Mejorar el injerto de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por el hombre a través de una inhibición transitoria de la actividad de Rho Kinase

Resumen

En este protocolo, demostramos y profundizamos en cómo utilizar células madre pluripotentes inducidas por el hombre para la diferenciación y purificación de cardiomiocitos, y más adelante, sobre cómo mejorar su eficiencia de trasplante con inhibidor de la proteína quinasa asociada a Rho pretratamiento en un modelo de infarto de miocardio de ratón.

Resumen

Un factor crucial en la mejora de la eficacia de la terapia celular para la regeneración miocárdica es aumentar de forma segura y eficiente la tasa de injerto celular. Y-27632 es un inhibidor muy potente de Rho-asociado, bobina enrollada-que contiene proteína quinasa (RhoA/ROCK) y se utiliza para prevenir la disociación inducida por la apoptosis celular (anoikis). Demostramos que el pretratamiento Y-27632 para cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por el hombre (hiPSC-MC^+RI)antes de la implantación da como resultado una mejora de la tasa de injerto celular en un modelo de ratón de infarto agudo de miocardio (MI). Aquí, describimos un procedimiento completo de diferenciación hiPSC-CM, purificación y pretratamiento celular con Y-27632, así como la contracción celular resultante, mediciones transitorias de calcio y trasplante en modelos MI de ratón. El método propuesto proporciona un método simple, seguro, eficaz y de bajo costo que aumenta significativamente la tasa de injerto celular. Este método no sólo puede utilizarse junto con otros métodos para mejorar aún más la eficiencia del trasplante de células, sino que también proporciona una base favorable para el estudio de los mecanismos de otras enfermedades cardíacas.

Introducción

Las terapias basadas en células madre han demostrado un potencial considerable como tratamiento para el daño cardíaco causado por MI¹. El uso de hiPSC diferenciados proporciona una fuente inagotable de hiPSC-CP2 y abre la puerta al rápido desarrollo de tratamientos innovadores. Sin embargo, siguen existiendo muchas limitaciones a la traducción terapéutica, incluido el desafío de la tasa de injerto severamente baja de las células implantadas.

La disociación de células con trippsina inicia anoikis³, que sólo se acelera una vez que estas células se inyectan en ambientes hostiles como el miocardio isquémico, donde el ambiente hipóxico acelera el curso hacia la muerte celular. De las células restantes, una gran proporción se lava desde el sitio de implantación en el torrente sanguíneo y se extiende por toda la periferia. Una de las vías apoptoticas clave es la vía RhoA/ROCK⁴. Basado en investigaciones previas, la vía RhoA/ROCK regula la organización citoesquelética actina^5,6, que es responsable de la disfunción celular^7,8. El inhibidor DE ROCK Y-27632 es ampliamente utilizado durante la disociación somática y de célulasmadre y el passaging, para aumentar la adhesión celular y reducir la apoptosis celular 9,^10,11. En este estudio, Y-27632 se utiliza para tratar hiPSC-CM antes del trasplante en un intento de aumentar la tasa de injerto celular.

Se han establecido varios métodos destinados a mejorar la tasa de injerto celular, como el choque térmico y el recubrimiento de matriz de membrana de sótano^12. Aparte de estos métodos, la tecnología genética también puede promover la proliferación de cardiomiocitos¹³ o revertir las células no miocárdicas en cardiomiocitos^14. Desde la perspectiva de la bioingeniería, los cardiomiocitos se asintan en un andamio biomaterial para mejorar la eficiencia del trasplante^15. Desafortunadamente, la mayoría de estos métodos son complicados y costosos. Por el contrario, el método propuesto aquí es simple, rentable y eficaz, y se puede utilizar como tratamiento basal antes del trasplante, así como en conjugación con otras tecnologías.

Protocolo

Todos los procedimientos animales en este estudio fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Alabama en Birmingham y se basaron en los Institutos Nacionales de Guías de Cuidado y Uso de Animales del Laboratorio de Salud (NIH Publication No 85-23).

1. Preparación de medios de cultivo y placas de cultura

1. Preparación media
   1. Para el medio hiPSC, mezclar 400 mL de célula madre pluripotente humana (hPSC) medio basal (Tablade Materiales 1) y 100 mL de suplemento hPSC 5x; almacenar la mezcla a 4oC.
   2. Para RPMI 1640/B27 menos medio de insulina (RB-), mezclar 500 ml de RPMI 1640 y 10 mL de suplemento B27 menos insulina.
   3. Para rpmI 1640/B27 (RB+) medio, mezclar 500 ml de RPMI 1640, 10 mL de suplemento B27, y 5 mL de penicilina-estreptomicina (pen-strep) antibiótico.
   4. Para el medio de purificación¹⁶, mezclar 500 ml de RPMI sin glucosa 1640, 10 ml de suplemento B27, 5 ml de antibiótico de pluma-estreptococo, y 1.000 ml de solución de DL-lactato de sodio (a una concentración final de 4 mM).
   5. Para la solución neutralizante, mezcle 200 ml de RPMI 1640, 50 ml de suero bovino fetal (FBS), 2,5 ml de antibiótico de pluma y estreptococo y 50 ml de Y-27632 (a una concentración final de 10 m).
   6. Para medio de congelación, mezcle 9 ml de FBS, 1 ml de sulfóxido de dimetil (DMSO) y 10 ml de Y-27632 (a una concentración final de 10 m).
   7. Para la solución de matriz extracelular (EMS), descongelar la matriz extracelular concentrada (Tablade Materiales 1) a 4 oC hasta que haya alcanzado un estado líquido uniformemente consistente. Preenfriar las puntas y tubos de la pipeta antes de hacer alícuotas de matriz de 350 ol cada una en hielo, y almacenar las alícuotas a -20 oC. Antes de recubrir las placas, diluir una alícuota descongelada en 24 ml de medio DMEM/F12 helado (EMS); mantener el SME en 4 oC durante un máximo de 2 semanas.
      NOTA: Realice todos los pasos de recubrimiento en hielo para evitar la solidificación de la matriz de membrana del sótano.
   8. Para la solución de Tyrode, tome el 90% del volumen final requerido de agua de grado de cultivo tisular, agregue la cantidad adecuada de los siguientes reactivos y revuelva hasta que se disuelva. A continuación, utilice 1 NNaOH para ajustar el pH a 7.4. Añadir agua extra a una concentración final de cloruro de sodio de 140 mmol/L, cloruro de magnesio de 1 mmol/L, HEPES de 10 mmol/L, cloruro de potasio de 5 mmol/L, glucosa de 10 mmol/L y cloruro de calcio de 1,8 mmol/L. Esterilizar por filtración, utilizando una membrana de 0,22 m.
2. Recubrimiento de placas de cultivo celular
   1. Para placas de cultivo hiPSC, aplicar 1 ml de EMS a cada pocal de una placa de 6 pocillos e incubar la placa durante al menos 1 h a 37 oC. Aspirar la solución DMEM/F12 antes de la sembración de células.
   2. Para el recubrimiento de gelatina, disolver 0,2 g de gelatina en polvo en agua de grado de cultivo tisular para hacer una solución de 0,2% (p/v). Esterilizar mediante autoclave a 121oC, 15 psi durante 30 min. Cubrir cada pocil de una placa de 6 pocillos con 2 ml de la solución e incubar durante 1 h a 37oC. Antes de pasar las células, aspirar la solución y dejar que la placa se seque durante al menos 1 h a temperatura ambiente dentro de la campana de cultivo de tejido.

2. Mantenimiento de hiPSC y diferenciación de cardiomiocitos

1. Cultivo de los hiPSC en medio hiPSC (ver paso 1.1.1) con un cambio medio diario hasta que las células alcancen 80%–90% de confluencia por pozo.
   NOTA: Para fines de mantenimiento, los hiPSC generalmente están listos para el paso cada 4 días.
2. Para pasar hiPSCs, aspirar el medio y lavar el pozo 1x con 1x salina con fosfato (PBS). Añadir 0,5 ml de solución de desprendimiento de células madre (Tablade materiales 1) a cada poca y incubar a 37 oC durante 5-7 min.
   NOTA: El tiempo de incubación depende de la densidad de las células y de la tasa de disociación, que se puede observar bajo un microscopio.
3. Neutralizar la solución de desprendimiento de células madre con 1 ml de medio hiPSC complementado con 5 M Y-27632. Recoger la mezcla en un tubo centrífugo de 15 ml. Centrifugar el tubo durante 5 min a 200 x g, aspirar el sobrenadante sin perturbar el pellet celular, y luego, resuspender las células en 1 ml de medio hiPSC que contiene 5 M Y-27632.
4. Sofitee los hiPSC en una nueva placa de 6 pocillos recubierta de EMS en una relación entre 1:6 y 1:18. Cambie el medio a medio hiPSC sin Y27632 después de las 24 h.
5. Para congelar las células, resuspenda los hiPSC disociados en medio de congelación a una concentración de 0,5–1 millones/500 l, coloque la suspensión en crioviales y guárdelas en un congelador de -80 oC. Transfiera los viales congelados a nitrógeno líquido después de 24 h.
6. Para diferenciar, sustituya el medio hiPSC por 2 ml de medio RB- complementado con 10 m de inhibidor de GSK-3 ( inhibidor CHIR99021 (CHIR) en 80%–90% de confluencia celular. Sustituya el medio por 3 ml de medio RB después de 24 h e incubar durante 48 h adicionales (día 3).
7. En el día 3, cambie el medio a 3 ml de rb-medio con 10 M Wnt inhibidor IWR1 durante 48 h (día 5), y luego reemplace el medio con 3 ml de RB- medio y manténgalo durante 48 h (día 7).
8. En el día 7, sustituya el medio por 3 ml de medio RB y cambie el medio cada 3 días en el futuro. Se deben observar golpes espontáneos de hiPSC-CP entre los días 7–10.

3. Purificación de hiPSC-CMs y pretratamiento de moléculas pequeñas

NOTA: Se utilizaron enzimas de disociación celular altamente purificadas y recombinantes (Tablade Materiales1) para disociar hiPSC-CP.

1. El día 21 después de la diferenciación hiPSC-CM, aspirar el medio y lavar las células 1x con PBS estéril. Incubar las células con 0,5 ml de enzimas de disociación celular por pozo durante 5-7 min a 37 oC. Pipetear repetidamente la suspensión celular utilizando una pipeta de 1 ml para disociar completamente las células.
2. Después de disociar las células, añadir 1 ml de solución neutralizante a cada pocil, recoger la mezcla celular en un tubo centrífugo de 15 ml y centrifugar a 200 x g durante 3 min. Deseche el sobrenadante y resuspenda las células en una solución neutralizante.
3. Replantar las células en placas de 6 pocillos recubiertas de gelatina a una densidad de 2 millones de células por pozo.
4. Después de 24–48 h, reemplace el medio de cultivo por medio de purificación durante 3-5 días.
   NOTA: La purificación se completa cuando más del 90% de las células en cada campo de visión del microscopio están latiendo. Para evitar más daños a los cardiomiocitos, no extienda la duración de la purificación más allá de 5 días. Si la primera ronda no produce la pureza necesaria, sustituya el medio de purificación por el medio RB+ durante 1 día y, a continuación, complete una segunda ronda de purificación.
5. Antes del trasplante, el cultivo de las células en el grupo de tratamiento durante 12 h en medio RB+ complementado con 10 M Y-27632. Del mismo modo, realizar tratamiento con verapamilo en las células del medio RB+ con 1 m de verapamilo durante 12 h (hiPSC-CP^+VER).
6. Después del tratamiento, lavar los HIPSC-CMs 1x con PBS e incubar las células con 0,5 ml de enzimas de disociación celular por pozo durante un máximo de 2 min. Pipeteo repetidamente la suspensión celular, utilizando una pipeta de 1 ml, para disociar completamente las células. Neutralizar las células con solución neutralizante, recoger la mezcla celular en un tubo centrífugo de 15 ml y centrifugar a 200 x g durante 3 min. Resuspender las células en PBS a una concentración de 0,1 millones de células/5 ml en preparación para la inyección.

4. Infarto de miocardio y trasplante celular

NOTA: Todos los instrumentos quirúrgicos se preesterilizan con autoclave y se mantienen en condiciones asépticas durante múltiples cirugías a través de un esterilizador de cuentas calientes (Tablade materiales 2).

1. Anestetizar ratones NOD/scid (Tablade Materiales 2) con isoflurano inhalado (1,5%–2%). Supervise los niveles de anestesia mediante las respuestas de los ratones a un pellizco del dedo del dedo del dedo del sol. Coloque la pomada óptica de la venta en los ojos para evitar que se sequen durante la cirugía.
2. Suministro por vía subcutánea de 0,1 mg/kg de buprenorfina por vía subcutánea para el tratamiento del dolor antes de la cirugía.
3. Coloque y asegure el ratón en posición supina sobre una mesa de operación calentada, retire el cabello de la región del cuello ventral y el tórax izquierdo usando una crema depilatoria, exponga la piel y desinfecte con 70% de alcohol.
4. Cortar una incisión de 0,5 cm en el centro del cuello con tijeras quirúrgicas, separar la grasa subcutánea con fórceps estériles y exponer la tráquea. Introducir oralmente la cánula de intubación en la tráquea, conectar la cánula a un respirador animal pequeño y ajustar los ajustes de ventilación (establecer el volumen de marea en 100-150 l y la velocidad de respiración en 100x–150x por min).
5. Después de que el ratón se estabilice, corte una incisión de 0,5 cm en el centro de la piel del pecho izquierdo. Utilice fórceps para separar sin rodeos la capa muscular y hacer una pequeña incisión en el quinto espacio intercostal para exponer la cavidad torácica. Coloque el retractor en la incisión para abrir la cavidad torácica y localizar la arteria coronaria descendente izquierda (LAD). Bajo un microscopio quirúrgico disección, ligar el LAD con un 8-0 sutura inabsorbible.
6. Inmediatamente después de la inducción de MI, inyectar 5 l de hiPSC-CP^-RI, hiPSC-CP^+RI, hiPSC-CP^-VER, hiPSC-CP^+VER,o un volumen igual de PBS en el miocardio del ratón en cada sitio (3 x 10⁵ celdas/animal, 1 x 10⁵ células/sitio), una en el área del infarto y dos en las áreas alrededor del infarto.
   NOTA: Dado que 5 l es un volumen muy pequeño, no es fácil controlar con precisión el volumen succionándolo directamente con una jeringa. La tapa de una placa estéril de Petri se puede girar, y 5 l de las células se pueden depositar primero en la tapa con una pipeta. Debido a la tensión superficial, no se extenderá, sino que se condensará en una pequeña masa líquida. Esto se puede absorber e inyectar fácilmente en el miocardio del ratón.
7. Elimine el aire residual en la cavidad torácica llenándolo con solución salina isotónica caliente. Coser las costillas, los músculos y la piel en secuencia con una sutura absorbible 6-0. Apague la inyección de anestesia con isoflurano. Mantenga a los animales de cirugía en la almohadilla de calentamiento y observen de cerca mientras recuperan la plena conciencia. Luego, coloque a los animales en una jaula limpia. No devuelva los animales a la compañía de otros animales hasta que estén completamente recuperados.
8. Después de la cirugía, inyectar a los ratones por vía intraperitoneal con buprenorfina (0,1 mg/kg) cada 12 h durante 3 días consecutivos e inyectarles ibuprofeno (5 mg/kg) cada 12 h durante un día. Realice estudios de análisis posteriores en puntos de tiempo especificados.
   NOTA: Siga las pautas de su comité local de cuidado de animales para la analgesia.

5. Grabación transitoria y contractilidad del calcio

1. Autoclave cubiertas de 15 mm de diámetrolips (Tablade Materiales 2) y pinzas en un vaso de vidrio pequeño a 121 oC, 15 psi durante 15 min. Preenfríe los labios de las cubiertas y pinzas a 4 oC.
2. Con las pinzas, coloque el cubreobjetos en una placa de 12 pocillos y una pipeta de 300 ml de matriz extracelular en cada cubreobjetos.
   NOTA: No deje que la matriz exceda el borde de la cubierta para evitar la reducción de la cantidad de recubrimiento de la matriz. Incubar la placa de 12 pocillos en una incubadora de cultivo celular de 37oC durante 1 h.
3. Aspirar el medio en la placa de 6 pocillos recubierto de gelatina con hiPSC-CP purificados, lavarlo 1x con PBS, y luego digerirlo con 0,5 ml de enzimas de disociación celular durante 1,5 min. Añadir 1 ml de solución neutralizadora, pipeta repetidamente para no más de 5x–10x con una pipeta de 1 ml , y centrifugar la mezcla a 200 x g durante 3 min.
4. Aspirar la matriz extracelular recubierta de los labios de las cubiertas. Cuente el número de celda y resuspenda las células de la solución neutralizante a una concentración de 40.000/300 l, y luego agregue 300 s de la suspensión celular a cada cubreobjetos. Cultivar la placa en una incubadora de 37oC.
5. Después de 24 h, aspirar suavemente la solución neutralizada, añadir 500 ml de medio RB+ a cada pocal de la placa, y continuar a cultivar durante 2 días.
6. Añadir Y-27632 (10 m), activador Rho quinasa (RA, 100 nM), verapamilo (1 m), o un volumen igual de PBS en el medio de cultivo de los CPDe, 12 h antes de que el calcio sea transitorio y la detección de contractilidad.
   NOTA: Además de la detección del calcio transitorio de las células y la contractilidad después de 12 h de tratamiento químico, la detección de estos parámetros también se probó a 12, 24, 48 y 72 h después de la retirada química.
7. Saque la placa, deseche el medio y lave la placa 1x con PBS. Cambiar el medio a un DMEM libre de fenol-rojo que contenga 0,02% (p/v) de poliol tensioactivo (Tablade materiales 1), indicador de calcio de 5 m (Tablade materiales 1), y el correspondiente Y-27632 (10 m), RA (100 nM), verapamilo (1 m) o un volumen igual de PBS, e incubar la placa durante 30 min a 37 oC.
8. Deseche el sobrenadante, lave las células 3veces con medio DMEM sin tinte y deje reposar el medio durante 30 minutos para desestalificar el tinte cartográfico.
9. Coloque la cubierta de la célula en una cámara de baño abierta e inserte la cámara en un sistema de microincubación equilibrado a 37 oC con un controlador automático de temperatura (Tablade materiales 2perfus), einsertarla con la solución de Tyrode, y añadir continuamente Inhibidor de Rho quinasa (RI), RA, o PBS a la solución de perfusión.
10. Utilice un microscopio de fluorescencia invertida (Tablade materiales 2) y un cabezal de escaneo láser (Tablade materiales 2) para registrar un transitorio espontáneo de calcio mediante el uso de un escáner de línea x-t, utilizando un láser de argón de 488 nm para excitación de tinte y un 515 x 10 nm filtro de barrera para recoger la luz de emisión. Registrar la contracción espontánea de hiPSC-CM utilizando la funcionalidad de contraste de interferencia diferencial del microscopio confocal (Tablade materiales 2).
    NOTA: Las grabaciones transitorias de calcio se procesaron y analizaron utilizando el software MATLAB R2016A (Tablade materiales 4). Los ensayos de cambio de contracción celular se realizaron utilizando el software ImageJ (Tablade materiales 4).

Resultados

Los hiPSC-CM utilizados en este estudio se derivaron de origen humano con el gen reportero de luciferasa; por lo tanto, la tasa de supervivencia de las células trasplantadas in vivo se detectó mediante imágenes de bioluminiscencia (BLI)¹⁷ (Figura 1A,B). Para las secciones histológicas del corazón, las células dobles positivas de la troponina cardíaca T (hcTnT) y del antígeno nuclear humano (HNA) se clasificaron...

Discusión

Los pasos clave de este estudio incluyen la obtención de hiPSC-CM puros, la mejora de la actividad de los hiPSC-CM a través del pretratamiento Y-27632 y, por último, el trasplante de una cantidad precisa de hiPSC-CM en un modelo de MI de ratón.

Las cuestiones clave que se abordaron aquí fueron que, en primer lugar, optimizamos los métodos de purificación sin glucosa¹⁹ y establecimos un novedoso sistema de purificación eficiente. El procedimiento del sistema incl...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Accutase (stem cell detachment solution)	STEMCELL Technologies	#07920
B27 minus insulin	Fisher Scientific	A1895601
B27 Supplement	Fisher Scientific	17-504-044
CHIR99021	Stem Cell Technologies	72054
DMEM (1x), high glucose, HEPES, no phenol red	Thermofisher	20163029
Fetal bovine serum	Atlanta Biologicals	S11150
Fluo-4 AM (calcium indicator)	Invitrogen/Thermofisher	F14201
Glucose-free RPMI 1640	Fisher Scientific	11879020
IWR1	Stem Cell Technologies	72562
Matrigel (extracellular matrix )	Fisher Scientific	CB-40230C
mTeSR (human pluripotent stem cells medium)	STEMCELL Technologies	85850
Pen-strep antibiotic	Fisher Scientific	15-140-122
Pluronic F-127 (surfactant polyol)	Sigma-Aldrich	P2443
Rho activator II	Cytoskeleton	CN03
RPMI1640	Fisher Scientific	11875119
Sodium DL-lactate	Sigma-Aldrich	L4263
TrypLE (cell-dissociation enzymes)	Fisher Scientific	12-605-010
Verapamil	Sigma-Aldrich	V4629
Y-27632	STEMCELL Technologies	72304
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment and Supplies
IVIS Lumina III Bioluminescence Instruments	PerkinElmer	CLS136334
15 mm Coverslips	Warner	CS-15R15
Centrifuge	Eppendorf	5415R
Confocal Microscope	Olympus	IX81
Cryostat	Thermo Scientific	NX50
Dual Automatic Temperature Controller	Warner Instruments	TC-344B
Electrophoresis Power Supply	BIO-RAD	1645050
Fluoresence Microscope	Olympus	IX83
High Speed Camera	pco	1200 s
Laser Scan Head	Olympus	FV-1000
Low Profile Open Bath Chamber (mounts into above microincubation system)	Warner Instruments	RC-42LP
Microincubation System	Warner Instruments	DH-40iL
Minivent Mouse Ventilator	Harvard Apparatus	845
NOD/SCID mice	Jackson Laboratory	001303
Precast Protein Gels	BIO-RAD	4561033
PVDF Transfer Packs	BIO-RAD	1704156
Trans-Blot System	BIO-RAD	Trans-Blot Turbo
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody
Anti-human Nucleolin (Alexa Fluor 647)	Abcam	ab198580
Cardiac Troponin T	R&D Systems	MAB1874
Cardiac Troponin C	Abcam	ab137130
Cardiac Troponin I	Abcam	ab47003
Cy5-donkey anti-mouse	Jackson ImmunoResearch Laboratory	715-175-150
Cy3-donkey anti-rabbit	Jackson ImmunoResearch Laboratory	711-165-152
Fitc-donkey anti-mouse	Jackson ImmunoResearch Laboratory	715-095-150
GAPDH	Abcam	ab22555
Human Cardiac Troponin T	Abcam	ab91605
Integrin β1	Abcam	ab24693
Ki67	EMD Millipore	ab9260
N-cadherin	Abcam	ab18203
Phospho-Myosin Light Chain 2	Cell Signaling Technology	3671s
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Matlab	MathWorks	R2016A
ImageJ	NIH	1.52g