Gamete Collection y Fertilización In Vitro de Astyanax mexicanus

Resumen

La fertilización in vitro es una técnica comúnmente utilizada con una variedad de organismos modelo para mantener las poblaciones de laboratorio y producir embriones sincronizados para aplicaciones posteriores. Aquí, presentamos un protocolo que implementa esta técnica para diferentes poblaciones del tetra pescado mexicano, Astyanax mexicanus.

Resumen

Astyanax mexicanus está emergiendo como un organismo modelo para una variedad de campos de investigación en ciencia biológica. Parte del éxito reciente de esta especie de peces de teleost es que posee cuevas interferentes y poblaciones que habitan en los ríos. Esto permite el mapeo genético de rasgos hereditarios que se fijaron durante la adaptación a los diferentes ambientes de estas poblaciones. Si bien esta especie puede ser mantenida y criada en el laboratorio, es un reto obtener embriones durante el día y crear embriones híbridos entre cepas. La fertilización in vitro (FIV) se ha utilizado con una variedad de diferentes organismos modelo para criar con éxito y repetidamente animales en el laboratorio. En este protocolo, mostramos cómo, al aclimatar A. mexicanus a diferentes ciclos de luz junto con cambios en la temperatura del agua, podemos cambiar los ciclos de reproducción a una hora elegida del día. Posteriormente, mostramos cómo identificar peces parentales adecuados, recolectar gametos saludables de machos y hembras, y producir descendencia viable usando FIV. Esto permite que se produzcan procedimientos relacionados como la inyección de construcciones genéticas o el análisis del desarrollo durante las horas normales de trabajo. Además, esta técnica se puede utilizar para crear híbridos entre las poblaciones de cuevas y habitantes de superficie, y así permitir el estudio de la base genética de adaptaciones fenotípicas a diferentes ambientes.

Introducción

En los últimos años, Astyanax mexicanus se ha convertido en un organismo modelo en diferentes campos como la biología del desarrollo, la biología evolutiva, la biología conductual y la fisiología^1,2,3,4 . La singularidad de este sistema proviene de que esta especie tenga varios morfotipos que se han adaptado a ambientes muy diferentes. El morfotipo de la vivienda superficial vive en ríos donde hay una alta biodiversidad y un montón de fuentes de alimento para los peces. Por el contrario, los morfotipos de la cueva de A. mexicanus,el pez cavernario, viven en cuevas donde la biodiversidad, las fuentes de alimentos y el oxígeno disminuyen drásticamente¹. Los peces cavernícolas difieren de los peces de superficie en una variedad de fenotipos como la ausencia de ojos y pigmentación, resistencia a la insulina, y la capacidad de almacenar grasa^2,3,4. Sin embargo, los peces de superficie y los peces cavernícolas siguen perteneciendo a la misma especie y, por lo tanto, son interferentes.

Para ambos morfotipos, se ha definido un conjunto de condiciones para permitir el mantenimiento y la cría de rutina en condiciones^delaboratorio 5,^6. Sin embargo, las modificaciones genéticas, los estudios de desarrollo embrionario adecuados y la creación de híbridos siguen siendo desafiantes por varias razones. A. mexicanus desove principalmente durante las horas nocturnas, lo que es inconveniente para experimentos posteriores en etapas embrionarias tempranas como la inyección de construcciones genéticas o el monitoreo de procesos de desarrollo embrionariotemprano tempranos. Además, la generación de híbridos superficiales y de cuevas es un reto utilizando el desove natural, ya que los morfotipos de la cueva tienen un ritmo circadiano alterado⁷ que en última instancia afecta a la producción de óvulos viables. Se han descrito procedimientos exitosos, pero invasivos, de FIV para otras especies de Astyanax, donde la producción de gametos y el comportamiento de desove se prepararon con inyecciones hormonales^8,9. Se han descrito procedimientos de FIV menos invasivos (es decir, obtención de gametos a partir de manual sin la inyección de preparaciones hormonales), pero no se tienen en cuenta las diferencias en el ciclo de desove entre los morfotipos de cueva y superficie de A. mexicanus ⁶.

Otros organismos modelo de peces, como el pez cebra, pueden ser fácilmente modificados genéticamente y estudiados a nivel embrionario porque los obstáculos indicados anteriormente se han resuelto con éxito. La implementación de técnicas de reproducción estandarizadas, la fertilización in vitro y la criopreservación de espermatozoides han empujado al pez cebra hacia adelante y solidificado el uso del modelo en las ciencias biológicas^10. Por lo tanto, extender estas técnicas a A. mexicanus lo fortalecerá aún más como un sistema modelo.

Aquí, presentamos un protocolo detallado para la FIV que ayudará a hacer A. mexicanus más accesible. Presentaremos una configuración de cría que permite cambiar los ciclos de luz de los peces de día a noche para que se puedan obtener óvulos viables durante las horas de día sin necesidad de inyección de preparaciones hormonales. A continuación, proporcionamos una descripción detallada de cómo obtener los óvulos y milt utilizados para la FIV. Este método permitirá la producción de embriones durante las horas normales de trabajo y hará que las aplicaciones posteriores sean más factibles en comparación con el uso de embriones de desove natural.

Protocolo

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Instituto Stowers para la Investigación Médica.

1. Manipulación del ciclo de luz

1. Instalar tanques de peces dentro de un sistema de acuicultura opaco, totalmente cerrado (protección ligera), que fluya a través de múltiples filas de tanques (Figura1).
   NOTA: El sistema de flujo a través, como se muestra en la Figura 1, utiliza agua del sistema para vaciar los residuos a través de la tubería del soporte trasero de cada tanque y fluye hacia un sumidero que se vacía en un drenaje sanitario. En este experimento, se utilizó un tipo de cambio de agua de un galón (EE.UU.) por hora a través de un emisor de goteo.
2. Mantener la temperatura de cada tanque con un elemento calefactor independiente que se utiliza para alterar manualmente la temperatura durante el proceso de cebado.
3. Configure filas individuales de una manera para habilitar fotoperiodos separados en cada uno. Instale puertas en cada fila que se puedan cerrar para evitar que la luz entre o escape.
   NOTA: El controlador automatizado puede permitir la manipulación de todos los fotoperiodos con la menor perturbación para los peces.
4. Equipar el bastidor con una luz de trabajo roja y cortinas opacas para el acceso durante las horas oscuras.

2. Ajuste del fotoperiodo y el pescado cebado para la recolección de gametos

1. Retire el pescado deseado (Figura2a)de los estantes generales del sistema y colóquelo en los estantes de cría para permitir el ajuste del fotoperiodo 14 días antes del cebado.
   NOTA: Esto permite que los peces se aclimaten a un nuevo entorno.
2. Mantener el pescado a 22,8 oC (73 oF) durante este período utilizando el sistema de calentamiento acuático instalado. El fotoperiodo normal es de 6 a.m. a 8 p.m. de luz y de 8 p.m. a 6 a.m. de noche. Para el rack de ciclo de luz, cambie el fotoperiodo a 10 p.m. a 12 p.m. de luz y de 12 p.m. a 10 p.m. de noche ajustando el temporizador que alimenta la luz dentro del bastidor.
   NOTA: Los machos y las hembras se alojan en el mismo tanque para permitir comportamientos de cebado naturales. Mientras que el desove puede tener lugar en el tanque, los peces todavía se pueden utilizar para la fertilización in vitro ya que los gametos se liberan en las etapas^11.
3. Una vez que los peces estén aclimatados, comience a cebar los animales para desovar⁵ como se describe en los pasos 2.3.1 a 2.3.5.
   NOTA: Este procedimiento tarda seis días en total. Durante este tiempo, cambie la temperatura para preparar la producción de óvulos utilizando un sistema de calefacción acuática instalado. Usando los Calentadores Acuáticos de 50W (ver Tabla de Materiales),ajuste el calentador directamente a la temperatura (escala en el calentador está en Fahrenheit) dada en el protocolo en cada paso. Dependiendo del tamaño del tanque y la velocidad de flujo del agua, el tiempo de ajuste de la temperatura puede diferir. En este experimento, la temperatura se ajustó al mediodía y el equilibrio de temperatura se apoderó de las siguientes 18 h.
   1. En el día 1, suba la temperatura de 22,8 oC (73 oF) a 24,4 oC (76 oF).
   2. En el día 2, suba la temperatura de 24,4 oC (76 oF) a 26,1 oC (79 oF).
   3. Los días 3 y 4, mantenga la temperatura a 26,1 oC. Los peces estarán listos para desovar durante el día y se puede realizar FIV.
      NOTA: Dependiendo de los peces individuales, las hembras pueden desovar el día 3 y/o el día 4. Recomendamos intentar obtener óvulos el día 3 y/o el día 4 dependiendo del éxito de la colección de óvulos.
   4. En el día 5, baje la temperatura de 26,1 oC (79 oF) a 24,4 oC (76 oF).
   5. En el día 6, baje la temperatura de 24,4 oC (76 oF) a 22,8 oC (73 oF).
      NOTA: Proporcione un intervalo de 7 días antes de repetir este ciclo de temperatura. Se recomienda seguir manteniendo los peces en este fotoperiodo ya que esto reducirá el tiempo total necesario por el pescado para ajustarse a este ciclo de luz desplazado.

3. Colección de gametos femeninos

1. Comience insertando una toallita de tejido humedecido en la tapa de un plato Petri y cerrando el plato para crear una cámara humidificada y evitar que los óvulos se sequen durante el proceso de recolección.
2. A continuación, elija una hembra para la colección. Los peces gravid con abdomens grandes y salientes probablemente serán la mejor opción para este procedimiento (Figura2a).
   NOTA: Para diferenciar entre machos y hembras de A. mexicanusadulto, se utilizó el método de bola de algodón¹².
3. Inmovilizar a una hembra usando agua fría y colocarla en la posición supina en un soporte de animal esponja humedecido. Para ello, coloque el pescado en agua del sistema de 4oC durante al menos 30 s o hasta que el pez esté inmovilizado (es decir, pérdida de movimiento de las branquias, consulte Ross y Ross¹³ para obtener más información).
   NOTA: Trabaje rápidamente y trate de evitar calentar el pescado hasta que se complete el procedimiento. Esto puede incluir sumergir periódicamente las puntas enguantadas de los dedos en agua fría o ofrecer anestesia suplementaria. También se pueden utilizar otros métodos de anestesia (p. ej., MS-222^13). Bajo las directrices de la IACUC del Instituto Stowers para la Investigación Médica, la recolección manual de óvulos se considera un procedimiento no invasivo, que no requiere anestesia completa (por ejemplo, a través de MS-222).
4. Una vez colocado, borre el lado ventral del pez con una delicada toallita de tejido, ya que el contacto con el agua hará que los óvulos se activen.
5. Sostenga la hembra entre el pulgar y el dedo índice. Apriete suavemente contra los lados laterales de la cavidad celómica en la dirección de la abertura urogenital mientras rueda ligeramente los dedos. Recoger los óvulos expresados utilizando una espátula desechable.
6. Transfiera estos óvulos al plato de Petri humidificado.
   NOTA: Se pueden combinar varios embragues de óvulos en el mismo plato si no se necesitan datos específicos de parentesco. Los óvulos se pueden almacenar a 24 oC y son mejores cuando se utilizan para la FIV dentro de 30-60 minutos después de la recolección.
7. Después de la recolección, devuelva suavemente el pescado a un tanque de recuperación lleno de agua del sistema.
   NOTA: Vuelva a colocar el pescado en un tanque de gabinete oscuro para futuras recogidas de óvulos cuando sea necesario.

4. Colección de gametos masculinos

1. Elija un macho para la colección.
   NOTA: No hay signos visibles hacia afuera de la calidad de los gametos masculinos. Sin embargo, los peces deben aparecer sanos en apariencia antes de su uso en este procedimiento. Para diferenciar entre machos y hembras de adulto A. mexicanus,se utilizó el método de bola de algodón^12.
2. Inmovilizar a un macho usando agua fría y colocarlo en la posición supina en un soporte de animal esponja humedecido. Inmovilizar colocando los peces en agua del sistema de 4oC durante al menos 30 segundos o hasta que el pez esté inmovilizado (es decir, pérdida de movimiento de las branquias, ver Ross y Ross¹³ para más detalles).
   NOTA: Trabaje rápidamente y trate de evitar calentar el pescado hasta que se complete el procedimiento. Esto puede incluir sumergir periódicamente las puntas enguantadas de los dedos en agua fría o ofrecer anestesia suplementaria. Otros métodos de anestesia (por ejemplo, MS-222¹³) también se pueden utilizar aquí. Bajo las directrices de la IACUC del Instituto Stowers para la Investigación Médica, la recolección manual de espermatozoides se considera un procedimiento no invasivo, que no requiere anestesia completa (por ejemplo, a través de MS-222).
3. Soplar el lado ventral del pez con una delicada toallita de tejido como contacto con el agua activará el milt.
4. Coloque suavemente el extremo de un tubo capilar en la abertura urogenital.
5. Expulsar milt aplicando una presión suave en los lados del pez con el pulgar y el dedo índice. Comience distal a las branquias, moviéndose hacia la abertura urogenital.
6. Recoger el milt en el extremo de un tubo capilar. La succión suave puede ser necesaria mediante el uso de un tubo del aspirador. Evite las heces que puedan ser expulsadas con la milta.
7. Dispensar el milt en un tubo de centrífuga vacío de 1,5 ml y diluir con el doble del volumen de Sperm Extender E400 (ver Tabla de Materiales). Manténgase en hielo.
   NOTA: Milt de varios machos se pueden agrupar si no se necesitan datos específicos de parentesco. Este paso se puede utilizar para extender el tiempo de trabajo de la milt durante varias horas, pero no es necesario para la fertilización inmediata.
8. Después de la recolección, devuelva suavemente el pescado a un tanque de recuperación lleno de agua del sistema.
   NOTA: Vuelva a colocar el pescado en el tanque del gabinete oscuro para la futura recolección de espermatozoides cuando sea necesario.

5. Fertilización in vitro

1. Usando una nueva pipeta para cada acción, mezcle los espermatozoides pipeteando y/o agitando el lado del tubo antes de fertilizar como espermatozoides en milt puede asentarse en la solución E400 con el tiempo.
2. Dispensar el milt o solución de milt extendido en los óvulos recién recogidos.
3. Agregue rápidamente 1 ml de agua del sistema al embrague para activar los espermatozoides y los óvulos para la fertilización. Evite mezclar o agitar el contenido del plato y deje 2 minutos para que se produzca la fertilización.
   NOTA: Mezclar y agitar reduce en gran medida las tasas de fertilización y, por lo tanto, debe evitarse¹⁴.
4. Añadir E2 Embryo Media para llenar el plato 2/3^rd lleno.
   NOTA: Dependiendo del procedimiento posterior, los embriones pueden utilizarse de inmediato (por ejemplo, para la inyección de construcciones genéticas como se describe antes de¹⁵) o los embriones pueden ser incubados en E2 Embryo Media a 23oC hasta que alcancen los 5 dpf. En este punto transferir embriones al sistema principal de viviendas de recirculación utilizando agua del sistema.

Resultados

El protocolo presentado aquí se basa principalmente en un protocolo^publicadopreviamente 6. Sin embargo, dado que A. mexicanus desove durante las horas de la noche, diseñamos un estante de alojamiento para la cría de peces que puede cambiar el fotoperiodo independientemente de las horas de trabajo (Figura1). El ciclo de luz de los peces se altera dentro de un sistema de acuicultura completamente cerrado y fluido que contiene...

Discusión

Si bien la FIV es un método estandarizado para muchos organismos modelo diferentes como el pez cebra, losprotocolos existentes para A. mexicanus no tienen en cuenta que esta especie desove naturalmente durante las horas de la noche 6. Dado que los peces cavernarios y los peces de superficie difieren drásticamente en sus ritmos circadianos, el ciclo de maduración de los óvulos también difiere entre los morfotipos de la cueva y la superficie. Mientras que las temperaturas y tiempos de ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Centrifuge Tube	Eppendorf	#22364111
100 mm Petri Dishes	VWR International	#25384-302
Aspirator Tube	Drummond	#2-000-000
Calibrated 1-5 µL Capillary Tubes	Drummond	#2-000-001
Dispolable Spatulas	VWR International	#80081-188
HMA-50S  50W Aquatic Heaters	Finnex	HMA-50S
P1000 Pipette	Eppendorf	#3123000063
P1000 Pipette Tips	Thermo Scientific	#2079E
Sanyo MIR-554 incubator	Panasonic Health Care	MIR-554-PA
Sperm Extender E400			130 mM KCl, 50 mM NaCl, 2 mM CaCl2 (2H2O), 1 mM MgSO4 (7H2O), 10 mM D (+)-Glucose, 30 mM HEPES Adjust to pH 7.9 with  5M KOH and filter sterilize. Solution can be stored at 4 ?C for up to 6 months.
Sponge Animal Holder			Made from scrap foam
System Water			Deionized water supplemented with Instant Ocean Sea Salt [Blacksburg, VA] to reach a specific conductance of 800 µS/cm.  Water quality parameters are maintained within safe limits (Upper limit of total ammonia nitrogen range, 1 mg/L; upper limit of nitrite range, 0.5 mg/L; upper limit of nitrate range, 60 mg/L; temperature, 22 °C; pH, 7.65; dissolved oxygen 100 %)
Tissue Wipes	Kimberly-Clark Professional	#21905-026
ZIRC E2 Embryo Media			15 mM NaCl, 0.5 mM KCl, 1.0 mM MgSO4, 150 µM KH2PO4, 50 µM Na2HPO4, 1.0 mM CaCl2, 0.7 mM NaHCO3. Adjust pH to 7.2 to 7.4 using 2 N hydrochloric acid. Filter sterilize. Stored at room temperature for a maximum of two weeks.