JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этом протоколе мы демонстрируем и подробно о том, как использовать искусственные плюрипотентные стволовые клетки человека для диффериоцитной дифференциации и очистки, и далее, о том, как улучшить его эффективность трансплантации с ингибитором родо-синазы, связанных с Ро-ассоциированным предварительной обработки в модели инфаркта миокарда мыши.

Аннотация

Решающим фактором в повышении эффективности клеточной терапии для регенерации миокарда является безопасное и эффективное увеличение скорости прививок клеток. Y-27632 является очень мощным ингибитором Rho-связанных, скручивания,содержащих белок киназы (RhoA/ ROCK) и используется для предотвращения диссоциации индуцированной клеточной апоптозы (anoikis). Мы демонстрируем, что Y-27632 предлечения для человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных кардиомиоцитов (hiPSC-CMsЗРИ) до имплантации приводит к улучшению скорости клеток при в мышиной модели острого инфаркта миокарда (MI). Здесь мы описываем полную процедуру дифференциации hiPSC-CMs, очищения и клеточной предобработки с помощью Y-27632, а также результирующее сокращение клеток, временные измерения кальция и трансплантацию в мышиные модели MI. Предлагаемый метод обеспечивает простой, безопасный, эффективный и недорогой метод, который значительно увеличивает скорость прививок клеток. Этот метод не может быть использован только в сочетании с другими методами для дальнейшего повышения эффективности трансплантации клеток, но и обеспечивает благоприятную основу для изучения механизмов других сердечных заболеваний.

Введение

Стволовые клетки на основе терапии показали значительный потенциал в качестве лечения сердечного повреждения, вызванного MI1. Использование дифференцированных HIPSCs обеспечивает неисчерпаемый источник hiPSC-CMs2 и открывает двери для быстрого развития прорыв лечения. Тем не менее, многие ограничения на терапевтический перевод остаются, в том числе проблема сильно низкой скорости прививок имплантированных клеток.

Диссоциирующая клетка с трипсином инициирует anoikis3, который только ускоряется, как только эти клетки вводят сявок в суровые среды, такие как ишемический миокард, где гипоксическая среда ускоряет курс к смерти клеток. Из оставшихся клеток значительная часть вымывается из места имплантации в кровоток и распространяется по всей периферии. Одним из ключевых апоптотических путей является путьRhoA/ROCK 4. Основываясь на предыдущих исследованиях, RhoA / ROCK путь регулирует актина цитоскелетной организации5,6, который отвечает за дисфункцию клеток7,8. Ингибитор ROCK Y-27632 широко используется при соматической и стволовой клетке диссоциации и прохода, чтобы увеличить слипания клеток и уменьшить апоптоз клеток9,10,11. В этом исследовании, Y-27632 используется для лечения hiPSC-CMs до трансплантации в попытке увеличить скорость прививования клеток.

Было установлено несколько методов, направленных на улучшение скорости прививок клеток, таких как тепловой шок и мембранное матримальное покрытие подвала12. Помимо этих методов, генетические технологии могут также способствовать пролиферации кардиомиоцитов13 или обратить вспять немиокардиальные клетки в кардиомиоциты14. С точки зрения биоинженерии, кардиомиоциты посеяны на биоматериал эшафот для повышения эффективности трансплантации15. К сожалению, большинство из этих методов являются сложными и дорогостоящими. Напротив, предложенный здесь метод прост, экономичен и эффективен, и его можно использовать как базальное лечение до трансплантации, так и в спряжении с другими технологиями.

протокол

Все процедуры для животных в этом исследовании были одобрены Институциональным Комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) Университета Алабамы в Бирмингеме и были основаны на Национальных институтах здравоохранения лабораторных животных уход и использование Руководящих принципов (NIH Публикация Нет 85-23).

1. Подготовка культурных медиа- и культурных плит

  1. Средняя подготовка
    1. Для hiPSC среды, смешать 400 мл человека плюрипотентных стволовых клеток (hPSC) базальной среде(Таблица материалов 1) и 100 мл hPSC 5x дополнения; хранить смесь при 4 градусах По Цельсию.
    2. Для RPMI 1640/B27 минус инсулин (RB-) средний, смесь 500 мл RPMI 1640 и 10 мл B27 дополнения минус инсулин.
    3. Для RPMI 1640/B27 (RB) среднего, смесь 500 мл RPMI 1640, 10 мл B27 дополнения, и 5 мл пенициллина-стрептомицина (пер-стреп), антибиотик.
    4. Для очистки среднего16, смешать 500 мл без глюкозы RPMI 1640, 10 мл B27 дополнения, 5 мл пера-стрептококк антибиотика, и 1000 л натрия DL-лактата раствора (при окончательной концентрации 4 мМ).
    5. Для нейтрализации раствора смешайте 200 мл RPMI 1640, 50 мл сыворотки плода (FBS), 2,5 мл антибиотика перстреп-стрептококка и 50 л Y-27632 (при конечной концентрации 10 мкм).
    6. Для замораживания среды, смешать 9 мл FBS, 1 мл диметилсульксида (DMSO), и 10 л Y-27632 (при окончательной концентрации 10 мкм).
    7. Для внеклеточного матричного раствора (EMS) оттепель концентрированная внеклеточная матрица(Таблица материалов 1) при 4 градусах Цельсия до тех пор, пока она не достигнет равномерно согласованного жидкого состояния. Precool пипетки советы и трубки до принятия матрицы aliquots по 350 л каждый на льду, и хранить aliquots на -20 градусов по Цельсию. Перед покрытием пластинразите один оттаяв в 24 мл ледяной среды DMEM/F12 (EMS); держать EMS в 4 градусах Цельсия в течение 2 недель.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все шаги покрытия на льду, чтобы предотвратить затвердевание мембранной матрицы подвала.
    8. Для раствора Tyrode, принять 90% от конечного необходимого объема воды культуры ткани, добавить соответствующее количество следующих реагентов, и перемешать до растворения. Затем используйте 1 N NaOH, чтобы настроить рН до 7,4. Добавьте дополнительную воду к конечной концентрации 140 ммоль/л хлорида натрия, 1 ммоль/л хлорида магния, 10 ммоль/L HEPES, 5 ммоль/л хлористого калия, 10 ммоль/л глюкозы и 1,8 ммоль/л хлорида кальция. Стерилизовать путем фильтрации, используя мембрану 0,22 мкм.
  2. Покрытие плиты культуры клетки
    1. Для плит культуры hiPSC, принесите 1 mL EMS к каждому колодцу пластины 6-наилучшим образом и инкубировать плиту для по крайней мере 1 h на 37 c. Аспирируя раствор DMEM/F12 перед посевными клетками.
    2. Для желатина покрытие, растворить 0,2 г желатина порошок в ткани культуры класса воды, чтобы сделать 0,2% (w/v) раствор. Стерилизовать путем автоклавирования при 121 кв с, 15 пси в течение 30 мин. Пальто каждый из 6-колодец пластины с 2 мл раствора и инкубировать в течение 1 ч при 37 градусов по Цельсию. Перед прохождением клеток, аспирировать раствор и дайте пластине высохнуть, по крайней мере 1 ч при комнатной температуре внутри ткани культуры капота.

2. HiPSC обслуживание и КардиомиоцитНая Дифферициация

  1. Культура hiPSCs в среде hiPSC (см. шаг 1.1.1) с ежедневным средним изменением до тех пор пока клетки не достигнут 80%-90% слив в наилучшим образом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для целей технического обслуживания, hiPSCs, как правило, готовы к прохождению каждые 4 дня.
  2. Для прохождения hiPSCs, аспирировать среду и мыть хорошо 1x с 1x фосфат-буфера сольник (PBS). Добавьте 0,5 мл раствора отслоения стволовых клеток(Таблица Материалов1) к каждой скважине и инкубировать при 37 градусах По 5–7 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации зависит от плотности клеток и скорости диссоциации, которую можно наблюдать под микроскопом.
  3. Нейтрализуйте раствор отслоения стволовых клеток с 1 мл среды hiPSC, дополненной 5 МКм Y-27632. Соберите смесь в 15 мл центрифуги трубки. Centrifuge трубки в течение 5 минут при 200 х г, аспирируйте супернатант, не нарушая клеточной гранулы, а затем, resuspend клетки в 1 мл среды hiPSC, содержащей 5 мКМ Y-27632.
  4. Семя hiPSCs на новый EMS покрытием 6-колодная пластина в соотношении между 1:6 до 1:18. Измените среду на среду hiPSC без Y27632 после 24 ч.
  5. Чтобы заморозить клетки, повторно приостановить диссоциированные hiPSCs в замораживании среды в концентрации 0,5-1 млн/500 qL, поместите подвеску в криовиалы, и хранить их в морозильной камере -80 градусов. Перенесите замороженные флаконы в жидкий азот через 24 ч.
  6. Чтобы дифференцировать, замените среду hiPSC 2 мл RB-среднего, дополненного ингибитором 10 ММ ГСК-3 , CHIR99021 (CHIR) при 80%-90% клеточном слиянии. Замените среду 3 мл РБ-среды после 24 ч и инкубировать еще на 48 ч (день 3).
  7. На 3-й день измените средний до 3 мл RB-среды с ингибитором IWR1 10 мкм на 48 ч (день 5), а затем замените среду на 3 мл РБ-среды и сохраняйте 48 ч (день 7).
  8. На 7-й день замените среду на 3 мл носителя и измените среду каждые 3 дня в будущем. Спонтанное избиение hiPSC-CMs следует наблюдать между днями 7-10.

3. чистка hiPSC-CMs и предобработка малых молекул

ПРИМЕЧАНИЕ: Высокоочищенные, рекомбинантные клеточные диссоциационные ферменты(Таблица Материалов 1) были использованы для диссоциации hiPSC-CMs.

  1. На 21 день после дифференциации hiPSC-CM, аспирируй среду и промойте клетки 1x со стерильным PBS. Инкубировать клетки с 0,5 мл клеточных диссоциационных ферментов на скважину в течение 5-7 мин при 37 градусах Цельсия. Неоднократно pipette клеточной подвески с помощью 1 мл пипетки для того, чтобы тщательно разъединить клетки.
  2. После того, как клетки будут разобщены, добавьте 1 мл нейтрализующего раствора к каждой скважине, соберите клеточную смесь в центрифужную трубку 15 мл и центрифугу при 200 х г в течение 3 мин. Отбросьте супернатант и отбросите клетки в нейтрализации раствора.
  3. Пересадите клетки на 6-пуговую пластину с покрытием, с плотностью 2 миллиона клеток на скважину.
  4. После 24-48 ч замените культурную среду на очищаемую среду на 3-5 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Очистка завершена, когда более 90% клеток в каждом поле обзора микроскопа бьются. Чтобы предотвратить дальнейшее повреждение кардиомиоцитов, не продлевайте срок очистки более чем на 5 дней. Если первый раунд не дает необходимой чистоты, замените среду очищения на среду РБЗ на 1 день, а затем завершите второй раунд очищения.
  5. До трансплантации, культура клеток в группе лечения для 12 ч в СРЕДе РБЗ дополнили 10 МКм Y-27632. Аналогичным образом, выполнять верапамил лечения на клетках в среде РБЗ с 1 мкм верапамил для 12 ч (hiPSC-CMsЗВЕР).
  6. После лечения промойте hiPSC-CMs 1x с PBS и инкубировать клетки с 0,5 мл клеточных диссоциационных ферментов на скважину в течение максимум 2 мин. Неоднократно пипетка клеточной подвески, используя 1 мл пипетку, чтобы тщательно разъединить клетки. Нейтрализуйте клетки нейтрализующим раствором, соберите клеточную смесь в центрифужную трубку 15 мл и центрифугу при 200 х г в течение 3 мин. Перенапрягайте клетки в ПБС в концентрации 0,1 млн клеток/5 л в рамках подготовки к инъекциям.

4. Инфаркт миокарда и трансплантация клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Все хирургические инструменты предварительно престерилизируется с автоклавом и поддерживаются в асептической состоянии во время нескольких операций через горячий стерилизатор из бисера(Таблица Материалов 2).

  1. Анестезия NOD/scid мышей (Таблица Материалов 2) с ингаляционным изофлюраном (1,5%-2%). Мониторинг уровня анестезии по реакции мышей на щепотку ног. Поместите ветеринар оптическую мазь на глаза, чтобы предотвратить их от высыхания во время операции.
  2. Поставка 0,1 мг/кг бупренорфин подкожно для управления болью до операции.
  3. Позиция и закрепите мышь в положении на спине на нагретом операционном столе, удалите волосы из области брюшной шеи и левой грудной клетки с помощью крема для депиляции, разоблачите кожу и дезинфицируют ее 70% алкоголя.
  4. Вырежьте 0,5 см разрез в центре шеи с помощью хирургических ножниц, отделить подкожный жир стерильными щипками, и разоблачить трахеи. Введите устно канюлю интубации в трахею, соедините канюлю с небольшим вентилятором животных и отрегулируйте настройки вентиляции (установите объем прилива на уровне 100–150 л и частоту дыхания в 100х-150x на мин).
  5. После того, как мышь стабилизируется, вырежьте 0,5 см разрез в середине левой кожи грудной клетки. Используйте щипцы, чтобы прямо отделить мышечный слой и сделать небольшой разрез в пятом межреберном пространстве, чтобы разоблачить грудную полость. Поместите втягивающий в разрез, чтобы открыть грудную полость и найти левую нисходящей коронарной артерии (LAD). Под рассекающим хирургическим микроскопом, ligate LAD с 8-0 неабсорбируемый шов.
  6. Сразу же после индукции MI, вводить 5 л hiPSC-CMs-RI, hiPSC-CMs,hiPSC-CMs-VER, hiPSC-CMsзВЕР, или равный объем PBS в миокард мыши на каждом участке (3 х 105 клеток / животных, 1 х 105 клетки/сайт), один в инфарктной области и два в районах вокруг инфаркта.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Так как 5 ЗЛ очень небольшой объем, это не легко точно контролировать объем, непосредственно сосание его со шприцем. Крышка стерильной чашки Петри может быть перевернута, и 5 л клеток можно сначала оседать на крышке пипеткой. Из-за поверхностного натяжения он не будет распространяться, а конденсируется в небольшую жидкую массу. Это может быть легко всасывается и вводят в миокард мыши.
  7. Устраните остаточный воздух в грудной полости, заполнив его теплым изотоническим сольственным раствором. Вышивать ребра, мышцы и кожу в последовательности с 6-0 поглощаемых шов. Выключите инъекцию изофларанской анестезии. Держите хирургии животных на грелке и внимательно наблюдать за ними, пока они находятся в полном сознании. Затем поместите животных в чистую клетку. Не возвращайте животных в компанию других животных до тех пор, пока они полностью не выздоровеют.
  8. После операции вводят мышам интраперитонеально бупренорфин (0,1 мг/кг) каждые 12 ч в течение 3 дней подряд и вводят им ибупрофен (5 мг/кг) каждые 12 ч в течение одного дня. Выполните последующие аналитические исследования в указанные временные точки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте вашим местным рекомендациям комитета по уходу за животными для обезболивающее.

5. Запись переходного и контрактного стыковки кальция

  1. Автоклав 15 мм-диаметр охватывает(Таблица материалов 2) и пинцет в небольшом стеклянном стакане при 121 кв.с. 15 пси в течение 15 мин. Precool крышки и пинцет при 4 c.
  2. Используя пинцет, поместите крышку в 12-ну хорошую пластину и пипетку 300 зл и внеклеточной матрицы на каждый coverslip.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте матрице превышать край крышки, чтобы предотвратить уменьшение количества матричного покрытия. Инкубировать 12-колодец пластины в 37 C кс культуры инкубатора для 1 ч.
  3. Аспирировать среду в желатиновой покрытием 6-наилучшим пластины с очищенной hiPSC-CMs, мыть его 1x с PBS, а затем переварить его с 0,5 мл клеточной диссоциации ферментов в течение 1,5 мин. Добавить 1 мл нейтрализации раствора, пипетка неоднократно не более 5x-10x с 1 мЛ пипетка , и центрифуга смесь на 200 х г в течение 3 мин.
  4. Аспирируй покрытую внеклеточной матрицей из чехлов. Подсчитайте номер ячейки и повторно подтяните клетки в нейтрализуя растворе до концентрации 40,000/300 qL, а затем добавьте 300 кЛ суспензии клетки на каждый coverslip. Культура пластины в инкубаторе 37 градусов по Цельсию.
  5. После 24 ч, осторожно аспирировать нейтрализованный раствор, добавить 500 л среды РБЗ к каждой скважине пластины, и продолжать культуру в течение 2 дней.
  6. Добавьте Y-27632 (10 мкм), активатор Ро киназы (РА, 100 нМ), верапамил (1 мкм), или равный объем PBS в культурную среду hiPSC-CMs, 12 ч до обнаружения переходного кальция и сократимости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В дополнение к обнаружению преходящего и сократителимости кальция клеток после 12 ч химической обработки, обнаружение этих параметров было также протестировано на 12, 24, 48 и 72 ч после химического вывода.
  7. Выньте пластины, отбросить среды, и мыть пластины 1x с PBS. Изменение среды на фенол-красный DMEM, содержащий 0,02% (w/v) сурфактантного полиола(Таблица Материалов 1), 5 МКм индикатор кальция (Таблица Материалов1), и соответствующий Y-27632 (10 мкм), РА (100 нм), верапамил (1 мкм), или равный объем PBS, и инкубировать пластину в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия.
  8. Откажитесь от супернатанта, вымойте клетки 3x с красителем свободной DMEM среды, и пусть средний отдых в течение 30 минут, чтобы де-эстерифицировать картографический краситель.
  9. Поместите посеянный клеткой coverslip в открытую камеру ванны и вставьте камеру в систему микроинкубации, уравновешленную до 37 градусов по Цельсию с автоматическим контроллером температуры(Таблица Материалов2), наполнить его раствором Tyrode, и постоянно добавлять Ингибитор родообразной (RI), РА, или PBS к перфузионному раствору.
  10. Используйте перевернутый флуоресценционный микроскоп(Таблица Материалов 2) и лазерное сканирование головы (Таблица Материалов 2) для записи спонтанного кальция переходных с помощью X-t сканирование линии, используя 488 нм аргона лазер для возбуждения красителя и 515 и 10 нм барьерный фильтр для сбора света выбросов. Запись спонтанного сокращения hiPSC-CMs с использованием дифференциального интерференции Контрастная функциональность конфокального микроскопа (Таблица материалов 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Переходные записи кальция были обработаны и проанализированы с помощью программного обеспечения MATLAB R2016A(Таблица Материалов 4). Анализы изменения клеток были выполнены с помощью программного обеспечения ImageJ(Таблица Материалов 4).

Результаты

HIPSC-CMs, используемые в этом исследовании, были получены из человеческого происхождения с геном репортера люциферазы; Таким образом, выживаемость пересаженных клеток in vivo была обнаружена с помощью биолюминесценционной визуализации (BLI)17 (рисуно?...

Обсуждение

Ключевыми шагами этого исследования являются получение чистого hiPSC-CMs, повышение активности hiPSC-CMs через предварительное лечение Y-27632 и, наконец, пересадка точного количества hiPSC-CMs в модель мыши MI.

Ключевые вопросы, которые были рассмотрены здесь, были в том, что, во-первых, ...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы благодарят д-ра Джозефа К. Ву (Стэнфордский университет) за любезное предоставление конструкции Fluc-GFP и д-ра Янвена Лю за отличную техническую помощь. Это исследование поддерживается Национальными институтами здравоохранения RO1 грантов HL95077, HL114120, HL131017, HL138023, UO1 HL134764 (до J. З.), и HL121206A1 (в Л.З.), и R56 грант 16SDG30410018, и Университет Алабамы в Бирмингеме факультета развития Грант (до В.З.).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagent
Accutase (stem cell detachment solution)STEMCELL Technologies#07920
B27 minus insulinFisher ScientificA1895601
B27 SupplementFisher Scientific17-504-044
CHIR99021Stem Cell Technologies72054
DMEM (1x), high glucose, HEPES, no phenol redThermofisher20163029
Fetal bovine serumAtlanta BiologicalsS11150
Fluo-4 AM (calcium indicator)Invitrogen/ThermofisherF14201
Glucose-free RPMI 1640Fisher Scientific11879020
IWR1Stem Cell Technologies72562
Matrigel (extracellular matrix )Fisher ScientificCB-40230C
mTeSR (human pluripotent stem cells medium)STEMCELL Technologies85850
Pen-strep antibioticFisher Scientific15-140-122
Pluronic F-127 (surfactant polyol)Sigma-AldrichP2443
Rho activator IICytoskeletonCN03
RPMI1640Fisher Scientific11875119
Sodium DL-lactateSigma-AldrichL4263
TrypLE (cell-dissociation enzymes)Fisher Scientific12-605-010
VerapamilSigma-AldrichV4629
Y-27632STEMCELL Technologies72304
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment and Supplies
IVIS Lumina III Bioluminescence InstrumentsPerkinElmerCLS136334
15 mm CoverslipsWarnerCS-15R15
CentrifugeEppendorf5415R
Confocal MicroscopeOlympusIX81
CryostatThermo ScientificNX50
Dual Automatic Temperature ControllerWarner InstrumentsTC-344B
Electrophoresis Power SupplyBIO-RAD1645050
Fluoresence MicroscopeOlympusIX83
High Speed Camerapco1200 s
Laser Scan HeadOlympusFV-1000
Low Profile Open Bath Chamber (mounts into above microincubation system)Warner InstrumentsRC-42LP
Microincubation SystemWarner InstrumentsDH-40iL
Minivent Mouse VentilatorHarvard Apparatus845
NOD/SCID miceJackson Laboratory001303
Precast Protein GelsBIO-RAD4561033
PVDF Transfer PacksBIO-RAD1704156
Trans-Blot SystemBIO-RADTrans-Blot Turbo
Hot bead sterilizerFine Science Tools18000-45
NameCompanyCatalog NumberComments
Antibody
Anti-human Nucleolin (Alexa Fluor 647)Abcamab198580
Cardiac Troponin TR&D SystemsMAB1874
Cardiac Troponin CAbcamab137130
Cardiac Troponin IAbcamab47003
Cy5-donkey anti-mouseJackson ImmunoResearch Laboratory715-175-150
Cy3-donkey anti-rabbitJackson ImmunoResearch Laboratory711-165-152
Fitc-donkey anti-mouseJackson ImmunoResearch Laboratory715-095-150
GAPDHAbcamab22555
Human Cardiac Troponin TAbcamab91605
Integrin β1Abcamab24693
Ki67EMD Milliporeab9260
N-cadherinAbcamab18203
Phospho-Myosin Light Chain 2Cell Signaling Technology3671s
NameCompanyCatalog NumberComments
Software
MatlabMathWorksR2016A
ImageJNIH1.52g

Ссылки

  1. Menasche, P., et al. Towards a clinical use of human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors: a translational experience. European Heart Journal. 36 (12), 743-750 (2015).
  2. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
  3. Frisch, S. M., Francis, H. Disruption of epithelial cell-matrix interactions induces apoptosis. Journal of Cell Biology. 124 (4), 619-626 (1994).
  4. Haun, F., et al. Identification of a novel anoikis signalling pathway using the fungal virulence factor gliotoxin. Nature Communications. 9 (1), 3524 (2018).
  5. Ohashi, K., et al. Rho-associated kinase ROCK activates LIM-kinase 1 by phosphorylation at threonine 508 within the activation loop. Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3577-3582 (2000).
  6. Katoh, K., Kano, Y., Noda, Y. Rho-associated kinase-dependent contraction of stress fibres and the organization of focal adhesions. Journal of The Royal Society Interface. 8 (56), 305-311 (2011).
  7. Paoli, P., Giannoni, E., Chiarugi, P. Anoikis molecular pathways and its role in cancer progression. Biochimica et Biophysica Acta. 1833 (12), 3481-3498 (2013).
  8. Legate, K. R., Fassler, R. Mechanisms that regulate adaptor binding to beta-integrin cytoplasmic tails. Journal of Cell Science. 122 (Pt 2), 187-198 (2009).
  9. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
  10. Emre, N., et al. The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers. PLoS One. 5 (8), e12148 (2010).
  11. Ni, Y., Qin, Y., Fang, Z., Zhang, Z. ROCK Inhibitor Y-27632 Promotes Human Retinal Pigment Epithelium Survival by Altering Cellular Biomechanical Properties. Current Molecular Medicine. 17 (9), 637-646 (2017).
  12. Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature Biotechnology. 25 (9), 1015-1024 (2007).
  13. Zhu, W., Zhao, M., Mattapally, S., Chen, S., Zhang, J. CCND2 Overexpression Enhances the Regenerative Potency of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Remuscularization of Injured Ventricle. Circulation Research. 122 (1), 88-96 (2018).
  14. Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
  15. Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
  16. Tohyama, S., et al. Glutamine Oxidation Is Indispensable for Survival of Human Pluripotent Stem Cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
  17. Ong, S. G., et al. Microfluidic Single-Cell Analysis of Transplanted Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes After Acute Myocardial Infarction. Circulation. 132 (8), 762-771 (2015).
  18. Zhao, M., et al. Y-27632 Preconditioning Enhances Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes in Myocardial Infarction Mice. Cardiovascular Research. , (2018).
  19. Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
  20. Silginer, M., Weller, M., Ziegler, U., Roth, P. Integrin inhibition promotes atypical anoikis in glioma cells. Cell Death & Disease. 5, e1012 (2014).
  21. Lelievre, E. C., et al. N-cadherin mediates neuronal cell survival through Bim down-regulation. PLoS One. 7 (3), e33206 (2012).
  22. Murata, K., et al. Increase in cell motility by carbon ion irradiation via the Rho signaling pathway and its inhibition by the ROCK inhibitor Y-27632 in lung adenocarcinoma A549 cells. Journal of Radiation Research. 55 (4), 658-664 (2014).
  23. Srivastava, K., Shao, B., Bayraktutan, U. PKC-beta exacerbates in vitro brain barrier damage in hyperglycemic settings via regulation of RhoA/Rho-kinase/MLC2 pathway. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (12), 1928-1936 (2013).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

149ROCK

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены