JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

في هذا البروتوكول، نقوم بشرح وتفصيل كيفية استخدام الخلايا الجذعية متعددة القوى التي يسببها الإنسان للتمايز وتنقية خلايا القلب، والمزيد، حول كيفية تحسين كفاءتها في زرع مع مثبطات كيناز البروتين المرتبطة بـ Rho المعالجة المسبقة في نموذج احتشاء عضلة القلب الماوس.

Abstract

عامل حاسم في تحسين فعالية العلاج الخلوي لتجديد عضلة القلب هو زيادة بأمان وكفاءة معدل تطعيم الخلايا. Y-27632 هو مثبط قوي للغاية من الكينا البروتين المرتبطة بـ Rho، واللفائف المحتوية على لفائف (RhoA/ROCK) ويستخدم لمنع المبرمج الخلوي الناجم عن التفكك (anoikis). نثبت أن المعالجة المسبقة Y-27632 لخلايا القلب المستمدة من الخلايا الجذعية المتعددة القوى (hiPSC-CMs+RI)قبل زرع نتائج في تحسين معدل تطعيم الخلايا في نموذج الماوس من احتشاء عضلة القلب الحاد (MI). هنا، نقوم بوصف إجراء كامل من التمايز hiPSC-CMs، وتنقية، والعلاج المسبق للخلايا مع Y-27632، فضلا عن تقلص الخلايا الناتجة، قياسات عابرة الكالسيوم، وزرع في نماذج MI الماوس. توفر الطريقة المقترحة طريقة بسيطة وآمنة وفعالة ومنخفضة التكلفة مما يزيد بشكل كبير من معدل تطعيم الخلايا. لا يمكن استخدام هذه الطريقة فقط جنبا إلى جنب مع طرق أخرى لزيادة تعزيز كفاءة زرع الخلايا ولكن أيضا يوفر أساسا مواتيا لدراسة آليات أمراض القلب الأخرى.

Introduction

وقد أظهرت العلاجات القائمة على الخلايا الجذعية إمكانات كبيرة كعلاج لتلف القلب الناجم عن MI1. استخدام hiPSCs المتمايزة يوفر مصدرا لا ينضب من hiPSC-CMs2 ويفتح الباب أمام التطور السريع للعلاجات اختراق. ومع ذلك، لا تزال هناك العديد من القيود على الترجمة العلاجية، بما في ذلك التحدي المتمثل في انخفاض معدل تطعيم الخلايا المزروعة بشكل حاد.

فصل الخلايا مع التربسين يبدأ anoikis3، والتي يتم تسريعها فقط مرة واحدة يتم حقن هذه الخلايا في بيئات قاسية مثل عضلة القلب الإقفارية ، حيث البيئة نقص الأكسجة يسرع المسار نحو موت الخلايا. من الخلايا المتبقية، يتم غسل نسبة كبيرة من موقع الزرع في مجرى الدم وتنتشر في جميع أنحاء المحيط. واحدة من المسارات المبرمج ة الرئيسية هو مسار RhoA / ROCK4. استنادا إلى البحوث السابقة، ومسار RhoA / ROCK ينظم منظمة الأكتين الخلوية الهيكلية5،6، وهو المسؤول عن خلل الخلية7،8. يستخدم مثبطات ROCK Y-27632 على نطاق واسع خلال انفصال الخلايا الجسدية والجذعية وتمريرها، لزيادة التصاق الخلايا والحد من المبرمج للخلايا9و10و11. في هذه الدراسة، يستخدم Y-27632 لعلاج hiPSC-CMs قبل زرع في محاولة لزيادة معدل تطعيم الخلايا.

وقد تم إنشاء عدة طرق تهدف إلى تحسين معدل تطعيم الخلايا، مثل الصدمة الحرارية والطابق السفلي طلاء مصفوفة غشاء12. وبصرف النظر عن هذه الأساليب، يمكن للتكنولوجيا الوراثية أيضا تعزيز انتشار خلايا القلب13 أو عكس الخلايا غير المريمية في خلايا القلب14. من منظور الهندسة الحيوية، يتم زرع خلايا القلب على سقالة المواد الحيوية لتحسين كفاءة زرع15. ومما يؤسف له أن غالبية هذه الأساليب معقدة ومكلفة. على العكس من ذلك، فإن الطريقة المقترحة هنا بسيطة وفعالة من حيث التكلفة وفعالة، ويمكن استخدامها كعلاج القاعدية قبل زرع، وكذلك في الاقتران مع التكنولوجيات الأخرى.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية في هذه الدراسة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) من جامعة ألاباما في برمنغهام، واستندت إلى المعاهد الوطنية للصحة مختبر رعاية الحيوان واستخدام المبادئ التوجيهية (NIH المنشور لا 85-23).

1. إعداد لوحات الثقافة والإعلام والثقافة

  1. إعداد متوسط
    1. لhiPSC المتوسطة، مزيج 400 مل من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى (hPSC) الوسط القاعدي (جدولالمواد1) و 100 مل من الملحق hPSC 5X؛ تخزين الخليط في 4 درجة مئوية.
    2. للنوم في الدقيقة 1640/B27 ناقص الأنسولين (RB-) المتوسطة، مزيج 500 مل من RPMI 1640 و 10 مل من الملحق B27 ناقص الأنسولين.
    3. لRPMI 1640/B27 (RB +) المتوسطة، مزيج 500 مل من RPMI 1640، 10 مل من الملحق B27، و 5 مل من البنسلين-ستربيميتاسين (القلم العقدية) المضادات الحيوية.
    4. لتنقية المتوسطة16، مزيج 500 مل من لا الجلوكوز RPMI 1640 ، 10 مل من الملحق B27 ، 5 مل من المضادات الحيوية القلم العقدية ، و 1000 ميكرولتر من محلول الصوديوم DL-لاكتات (في تركيز نهائي من 4 MM).
    5. لحل تحييد، مزيج 200 مل من RPMI 1640، 50 مل من مصل البقر الجنيني (FBS)، 2.5 مل من المضادات الحيوية القلم العقدية، و 50 ميكرولتر من Y-27632 (في تركيز نهائي من 10 درجة مئوية).
    6. بالنسبة لوسط التجميد، يُمزج 9 مل من FBS، و1 مل من كبريتيد ثنائي الميثيل (DMSO)، و10 ميكرولتر من Y-27632 (بتركيز نهائي قدره 10 ميكرومتر).
    7. لحل المصفوفة خارج الخلية (EMS)، ذوبان مصفوفة خارج الخلية المركزة (جدولالمواد1) في 4 درجة مئوية حتى وصلت إلى حالة سائلة متسقة بالتساوي. نصائح ماصة Precool وأنابيب قبل صنع aliquots مصفوفة من 350 ميكرولتر كل على الجليد، وتخزين aliquots في -20 درجة مئوية. قبل طلاء لوحات، تمييع واحد aliquot المذاب في 24 مل من الجليد الباردة DMEM / F12 المتوسطة (EMS)؛ الحفاظ على EMS في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع.
      ملاحظة: تنفيذ جميع خطوات الطلاء على الجليد لمنع تقوية مصفوفة غشاء الطابق السفلي.
    8. لحل Tyrode، تأخذ 90٪ من الحجم النهائي المطلوب من المياه درجة زراعة الأنسجة، إضافة الكمية المناسبة من الكواشف التالية، ويحرك حتى يذوب. ثم، استخدم 1 N NaOH لضبط الحموضة إلى 7.4. إضافة ماء إضافي إلى التركيز النهائي من 140 مليمول / لتر كلوريد الصوديوم، 1 مليمول / لتر كلوريد المغنيسيوم، 10 مليمول / لتر HEPES، 5 مليمول / لتر كلوريد البوتاسيوم، 10 مليمول / لتر الجلوكوز، و 1.8 مليمول / لتر كلوريد الكالسيوم. تعقيم عن طريق الترشيح، وذلك باستخدام غشاء 0.22 ميكرومتر.
  2. خلية طلاء لوحة ثقافة
    1. للوحات ثقافة hiPSC، وتطبيق 1 مل من EMS على كل بئر من لوحة 6 جيدا واحتضان لوحة لمدة ساعة واحدة على الأقل في 37 درجة مئوية. يستنشق DMEM /F12 الحل قبل خلايا البذر.
    2. لطلاء الجيلاتين، حل 0.2 غرام من مسحوق الجيلاتين في المياه الصف ثقافة الأنسجة لجعل 0.2٪ (ث / الخامس) الحل. تعقيم عن طريق الأوتوكلاف في 121 درجة مئوية، 15 رطل لكل دقيقة معطف كل بئر من لوحة 6 جيدا مع 2 مل من الحل وحضانة لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية. قبل تمرير الخلايا، يستنشق الحل والسماح لللوحة لتجف لمدة 1 ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة داخل غطاء محرك السيارة ثقافة الأنسجة.

2. hiPSC الصيانة واستئصال عضلة القلب التمايز

  1. قم بزراعة الـ hiPSCs في وسط hiPSC (انظر الخطوة 1.1.1) مع تغيير متوسط يومي حتى تصل الخلايا إلى التقاء 80%-90% لكل بئر.
    ملاحظة: لأغراض الصيانة، hiPSCs هي عموما على استعداد للمرور كل 4 أيام.
  2. لتمرير hiPSCs، يستنشق المتوسط وغسل البئر 1X مع 1X الفوسفات المخزنة المالحة (PBS). إضافة 0.5 مل من حل مفرزة الخلايا الجذعية (جدولالمواد1) إلى كل بئر وحضانة في 37 درجة مئوية لمدة 5-7 دقيقة.
    ملاحظة: يعتمد وقت الحضانة على كثافة الخلايا ومعدل التفكك، والتي يمكن ملاحظتها تحت المجهر.
  3. تحييد حل مفرزة الخلايا الجذعية مع 1 مل من hiPSC المتوسطة تستكمل مع 5 μM Y-27632. جمع الخليط في أنبوب الطرد المركزي 15 مل. طرد مركزي أنبوب لمدة 5 دقائق في 200 × ز، يستنشق supernatant دون إزعاج بيليه الخلية، ومن ثم، إعادة تعليق الخلايا في 1 مل من hiPSC المتوسطة التي تحتوي على 5 μM Y-27632.
  4. بذور hiPSCs على لوحة جديدة EMS المغلفة 6-جيدا بنسبة بين 1:6 إلى 1:18. تغيير المتوسط إلى hiPSC المتوسطة دون Y27632 بعد 24 ساعة.
  5. لتجميد الخلايا، إعادة تعليق hiPSCs منفصلة في وسط التجميد بتركيز 0.5-1 مليون/500 درجة مئوية، ووضع التعليق في cryovials، وتخزينها في فريزر -80 درجة مئوية. نقل قارورة المجمدة إلى النيتروجين السائل بعد 24 ساعة.
  6. للتمييز، استبدل وسيط hiPSC بـ 2 مل من RB- متوسطة مكمّلة بمثبطات GSK-3β 10 درجة مئوية CHIR99021 (CHIR) عند 80% - 90% من التقاء الخلايا. يستعاض عن المتوسط بـ 3 مل من RB-medium بعد 24 ساعة وحضانة لمدة 48 ساعة إضافية (اليوم 3).
  7. في اليوم 3، تغيير المتوسط إلى 3 مل من RB- المتوسطة مع 10 μM Wnt المانع IWR1 لمدة 48 ساعة (اليوم 5)، ثم استبدال المتوسطة مع 3 مل من RB- المتوسطة والحفاظ على 48 ساعة (اليوم 7).
  8. في اليوم 7، استبدال المتوسطة مع 3 مل من RB المتوسطة وتغيير المتوسطة كل 3 أيام المضي قدما. وينبغي ملاحظة الضرب التلقائي للـ hiPSC-CMs بين الأيام 7-10.

3. hiPSC-CMs تنقية وجزيء صغير قبل المعالجة

ملاحظة: وقد استخدمت الإنزيمات عالية النقاء، المؤتلفة خلية تفكك (جدولالمواد1) لتفكك hiPSC-CMs.

  1. في اليوم 21 بعد تمايز hiPSC-CM، يستنشق المتوسط ويغسل الخلايا 1x مع PBS المعقمة. احتضان الخلايا مع 0.5 مل من إنزيمات تفكك الخلايا لكل بئر لمدة 5-7 دقائق عند 37 درجة مئوية. الماصة مرارا وتكرارا تعليق الخلية باستخدام ماصة 1 مل من أجل فصل الخلايا تماما.
  2. بعد فصل الخلايا، إضافة 1 مل من حل تحييد لكل بئر، وجمع خليط الخلية في أنبوب الطرد المركزي 15 مل والطرد المركزي في 200 × غرام لمدة 3 دقائق.
  3. إعادة زرع الخلايا على الجيلاتين المغلفة 6-جيدا لوحات في كثافة 2 مليون خلية في بئر.
  4. بعد 24-48 ساعة، استبدل الوسيط الثقافي بوسيلة تنقية لمدة 3-5 أيام.
    ملاحظة: تنقية كاملة عندما أكثر من 90٪ من الخلايا في كل حقل عرض المجهر هي الضرب. لمنع المزيد من الضرر لخلايا القلب، لا تمدد مدة التنقية إلى ما بعد 5 أيام. إذا كانت الجولة الأولى لا تسفر عن النقاء اللازم، استبدل وسيط التنقية بـ RB+ المتوسطة لمدة يوم واحد، ثم أكمل جولة ثانية من التنقية.
  5. قبل زرع، زراعة الخلايا في مجموعة العلاج لمدة 12 ساعة في RB + المتوسطة تستكمل مع 10 μM Y-27632. وبالمثل، إجراء العلاج فيراباميل على الخلايا في RB + المتوسطة مع 1 ميكروم فيراباميل لمدة 12 ساعة (hiPSC-CMs+VER).
  6. بعد العلاج، اغسل hiPSC-CMs 1x مع PBS وحضانة الخلايا مع 0.5 مل من إنزيمات تفكك الخلايا لكل بئر كحد أقصى لمدة 2 دقيقة. تحييد الخلايا مع حل تحييد، وجمع خليط الخلية في أنبوب الطرد المركزي 15 مل، والطرد المركزي في 200 × ز لمدة 3 دقائق.

4. احتشاء عضلة القلب وزرع الخلايا

ملاحظة: يتم تعقيم جميع الأدوات الجراحية مع الأوتوكلاف ويتم الحفاظ عليها في حالة معقمة خلال عمليات جراحية متعددة عن طريق معقم حبة الساخنة (جدولالمواد2).

  1. التخدير NOD / scid الفئران (جدولالمواد2) مع الايسوفلوران استنشاق (1.5٪-2٪). مراقبة مستويات التخدير من قبل استجابات الفئران لقرصة اصبع القدم. ضع مرهم بصري بيطري على العينين لمنعها من التجفيف أثناء الجراحة.
  2. توريد 0.1 مغ/كغ بوبرينورفين تحت الجلد لإدارة الألم قبل الجراحة.
  3. وضع وتأمين الماوس في موقف supine على طاولة تشغيل ساخنة، وإزالة الشعر من منطقة الرقبة البطني والصدر الأيسر باستخدام كريم مزيل الشعر، وفضح الجلد، وتطهيره مع الكحول 70٪.
  4. قطع شق 0.5 سم في وسط الرقبة باستخدام مقص الجراحية، وفصل الدهون تحت الجلد مع ملقط معقمة، وفضح القصبة الهوائية. أدخل عن طريق الفم قنية التنبيب في القصبة الهوائية، وربط قنية إلى جهاز التنفس الصناعي الحيوان الصغيرة، وضبط إعدادات التهوية (تعيين حجم المد والجزر في 100-150 درجة مئوية ومعدل التنفس في 100x-150x في الدقيقة).
  5. بعد استقرار الماوس، اقطع شقًا بحجم 0.5 سم في منتصف جلد الصدر الأيسر. استخدام ملقط لفصل طبقة العضلات بصراحة وجعل شق صغير في الفضاء الوربي الخامس لفضح تجويف الصدر. ضع الجرار في الشق لفتح تجويف الصدر وتحديد موقع الشريان التاجي التنازلي الأيسر (LAD). تحت المجهر الجراحي تشريح، ligate LAD مع 8-0 خياطة غير قابلة للامتصاص.
  6. مباشرة بعد الحث MI، حقن 5 ميكرولتر من hiPSC-CMs-RI،hiPSC-CMs+RI،hiPSC-CMs-VER، hiPSC-CMs+ VER،أو حجم متساو من PBS في عضلة القلب الماوس في كل موقع (3 × 105 خلايا / الحيوان، 1 × 105 الخلايا / الموقع)، واحد في منطقة احتشاء واثنين في المناطق المحيطة احتشاء.
    ملاحظة: منذ 5 μL هو حجم صغير جدا، فإنه ليس من السهل السيطرة بدقة على حجم عن طريق مص مباشرة مع حقنة. يمكن تسليم غطاء طبق بيتري العقيم، ويمكن إيداع 5 ميكرولتر من الخلايا أولاً على الغطاء مع ماصة. بسبب التوتر السطحي، فإنه لن ينتشر ولكن سوف تتكثف في كتلة سائلة صغيرة. ويمكن امتصاص هذا بسهولة وحقنه في عضلة القلب الماوس.
  7. القضاء على الهواء المتبقي في تجويف الصدر عن طريق ملء مع حل ملحي متساوي التوتر الدافئ. غرزة الأضلاع والعضلات والجلد في تسلسل مع خياطة 6-0 قابلة للامتصاص. إيقاف حقن التخدير isoflurane. الحفاظ على الحيوانات جراحة على وسادة التدفئة ومراقبة عن كثب لهم في حين أنها استعادة الوعي الكامل. ثم ضع الحيوانات في قفص نظيف. لا تقم بإعادة الحيوانات إلى صحبة الحيوانات الأخرى حتى يتم استردادها بالكامل.
  8. بعد الجراحة، حقن الفئران داخل اقبولات مع البوبرينورفين (0.1 ملغ / كغ) كل 12 ساعة لمدة 3 أيام متتالية وحقنها مع ايبوبروفين (5 ملغ / كغ) كل 12 ساعة ليوم واحد. إجراء دراسات تحليلية لاحقة في نقاط زمنية محددة.
    ملاحظة: اتبع إرشادات لجنة رعاية الحيوانات المحلية الخاصة بك للتسكين.

5. الكالسيوم العابر وتسجيل الانقباض

  1. الأوتوكلاف 15 مم قطر الأغطية (جدولالمواد2) وملاقط في كوب زجاجي صغير في 121 درجة مئوية، 15 رطل لكل بوصة مربعة لمدة 15 دقيقة.
  2. باستخدام ملاقط، ضع غطاء في لوحة 12 جيدا وماصة 300 ميكرولتر من المصفوفة خارج الخلية على كل غطاء.
    ملاحظة: لا تدع المصفوفة تتجاوز حافة غطاء لمنع الحد من كمية طلاء المصفوفة. احتضان لوحة 12 جيدا في حاضنة ثقافة الخلية 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  3. قم بإستقثيال الوسيلة في طبق 6-well المطلي بالجيلاتين مع hiPSC-CMs النقي، واغسله 1x مع PBS، ثم هضمه بـ 0.5 مل من إنزيمات انفصال الخلايا لمدة 1.5 دقيقة. ، والطرد المركزي الخليط في 200 × ز لمدة 3 دقائق.
  4. قم بإستنسخ المصفوفة خارج الخلية المغلفة من الأغطية. عد رقم الخلية وأعد تعليق الخلايا في محلول تحييد إلى تركيز 40،000/300 درجة مئوية، ثم إضافة 300 ميكرولتر من تعليق الخلية على كل غطاء. ثقافة لوحة في حاضنة 37 درجة مئوية.
  5. بعد 24 ساعة، يستنشق بلطف الحل تحييد، إضافة 500 درجة مئوية من RB + المتوسطة إلى كل بئر من لوحة، والاستمرار في الثقافة لمدة 2 أيام.
  6. إضافة Y-27632 (10 درجة مئوية)، رو كيناز المنشط (RA، 100 nM)، فيراباميل (1 درجة مئوية)، أو حجم متساو من PBS في وسط الثقافة من hiPSC-CMs، 12 ساعة قبل الكالسيوم العابر وكشف الانقباض.
    ملاحظة: بالإضافة إلى الكشف عن الكالسيوم العابر للخلايا وتقلصها بعد 12 ساعة من المعالجة الكيميائية، تم اختبار الكشف عن هذه المعلمات أيضا في 12، 24، 48، و 72 ساعة بعد الانسحاب الكيميائي.
  7. إخراج لوحة، وتجاهل المتوسطة، وغسل لوحة 1X مع PBS. تغيير المتوسط إلى DMEM خالية من الفينول الأحمر تحتوي على 0.02٪ (ث / خمس) من بوليول السطحي (جدولالمواد1)، 5 ميكرومتر مؤشر الكالسيوم (جدولالمواد1)، وما يقابل Y-27632 (10 ميكرومتر)، RA (100 nM)، فيراباميل (1 ميكرومتر)، أو حجم متساو من PBS، واحتضان لوحة لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية.
  8. تخلص من الـ supernatant، واغسل الخلايا 3x مع DMEM متوسطة خالية من الصبغة، واترك الباقي المتوسط لمدة 30 دقيقة لإزالة استريفي صبغة الخرائط.
  9. ضع غطاء الغطاء ببذور الخلية في غرفة حمام مفتوحة وأدخل الغرفة في نظام microincubation متساوية إلى 37 درجة مئوية مع جهاز تحكم أوتوماتيكي في درجة الحرارة (جدولالمواد2)، وغرسه مع محلول Tyrode، وإضافة باستمرار مثبطات رو كيناز (RI)، RA، أو PBS إلى محلول التسريب.
  10. استخدام مجهر الفلورة المقلوب (جدولالمواد2) ورأس المسح الضوئي بالليزر (جدولالمواد2) لتسجيل الكالسيوم التلقائي عابر عن طريق استخدام x-t خط المسح الضوئي، وذلك باستخدام ليزر الأرجون 488 نانومتر للإثارة صبغ و 515 ± 10 نانومتر حاجز مرشح لجمع ضوء الانبعاثات. تسجيل الانكماش التلقائي من hiPSC-CMs باستخدام وظيفة التباين التداخل التفاضلي من المجهر البؤري (جدولالمواد2).
    ملاحظة: تم معالجة تسجيلات الكالسيوم العابرة وتحليلها باستخدام برنامج MATLAB R2016A (جدولالمواد4). تم إجراء اختبار تغيير تقلص الخلايا باستخدام برنامج ImageJ (جدولالمواد4).

النتائج

وقد استمدت الـ hiPSC-CMs المستخدمة في هذه الدراسة من أصل بشري مع جين مراسل لوسيفيراز؛ لذلك، تم الكشف عن معدل البقاء على قيد الحياة من الخلايا المزروعة في الجسم الحي عن طريق التصوير الإنارة الحيوية (BLI)17 (الشكل1A،B). بالنسبة لأقسام القلب الن...

Discussion

وتشمل الخطوات الرئيسية لهذه الدراسة الحصول على hiPSC-CMs نقية، وتحسين نشاط hiPSC-CMs من خلال Y-27632 المعالجة المسبقة، وأخيرا، زرع كمية دقيقة من hiPSC-CMs في نموذج MI الماوس.

وكانت القضايا الرئيسية التي تم تناولها هنا هي أننا، أولاً، قمنا بتحسين أساليب التنقية الخالية من الجلوكوز...

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

ويشكر المؤلفان الدكتور جوزيف وو (جامعة ستانفورد) على التكرم بتقديم بناء شركة Fluc-GFP والدكتور يانوين ليو على المساعدة التقنية الممتازة. ويدعم هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة RO1 المنح HL95077، HL114120، HL131017، HL138023، UO1 HL134764 (إلى J.Z.)، وHL121206A1 (إلى L.Z.)، وR56 منحة HL142627 (إلى W.Z.)، وهو جمعية القلب الأمريكية منحة العالم 16SDG30410018، وجامعة ألاباما في برمنغهام كلية منحة التنمية (إلى W.Z.).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagent
Accutase (stem cell detachment solution)STEMCELL Technologies#07920
B27 minus insulinFisher ScientificA1895601
B27 SupplementFisher Scientific17-504-044
CHIR99021Stem Cell Technologies72054
DMEM (1x), high glucose, HEPES, no phenol redThermofisher20163029
Fetal bovine serumAtlanta BiologicalsS11150
Fluo-4 AM (calcium indicator)Invitrogen/ThermofisherF14201
Glucose-free RPMI 1640Fisher Scientific11879020
IWR1Stem Cell Technologies72562
Matrigel (extracellular matrix )Fisher ScientificCB-40230C
mTeSR (human pluripotent stem cells medium)STEMCELL Technologies85850
Pen-strep antibioticFisher Scientific15-140-122
Pluronic F-127 (surfactant polyol)Sigma-AldrichP2443
Rho activator IICytoskeletonCN03
RPMI1640Fisher Scientific11875119
Sodium DL-lactateSigma-AldrichL4263
TrypLE (cell-dissociation enzymes)Fisher Scientific12-605-010
VerapamilSigma-AldrichV4629
Y-27632STEMCELL Technologies72304
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment and Supplies
IVIS Lumina III Bioluminescence InstrumentsPerkinElmerCLS136334
15 mm CoverslipsWarnerCS-15R15
CentrifugeEppendorf5415R
Confocal MicroscopeOlympusIX81
CryostatThermo ScientificNX50
Dual Automatic Temperature ControllerWarner InstrumentsTC-344B
Electrophoresis Power SupplyBIO-RAD1645050
Fluoresence MicroscopeOlympusIX83
High Speed Camerapco1200 s
Laser Scan HeadOlympusFV-1000
Low Profile Open Bath Chamber (mounts into above microincubation system)Warner InstrumentsRC-42LP
Microincubation SystemWarner InstrumentsDH-40iL
Minivent Mouse VentilatorHarvard Apparatus845
NOD/SCID miceJackson Laboratory001303
Precast Protein GelsBIO-RAD4561033
PVDF Transfer PacksBIO-RAD1704156
Trans-Blot SystemBIO-RADTrans-Blot Turbo
Hot bead sterilizerFine Science Tools18000-45
NameCompanyCatalog NumberComments
Antibody
Anti-human Nucleolin (Alexa Fluor 647)Abcamab198580
Cardiac Troponin TR&D SystemsMAB1874
Cardiac Troponin CAbcamab137130
Cardiac Troponin IAbcamab47003
Cy5-donkey anti-mouseJackson ImmunoResearch Laboratory715-175-150
Cy3-donkey anti-rabbitJackson ImmunoResearch Laboratory711-165-152
Fitc-donkey anti-mouseJackson ImmunoResearch Laboratory715-095-150
GAPDHAbcamab22555
Human Cardiac Troponin TAbcamab91605
Integrin β1Abcamab24693
Ki67EMD Milliporeab9260
N-cadherinAbcamab18203
Phospho-Myosin Light Chain 2Cell Signaling Technology3671s
NameCompanyCatalog NumberComments
Software
MatlabMathWorksR2016A
ImageJNIH1.52g

References

  1. Menasche, P., et al. Towards a clinical use of human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors: a translational experience. European Heart Journal. 36 (12), 743-750 (2015).
  2. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
  3. Frisch, S. M., Francis, H. Disruption of epithelial cell-matrix interactions induces apoptosis. Journal of Cell Biology. 124 (4), 619-626 (1994).
  4. Haun, F., et al. Identification of a novel anoikis signalling pathway using the fungal virulence factor gliotoxin. Nature Communications. 9 (1), 3524 (2018).
  5. Ohashi, K., et al. Rho-associated kinase ROCK activates LIM-kinase 1 by phosphorylation at threonine 508 within the activation loop. Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3577-3582 (2000).
  6. Katoh, K., Kano, Y., Noda, Y. Rho-associated kinase-dependent contraction of stress fibres and the organization of focal adhesions. Journal of The Royal Society Interface. 8 (56), 305-311 (2011).
  7. Paoli, P., Giannoni, E., Chiarugi, P. Anoikis molecular pathways and its role in cancer progression. Biochimica et Biophysica Acta. 1833 (12), 3481-3498 (2013).
  8. Legate, K. R., Fassler, R. Mechanisms that regulate adaptor binding to beta-integrin cytoplasmic tails. Journal of Cell Science. 122 (Pt 2), 187-198 (2009).
  9. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
  10. Emre, N., et al. The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers. PLoS One. 5 (8), e12148 (2010).
  11. Ni, Y., Qin, Y., Fang, Z., Zhang, Z. ROCK Inhibitor Y-27632 Promotes Human Retinal Pigment Epithelium Survival by Altering Cellular Biomechanical Properties. Current Molecular Medicine. 17 (9), 637-646 (2017).
  12. Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature Biotechnology. 25 (9), 1015-1024 (2007).
  13. Zhu, W., Zhao, M., Mattapally, S., Chen, S., Zhang, J. CCND2 Overexpression Enhances the Regenerative Potency of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Remuscularization of Injured Ventricle. Circulation Research. 122 (1), 88-96 (2018).
  14. Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
  15. Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
  16. Tohyama, S., et al. Glutamine Oxidation Is Indispensable for Survival of Human Pluripotent Stem Cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
  17. Ong, S. G., et al. Microfluidic Single-Cell Analysis of Transplanted Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes After Acute Myocardial Infarction. Circulation. 132 (8), 762-771 (2015).
  18. Zhao, M., et al. Y-27632 Preconditioning Enhances Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes in Myocardial Infarction Mice. Cardiovascular Research. , (2018).
  19. Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
  20. Silginer, M., Weller, M., Ziegler, U., Roth, P. Integrin inhibition promotes atypical anoikis in glioma cells. Cell Death & Disease. 5, e1012 (2014).
  21. Lelievre, E. C., et al. N-cadherin mediates neuronal cell survival through Bim down-regulation. PLoS One. 7 (3), e33206 (2012).
  22. Murata, K., et al. Increase in cell motility by carbon ion irradiation via the Rho signaling pathway and its inhibition by the ROCK inhibitor Y-27632 in lung adenocarcinoma A549 cells. Journal of Radiation Research. 55 (4), 658-664 (2014).
  23. Srivastava, K., Shao, B., Bayraktutan, U. PKC-beta exacerbates in vitro brain barrier damage in hyperglycemic settings via regulation of RhoA/Rho-kinase/MLC2 pathway. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (12), 1928-1936 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

149

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved