通过对Rho激酶活性的暂时抑制,增强人类诱导多能干细胞衍生心肌细胞的诱导

摘要

在该协议中,我们演示并阐述了如何使用人类诱导多能干细胞进行心肌细胞分化和纯化,并进一步说明如何利用Rho相关蛋白激酶抑制剂提高移植效率小鼠心肌梗死模型的预处理。

摘要

提高细胞治疗治疗对心肌再生的一个关键因素是安全有效地提高细胞移植率。Y-27632 是 Rho 相关、含线圈蛋白激酶 (RhoA/ROCK) 的强效抑制剂,用于防止分离引起的细胞凋亡(阿诺基斯)。我们证明,Y-27632在植入前对人类诱导多能干细胞衍生心肌细胞(hiPSC-CMs^+RI)进行预处理,导致急性心肌梗死(MI)小鼠模型中的细胞移植率提高。在这里,我们描述了使用Y-27632进行hiPSC-CM分化、纯化和细胞预处理的完整过程,以及由此产生的细胞收缩、钙瞬态测量和移植到小鼠MI模型中。该方法提供了一种简单、安全、有效、低成本的方法,显著提高了细胞移植率。该方法不仅与其他方法相结合,进一步提高细胞移植效率,而且为研究其他心脏疾病的发病机制提供了良好的依据。

引言

干细胞疗法已经显示出相当大的潜力,作为治疗由MI1造成的心脏损伤。差别化的hiPSC的使用为hiPSC-CMs²提供了取之不尽的源,并为突破性治疗的快速发展打开了大门。然而,治疗转化仍然存在许多限制,包括植入细胞移植率极低的挑战。

分离细胞与胰蛋白酶启动阿诺基斯3,这是加速,只有当这些细胞被注射到恶劣的环境,如缺血性心肌,其中缺氧环境加速走向细胞死亡。在剩余的细胞中,很大一部分从植入部位被冲出到血液中,并扩散到整个周围。其中一个关键的凋亡途径是RhoA/ROCK通路4。根据以前的研究,RhoA/ROCK通路调节行为素细胞骨骼组织5,6,这是负责细胞功能障碍7,8。ROCK抑制剂Y-27632在体细胞分离和传血过程中广泛使用,以增加细胞附着力,减少细胞凋亡9、10、11。在这项研究中,Y-27632用于在移植前治疗hiPSC-CM,以试图提高细胞移植率。

建立了几种旨在提高细胞移植率的方法,如热冲击和基底膜基质^涂层12。除了这些方法,基因技术还可以促进心肌细胞增^殖13或逆转非心肌细胞进入心肌^细胞14。从生物工程的角度来看,心肌细胞被播种在生物材料支架上,以提高移植^效率15。不幸的是,这些方法大多复杂且成本高昂。相反,这里提出的方法简单、经济、有效,可作为移植前的基础治疗,以及与其他技术结合使用。

研究方案

本研究中的所有动物程序均获得伯明翰阿拉巴马大学机构动物护理和使用委员会(IACUC)的批准,并基于国家卫生研究院实验室动物护理和使用指南(NIH出版物No.85-23)。

1. 文化媒体和文化板块的编制

1. 中等准备
   1. 对于hiPSC介质,混合400 mL的人类多能干细胞(hPSC)基底培养基(材料表1)和100 mL的hPSC 5x补充剂;将混合物储存在4°C。
   2. 对于 RPMI 1640/B27 减去胰岛素 (RB-) 介质,混合 500 mL 的 RPMI 1640 和 10 mL 的 B27 补充剂减去胰岛素。
   3. 对于 RPMI 1640/B27 (RB+) 介质,混合 500 mL 的 RPMI 1640、10 mL 的 B27 补充剂和 5 mL 的青霉素-链霉素 (Pen-Strep) 抗生素。
   4. 对于纯化培养基16,混合500 mL无葡萄糖RPMI 1640,10 mL的B27补充剂,5mL的笔链球菌抗生素和1,000μL的DL-乳酸钠溶液(最终浓度为4 mM)。
   5. 对于中和溶液,混合 200 mL 的 RPMI 1640、50 mL 的胎儿牛血清 (FBS)、2.5 mL 的笔链球菌抗生素和 50 μL 的 Y-27632(最终浓度为 10 μM)。
   6. 对于冷冻介质,混合9 mL的FBS、1 mL的二甲基亚硫酸盐(DMSO)和10μL的Y-27632(最终浓度为10μM)。
   7. 对于细胞外基质溶液(EMS),在4°C下解冻浓缩细胞外基质(材料表1),直到达到均匀一致的液态。在冰上制作350μL的基质等分之前,先冷却移液器尖端和管,并将等分在-20°C处储存。在涂覆板之前,将一个解冻的等分稀释到 24 mL 的冷冷 DMEM/F12 介质 (EMS);将 EMS 保持在 4°C 内长达 2 周。
      注:在冰上执行所有涂层步骤,以防止基底膜基质凝固。
   8. 对于Tyrode的溶液,取取组织培养级水的最终所需体积的90%,加入相应量的以下试剂,搅拌直至溶解。然后,使用 1 N NaOH 将 pHH 调整为 7.4。在最终浓度为 140 mmol/L 氯化钠、1 mmol/L 氯化镁、10 mmol/L HEPES、5 mmol/L 氯化钾、10 mmol/L 葡萄糖和 1.8 mmol/L 氯化钙的最终浓度中加入额外的水。使用 0.22 μm 膜通过过滤进行灭菌。
2. 细胞培养板涂层
   1. 对于 hiPSC 培养板,在 6 孔板的每个孔上应用 1 mL EMS,并在 37°C 下孵育板至少 1 小时。在播种细胞之前吸出 DMEM/F12 溶液。
   2. 对于明胶涂层,在组织培养级水中溶解0.2克明胶粉,以制造0.2%(w/v)溶液。在121°C下通过高压灭菌,15psi进行30分钟消毒。在通过细胞之前,吸出溶液,让板在组织培养罩内的室温下干燥至少1小时。

2. hiPSC维护和心肌细胞分化

1. 在 hiPSC 介质中培养 hiPSC(参见步骤 1.1.1),每日介质变化,直到每个孔的细胞达到 80%-90% 汇合。
   注:出于维护目的,hiPSC 通常每 4 天准备一次。
2. 要通过 hiPSC,吸气介质,用 1 倍磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 清洗井 1x。将0.5 mL的干细胞分离溶液(材料表1)加入每口井中,在37°C下孵育5-7分钟。
   注:孵育时间取决于细胞的密度和解散率,可以在显微镜下观察。
3. 用1mL的hiPSC培养基补充5μM Y-27632,中和干细胞分离溶液。将混合物收集在 15 mL 离心管中。在200 x g下将管离心5分钟,在不干扰细胞颗粒的情况下吸出上清液,然后,在含有5μM Y-27632的hiPSC培养基中重新悬浮细胞。
4. 以 1:6 到 1:18 的比例将 hiPSC 播种到新的 EMS 涂层 6 孔板上。在 24 小时后,在不带 Y27632 的情况下将介质更改为 hiPSC 介质。
5. 要冻结细胞,在0.5-100/500μL的浓度下,将分离的hiPSC重新悬浮在冷冻培养基中,将悬浮液置于冷冻室中,并将其储存在-80°C冷冻室中。24小时后将冷冻小瓶转移到液氮中。
6. 为了区分,用2 mL的RB-培养基取代hiPSC介质,辅以10μM GSK-3β抑制剂CHIR99021(CHIR),在80%~90%的细胞汇合。24 小时后,用 3 mL 的 RB-介质替换介质,再孵育 48 小时(第 3 天)。
7. 在第3天,用10μM Wnt抑制剂IWR1将介质更改为3 mL的RB-介质,持续48小时(第5天),然后用3 mL的RB-介质替换介质,并保持48小时(第7天)。
8. 在第 7 天,用 3 mL 的 RB 介质替换介质,并每隔 3 天更换一次介质。在 7-10 天之间应观察到 hiPSC-CM 的自发跳动。

3. hiPSC-CMs 纯化和小分子预处理

注:高度纯化、重组细胞分离酶(材料表1)用于分离hiPSC-CM。

1. 在 hiPSC-CM 分化后的第 21 天,吸出介质,用无菌 PBS 清洗细胞 1x。在37°C下,用每孔0.5 mL的细胞解散酶孵育细胞5-7分钟。使用 1 mL 移液器反复移液细胞悬浮液,以彻底分离细胞。
2. 细胞分离后,向每口孔中加入1mL中和溶液,将细胞混合物收集到15mL的离心管中,以200 x g离心3分钟。丢弃上清液,将细胞重新悬浮在中和溶液中。
3. 以每孔200万个细胞的密度将细胞重新种植到明胶涂层的6孔板上。
4. 24~48小时后,用净化培养基更换培养基3~5天。
   注:当每个显微镜视场中超过 90% 的细胞跳动时,纯化就完成了。为防止心肌细胞进一步损坏,请勿将净化时间延长到 5 天。如果第一轮不能产生必要的纯度,用RB+培养基更换净化培养基1天,然后完成第二轮纯化。
5. 移植前,在RB+培养基中培养12h的细胞,辅以10μM Y-27632。同样,使用 1 μM 韦拉帕米尔对 RB+ 介质中的细胞进行 12 h (hiPSC-CMs^+VER) 的血管治疗。
6. 治疗后,用PBS清洗hiPSC-CMs 1x,用每孔0.5 mL的细胞分离酶孵育细胞,最长2分钟。用中和溶液中和细胞,在15 mL离心管中收集细胞混合物,在200 x g下离心3分钟。

4. 心肌梗死和细胞移植

注:所有手术器械均采用高压灭菌器预消毒,并通过热珠消毒器(材料表2)在多次手术中保持无菌状态。

1. 麻醉NOD/scid小鼠(材料表2)与吸入的胶质(1.5%-2%)。通过小鼠对脚趾捏的反应监测麻醉水平。将兽医光学膏放在眼睛上,以防止他们在手术过程中干燥。
2. 在手术前提供0.1毫克/千克丁丙诺啡皮下管理疼痛。
3. 将鼠标定位在加热操作台上的固定位置,使用脱毛霜从腹颈区域和左胸腔取出头发,暴露皮肤,并用 70% 酒精对其进行消毒。
4. 用手术剪刀在颈部中心切开一个0.5厘米的切口,用无菌钳子分离皮下脂肪,并暴露气管。口头将插管管引入气管,将导管连接到小型动物呼吸机,并调整通风设置(将潮汐体积设置为 100*150 μL,将呼吸速率设置为每分钟 100x-150x)。
5. 鼠标稳定后,在左胸皮肤中间切开0.5厘米切口。使用钳子钝度分离肌肉层,并在第五个中间空间进行小切口,以暴露胸腔。将伸缩器放在切口中以打开胸腔并找到左降冠状动脉 (LAD)。在解剖手术显微镜下,用8-0将LAD拉上不可吸收缝合。
6. 紧随MI诱导后,在每个部位(3 x 10⁵细胞/动物,1 x 10 5)向小鼠心肌注入5μL的hiPSC-CMs-RI、hiPSC-CMs-VER、hiPSC-CMs+VER,或同等体积的PBS细胞/站点),一个在梗死区域,两个在梗塞周围区域。
   注:由于 5 μL 的体积非常小,因此通过直接用注射器吸吮来准确控制音量并不容易。无菌培养皿的盖子可以翻过来,5 μL的细胞可以先用移液器沉积在盖子上。由于表面张力,不会扩散,但会凝结成小液体质量。这可以很容易地吸收和注射到小鼠的心肌。
7. 用温暖的等子盐水溶液填充胸腔,消除胸腔中的残余空气。用6-0可吸收缝合,按顺序缝合肋骨、肌肉和皮肤。关闭共和麻醉注射。将手术动物放在加热垫上,并在它们恢复全意识时密切观察它们。然后,把动物放在一个干净的笼子里。在动物完全恢复之前,不要将动物归还给其他动物。
8. 手术后,连续3天每12小时给小鼠注射丁丙诺啡(0.1毫克/千克),每12小时注射布洛芬(5毫克/千克)。一天。在指定时间点执行后续分析研究。
   注:遵循当地动物护理委员会关于痛感的指导方针。

5. 钙瞬态和收缩记录

1. 高压灭菌器 15 毫米直径盖玻片 (材料表 2) 和钳子在 121 °C 的小玻璃烧杯中, 15 psi 15 分钟. 在 4 °C 预冷却盖玻片和钳子。
2. 使用钳子,将盖玻片放入12孔板中,将移液器300μL的细胞外基质放入每个盖玻片上。
   注:不要让基质超过盖玻片的边缘,以免减少基质涂层量。在37°C细胞培养箱中孵育12孔板1小时。
3. 用纯化 hiPSC-CM 在明胶涂层 6 孔板中吸出介质,用 PBS 清洗 1x,然后用 0.5 mL 的细胞分离酶消化 1.5 分钟。 加入 1 mL 中和溶液,用 1 mL 移液器反复移液,不超过 5x-10x,并在200 x g下将混合物离心3分钟。
4. 从盖玻片中吸出涂层的细胞外基质。计算细胞数,将中和溶液中的细胞重新悬浮至40,000/300μL浓度,然后将300μL的细胞悬浮液添加到每个盖玻片上。在37°C培养箱中培养盘子。
5. 24小时后,轻轻吸出中和溶液,向板的每口孔加入500μL的RB+介质,并继续培养2天。
6. 在hiPSC-CM培养基中加入Y-27632(10μM)、Rho激酶活化剂(RA,100 nM)、韦拉帕米尔(1 μM),或同等体积的PBS进入hiPSC-CM培养基,在钙瞬态和收缩检测前12小时。
   注:除了在化学处理12小时后检测细胞的钙瞬态和收缩性外,在化学提取后12、24、48和72小时也测试了这些参数的检测。
7. 拿出盘子,丢弃介质,用 PBS 清洗板 1x。将介质更改为不含超酚红的DMEM,含有0.02%(w/v)表面活性剂聚醇(材料表1)、5μM钙指标(材料表1)和相应的Y-27632(10μM)、RA(100 nM)、韦拉帕米尔(1 μM)或等量PBS,并在37°C下孵育板30分钟。
8. 丢弃上清液,用无染料DMEM介质清洗细胞3倍,让介质休息30分钟,使映射染料脱酯。
9. 将细胞种子盖玻片放入开放式浴室中,然后将腔室插入微孵化系统,该系统与自动温度控制器(材料表2)平衡至 37°C),将其与 Tyrode 溶液一起注入,并持续添加Rho激酶抑制剂(RI),RA,或PBS灌注溶液。
10. 使用倒置荧光显微镜(材料表2)和激光扫描头(材料表2)使用x-t线扫描,使用488nm的氧化光激光进行染料激发和515×10nm的染料激发,记录自发的钙瞬态阻隔滤波器收集发射光。使用共聚焦显微镜的差分干涉对比度功能记录 hiPSC-CM 的自发收缩(材料表 2)。
    注:使用 MATLAB R2016A 软件 (材料表 4) 处理和分析钙瞬态记录。使用ImageJ软件(材料表4)进行细胞收缩变化测定。

结果

本研究中使用的hiPSC-CMs源自人类起源,具有荧光酶报告基因;因此,通过生物发光成像(BLI)17(图1A,B)检测出移植细胞在体内的存活率。对于组织学心脏部分,人类特异性心脏肌钙蛋白T(hcTnT)和人类核抗原(HNA)双阳性细胞被归类为移植的hiPSC-CMs(图1C)。两种结果表明,Y-27632预处理显著改善了细胞移植率。与hiPSC...

讨论

本研究的关键步骤包括获得纯hiPSC-CM,通过Y-27632预处理提高hiPSC-CM的活性,最后,将精确数量的hiPSC-CM移植到小鼠MI模型中。

这里讨论的关键问题是:首先,我们优化了无葡萄糖纯化方法19,建立了新型高效纯化系统。系统程序包括应用细胞分离酶,在明胶涂层板中重新植入细胞,在重新镀层后在中和培养培养24小时,以及尽量减少移植前细胞的消化时间。其中执行,以达到...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Accutase (stem cell detachment solution)	STEMCELL Technologies	#07920
B27 minus insulin	Fisher Scientific	A1895601
B27 Supplement	Fisher Scientific	17-504-044
CHIR99021	Stem Cell Technologies	72054
DMEM (1x), high glucose, HEPES, no phenol red	Thermofisher	20163029
Fetal bovine serum	Atlanta Biologicals	S11150
Fluo-4 AM (calcium indicator)	Invitrogen/Thermofisher	F14201
Glucose-free RPMI 1640	Fisher Scientific	11879020
IWR1	Stem Cell Technologies	72562
Matrigel (extracellular matrix )	Fisher Scientific	CB-40230C
mTeSR (human pluripotent stem cells medium)	STEMCELL Technologies	85850
Pen-strep antibiotic	Fisher Scientific	15-140-122
Pluronic F-127 (surfactant polyol)	Sigma-Aldrich	P2443
Rho activator II	Cytoskeleton	CN03
RPMI1640	Fisher Scientific	11875119
Sodium DL-lactate	Sigma-Aldrich	L4263
TrypLE (cell-dissociation enzymes)	Fisher Scientific	12-605-010
Verapamil	Sigma-Aldrich	V4629
Y-27632	STEMCELL Technologies	72304
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment and Supplies
IVIS Lumina III Bioluminescence Instruments	PerkinElmer	CLS136334
15 mm Coverslips	Warner	CS-15R15
Centrifuge	Eppendorf	5415R
Confocal Microscope	Olympus	IX81
Cryostat	Thermo Scientific	NX50
Dual Automatic Temperature Controller	Warner Instruments	TC-344B
Electrophoresis Power Supply	BIO-RAD	1645050
Fluoresence Microscope	Olympus	IX83
High Speed Camera	pco	1200 s
Laser Scan Head	Olympus	FV-1000
Low Profile Open Bath Chamber (mounts into above microincubation system)	Warner Instruments	RC-42LP
Microincubation System	Warner Instruments	DH-40iL
Minivent Mouse Ventilator	Harvard Apparatus	845
NOD/SCID mice	Jackson Laboratory	001303
Precast Protein Gels	BIO-RAD	4561033
PVDF Transfer Packs	BIO-RAD	1704156
Trans-Blot System	BIO-RAD	Trans-Blot Turbo
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody
Anti-human Nucleolin (Alexa Fluor 647)	Abcam	ab198580
Cardiac Troponin T	R&D Systems	MAB1874
Cardiac Troponin C	Abcam	ab137130
Cardiac Troponin I	Abcam	ab47003
Cy5-donkey anti-mouse	Jackson ImmunoResearch Laboratory	715-175-150
Cy3-donkey anti-rabbit	Jackson ImmunoResearch Laboratory	711-165-152
Fitc-donkey anti-mouse	Jackson ImmunoResearch Laboratory	715-095-150
GAPDH	Abcam	ab22555
Human Cardiac Troponin T	Abcam	ab91605
Integrin β1	Abcam	ab24693
Ki67	EMD Millipore	ab9260
N-cadherin	Abcam	ab18203
Phospho-Myosin Light Chain 2	Cell Signaling Technology	3671s
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Matlab	MathWorks	R2016A
ImageJ	NIH	1.52g