繰り返す前に、7日間のギャップを提供します。これは、このシフト光サイクルに調整するために魚が必要な全体的な時間を短縮するので、この光周期で魚を維持し続けることをお勧めします.

3. 女性のゲームコレクション

1. まず、湿ったティッシュをペトリ皿の蓋に挿入し、皿を閉じて加湿室を作り、採取プロセス中に卵巣が乾燥するのを防ぐことから始めます。
2. 次に、コレクション用の女性を選択します。大きく突出した腹部を持つ重い魚は、おそらくこの手順のための最良の選択になります(図2a)。
   注:成人A.メキシコの男性と女性を区別するために、綿ボール法を^用いて12.
3. 冷たい水を使用して女性を固定し、湿ったスポンジ動物ホルダーの上に上の位置に彼女を置きます。少なくとも30sのために4°Cシステムの水に魚を置くことによって、または魚が固定されるまでそうしてください(すなわち、ギルの動きの損失は、詳細については、ロスと^ロス13を参照してください)。
   注:迅速に作業し、手順が完了するまで魚を温めないようにしてください。これには、定期的に指の手袋の先端を冷たい水に浸したり、補足麻酔を提供したりすることが含まれます。他の麻酔法(例えば、MS-222¹³⁾も同様に使用されてもよい。スタワーズ医学研究所のIACUCガイドラインの下で、ovaの手動収集は、完全な麻酔を必要としない非侵襲的な手順と考えられています(例えば、MS-222を通じて)。
4. 一度配置, 水との接触として繊細な組織の拭き取りで魚の腹部側をブロットすると、卵巣が活性化します.
5. 親指と人差し指の間に女性を保持します。指をわずかに転がしながら、泌尿生殖器の開口部の方向にコエロミック空洞の側面に対して穏やかに絞ります。使い捨てへらを使用して発現した卵子を収集します。
6. これらのovaを加湿したペトリ皿に移します。
   注:特定の親子データが必要ない場合は、ovaのいくつかのクラッチを同じ皿に組み合わせてもよい。ovaは24°Cで保存することができ、回収後30〜60分以内にIVFに使用する場合に最適です。
7. 回収後、魚をシステム水で満たされた回収タンクにそっと戻します。
   注:必要に応じて、将来のovaコレクションのために暗いキャビネットタンクに魚を戻します。

4. 男性のゲームコレクション

1. コレクション用の男性を選択します。
   注:男性のゲームの品質の外側に目に見える兆候はありません。しかし、魚は、この手順で使用する前に外観に健康に見える必要があります。成人A.メキシコの男性と女性を区別するために、綿球法を^用いて12.
2. 冷たい水を使用して男性を固定し、湿ったスポンジ動物ホルダーの上にスパンツの位置に置きます。少なくとも30秒間、または魚が固定されるまで4°C系水に魚を置くことによって固定化する(すなわち、ギルの動きの損失は、詳細については、ロスと^ロス13を参照してください)。
   注:迅速に作業し、手順が完了するまで魚を温めないようにしてください。これには、定期的に指の手袋の先端を冷たい水に浸したり、補足麻酔を提供したりすることが含まれます。他の麻酔法(例えば、MS-222¹³⁾もここで使用されてもよい。スタワーズ医学研究所のIACUCガイドラインの下では、精子の手動収集は、完全な麻酔を必要としない非侵襲的な手順と考えられています(例えば、MS-222を通じて)。
3. 水との接触がミルトを活性化するように繊細なティッシュワイプで魚の腹部側をブロット。
4. 毛細管の端を泌尿生殖器の開口部にそっと置きます。
5. 親指と人差し指で魚の側面に穏やかな圧力を加えることによってミルトを追い出します。エラに遠位を開始, 泌尿生殖器の開口部に向かって移動.
6. 毛細管の端にミルトを収集します。穏やかな吸引は、吸引器チューブの使用によって必要な場合があります。ミルトで排出される可能性のある便は避けてください。
7. ミルトを空の1.5mL遠心分離管に分配し、精子エクステンダーE400の2倍の体積で希釈する(材料の表を参照)。氷の上にいろ
   注:特定の親子データが必要ない場合は、複数の男性からのミルトが一緒にプールされることがあります。このステップは、ミルトの作業時間を数時間延長するために使用することができますが、即時受精のために必要とされません。
8. 回収後、魚をシステム水で満たされた回収タンクにそっと戻します。
   注:必要に応じて、将来の精子収集のために暗いキャビネットタンクに魚を戻します。

5. 体外受精

1. 各ストックのための新しいピペットを使用して、ミルトで精子として受精する前にチューブの側面をピペッティングおよび/または攪拌することによって精子を混合し、時間をかけてE400溶液に沈着することができます。
2. ミルトまたは拡張ミルト溶液を新たに採取した卵子に分配します。
3. すぐに受精のための精子と卵を活性化するためにクラッチにシステム水の1 mLを追加します。皿の内容物を混ぜたり攪拌したりすることを避け、受精のために2分を可能にする。
   注:混合と攪拌は、受精率を大幅に低下させ、^{したがって、14}を避けるべきです。
4. E2胚メディアを追加して、2/3^rdの完全な皿を埋めます。
   注:後続の手順に応じて、胚はすぐに使用することができる(例えば、15より前に記載された遺伝的構成要素の注射のために)または胚は、5 dpfに達するまで23°CでE2胚培地でインキュベートすることができる。この時点で、システム水を使用して、主な再循環ハウジングシステムに胚を転送します。

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結果

ここで説明するプロトコルは、主に以前に公開されたプロトコル⁶に基づいています。しかし、A.メキシコ人は夜間に産卵するので、労働時間に依存しない光周期を変えることができる魚の飼育用のハウジングラックを設計しました(図1)。魚の光サイクルは、3列のタンクを含む完全に囲まれたフロースルー養殖システム内...

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ディスカッション

IVFはゼブラフィッシュのような多くの異なるモデル生物のための標準化された方法であるが、A.メキシコのための既存のプロトコルは、この種が自然に夜間6の間に生み出することを考慮に入れていない。洞窟魚と表面魚が概日リズムで大きく異なることを考えると、卵子の成熟周期も洞窟と表面の形態の間で異なります。表面A.メキシコのステージング温度と?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Centrifuge Tube	Eppendorf	#22364111
100 mm Petri Dishes	VWR International	#25384-302
Aspirator Tube	Drummond	#2-000-000
Calibrated 1-5 µL Capillary Tubes	Drummond	#2-000-001
Dispolable Spatulas	VWR International	#80081-188
HMA-50S  50W Aquatic Heaters	Finnex	HMA-50S
P1000 Pipette	Eppendorf	#3123000063
P1000 Pipette Tips	Thermo Scientific	#2079E
Sanyo MIR-554 incubator	Panasonic Health Care	MIR-554-PA
Sperm Extender E400			130 mM KCl, 50 mM NaCl, 2 mM CaCl2 (2H2O), 1 mM MgSO4 (7H2O), 10 mM D (+)-Glucose, 30 mM HEPES Adjust to pH 7.9 with  5M KOH and filter sterilize. Solution can be stored at 4 ?C for up to 6 months.
Sponge Animal Holder			Made from scrap foam
System Water			Deionized water supplemented with Instant Ocean Sea Salt [Blacksburg, VA] to reach a specific conductance of 800 µS/cm.  Water quality parameters are maintained within safe limits (Upper limit of total ammonia nitrogen range, 1 mg/L; upper limit of nitrite range, 0.5 mg/L; upper limit of nitrate range, 60 mg/L; temperature, 22 °C; pH, 7.65; dissolved oxygen 100 %)
Tissue Wipes	Kimberly-Clark Professional	#21905-026
ZIRC E2 Embryo Media			15 mM NaCl, 0.5 mM KCl, 1.0 mM MgSO4, 150 µM KH2PO4, 50 µM Na2HPO4, 1.0 mM CaCl2, 0.7 mM NaHCO3. Adjust pH to 7.2 to 7.4 using 2 N hydrochloric acid. Filter sterilize. Stored at room temperature for a maximum of two weeks.