JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم هنا، على بروتوكول لتقييم تعدد متشابك الوظيفية باستخدام التصحيح كامل الخلية الكهربية المشبك في شرائح الدماغ الحادة.

Abstract

غالباً ما تشكل زوج من الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي، متشابك الاتصالات متعددة و/أو مواقع إطلاق سراح العصبي الوظيفي (تعدد متشابك). تعدد متشابك من البلاستيك، والتغيرات في التنمية وفي مختلف الظروف الفسيولوجية، محدداً هاما لفعالية انتقال متشابك. هنا، فإننا مخطط تجارب لتقدير الدرجة تعدد الاشتباكات العصبية التي تنتهي إلى خلية بوستسينابتيك معين باستخدام التصحيح كامل الخلية الكهربية المشبك في شرائح الدماغ الحادة. على وجه التحديد، هو استخدام تسجيل الجهد-المشبك لمقارنة الفرق بين السعة للتيارات عفوية بوستسينابتيك ضادات (سيبسكس) والتيارات بوستسينابتيك ضادات مصغرة (ميبسكس). النظرية وراء هذا الأسلوب هو أن تظهر المدخلات الزبائ أن المعرض تعدد سيبسكس كبيرة، وتعتمد على إمكانات العمل بسبب الإفراج المتزامن الذي يحدث في كل جهة اتصال متشابك. وفي المقابل، سينشئ الإفراج عن إمكانيات العمل المستقل (وغير متزامنة) أصغر مطال ميبسكس. هذه الوثيقة الخطوط العريضة لمجموعة من التجارب والتحليلات تميز بوجود تعدد متشابك ويناقش شروط وقيود تقنية. يمكن تطبيق هذه التقنية للتحقيق كيف مختلف التدخلات السلوكية أو دوائية أو البيئية في فيفو تؤثر على تنظيم جهات الاتصال متشابك في مناطق مختلفة من الدماغ.

Introduction

انتقال متشابك هو إليه أساسية للتواصل بين الخلايا العصبية والمخ وبالتالي الدالة. أيضا انتقال متشابك مجا ويمكن تغيير فعاليته بطريقة تعتمد على النشاط، وكذلك كما هو الحال في استجابة لإشارات مودولاتوري1. وهكذا، تم دراسة الدالة متشابك نقطة تركيز رئيسية لأبحاث علم الأعصاب. تصحيح كامل الخلية الكهربية المشبك هو تقنية متعددة الاستخدامات التي تمكننا من فهم، بوضع تصاميم تجريبية وتحليلات البيانات، الآليات الفيزيائية-الحيوية والجزيئية متعمقة لانتقال متشابك. اتباع نهج استخداماً، ربما نظراً لبساطة الأسلوب والمفهوم، هو قياس التيارات بوستسينابتيك ضادات/المثبطة مصغرة (لي/إيبسكس) تحت الجهد المشبك التكوين2،3، 4 , 5 , 6-مبسكس الفردية تمثل تدفق الأيونات من خلال مستقبلات إيونوتروبيك بوستسينابتيك (مثل مستقبلات امبا وغاباA ) ردا على ربط بهم العصبية منهم أطلق سراحهم من محطة بريسينابتيك 7 . لأنه يتم الحصول على التسجيل حضور الجهد عن طريق بوابة نا+ قناة مانع تيدرودوتاكسين (TTX)، الإفراج عن إمكانات العمل المستقل وينطوي عادة على حويصلة متشابك واحد يحتوي على الناقل العصبي. وبناء على هذا الافتراض، متوسط السعة من مبسكس يستخدم على نطاق واسع تقديراً تقريبيا لحجم كانتال، التي تمثل عدد ووظيفة مستقبلات بوستسينابتيك معارضة موقع إطلاق سراح واحد. من ناحية أخرى، يعتبر تواتر مبسكس وتمثل مزيجاً من مجموع عدد من الاشتباكات العصبية التي تنتهي إلى الخلية بوستسينابتيك واحتمال الإفراج عن المتوسط. ومع ذلك، لا تقيس هذه المعلمات مولتيبليكاتيفيتي متغير آخر الاشتباكات العصبية، أو تعدد متشابك – هو أمر مهم لفعالية انتقال متشابك.

استناداً إلى نظرية انتقال متشابك7،،من89قوانتال، قوة اتصال معينة بين زوج من الخلايا العصبية تعتمد على ثلاثة عوامل: عدد الاشتباكات العصبية الوظيفية (N)، بوستسينابتيك ردا على إطلاق سراح حويصلة متشابك مفردة (حجم قوانتال؛ Q) واحتمال إطلاق سراح العصبي (Pr). تعدد متشابك يساوي N. تطوير تعدد متشابك أو تشذيب نهايات المضاعف من البلاستيك في التنمية وفي المرض مختلف الدول3،4،،من610. لهذا السبب، فقد وصف تعدد متشابك آثار هامة لفهم مدى فعالية انتقال متشابك في الصحة والمرض. يمكن تحديد التقنيات، مثل الميكروسكوب الإلكتروني أدلة الهيكلية لتعدد متشابك بالكشف عن عدة جهات اتصال متشابك منشؤها إكسون نفس على نفس العصبية بوستسينابتيك11،12، 13،14. ومع ذلك، يمكن هذه مولتيسينابسيس هيكلياً المحددة وظيفيا صامت15،16. يتطلب دراسة دقيقة الوظيفية N تحديا من الناحية التقنية النهج الكهربية، مثل التسجيلات كامل الخلية المزدوجة التي يمكن تحديد ما إذا كان اتصال معين لمواقع إطلاق سراح وظيفية متعددة والحد الأدنى النهج التحفيز التي تهدف إلى توظيف إكسون المفترضة مفردة.

في هذا البروتوكول، يصف لنا طريقة بسيطة لتقدير تعدد متشابك باعتماد أسلوب وضعت أصلاً من قبل حاسبات وآخرون2. هذا الأسلوب ينطوي على قياس عفوية PSCs (سبسكس) ومبسكس باستخدام التصحيح كامل الخلية المشبك الكهربية، مما يسمح لنا بتقدير درجة تعدد متشابك عبر جميع المدخلات إلى خلية معينة.  كما يعكس تعدد المعرفة مسبقاً، ومتشابك عدد نقاط الاشتباك العصبي بين خلية معينة قبل وبوستسينابتيك. إذا نهايات متعددة جندهم بإمكانيات العمل في التزامن، سيكون هناك احتمال كبير للجمع الزماني الفردية الأمنية الخاصة (أي كانتال)، توليد سعة أكبر من PSC.  في تسجيلات مبسك منخفض (في إمكانات العمل التي يتم حظرها بواسطة تتكس)، احتمال الجمع الزماني للفرد مبسكس (غير متزامن). باستخدام هذا المنطق، يمكن تقدير تعدد متشابك بمقارنة السعة sPSC (مع إمكانية العمل تعتمد على الإصدار) إلى السعة مبسك.

لفحص وجود تعدد يصف لنا أربع تجارب وتحليلاتها باستخدام ابسكس جلوتاماتيرجيك على سبيل مثال. ومع ذلك، يمكن استخدام نفس النهج للصيام انتقال جابايرجيك/جليسينيرجيك (إيبسكس). يرد أدناه وصف موجز الأساس منطقي لكل تجربة. أولاً، وكما هو موضح أعلاه، يمكن تقدير تعدد متشابك بمقارنة سعة سيبسكس إلى ميبسكس. هناك شرطين لهذا النهج؛ محاور عصبية 1) presynaptic يجب إطلاق النار عددا كافياً من إمكانات العمل أثناء التسجيل، و 2) Pr يجب أن تكون عالية حتى الإفراج عن عدة نقاط الاشتباك العصبي العصبي عند وصول بإمكانيات العمل. ولتلبية هذه المتطلبات، سيبسكس هي سجلت أول في انخفاض Ca2 + الاصطناعية النخاعي (قام)، وثم تسجيل حضور تركيز منخفض من خصم قناة ك+ ، 4-أمينوبيريديني (4-AP) لزيادة العمل إطلاق النار المحتملة و Pr. ثم حظر إمكانات عمل إطلاق النار من قبل ت وانخفض بمقدار الجهد عن طريق بوابة Ca2 + قناة مانع Cd2 +للعلاقات العامة. مقارنة السعة سيبسكس (مع 4AP) إلى ميبسك (مع 4AP، تتكس، ومؤتمر نزع السلاح2 +). في التجربة الثانية، Ca2 + محله اكويمولار ريال2 + في قام لﻻستخدام الإصدار حويصلة. كما Ca2 + مطلوب من أجل الإفراج عن حويصلات متزامن، يجب القضاء على استبدال مع ريال2 + سيبسكس السعة الكبيرة التي تدل على تعدد. ثالثا، ميتشانيستيكالي، تعدد يمكن أن يؤدي أما جهات متشابك متعددة إلى نفس الخلايا العصبية بوستسينابتيك أو الإصدار مولتيفيسيكولار (أي حويصلات متعددة إطلاق سراحهم خلال اتصال متشابك واحدة)17،18. للتمييز بين هذين النوعين من التعدد، يستخدم التجربة الثالثة لتقارب منخفضة، سرعة الناي تنافسية خصم مستقبلات امبا،،γ-د-جلوتاميلجليسيني (γ-DGG)1718 لتحديد ما إذا كانت كبيرة سيبسك هي نتيجة لمجموع الزمانية نهايات مستقلة أو الإفراج عن مولتيفيسيكولار تعمل على سكان بتداخل مستقبلات بوستسينابتيك. إذا كانت الأحداث السعة الكبيرة التي تنشأ عن إطلاق سراح مولتيفيسيكولار، γ-DGG ستكون أقل فعالية في تثبيط سيبسكس مقارنة بالاصغر حجماً أكبر، بينما سوف تتأثر بالمثل سيبسكس الكبيرة التي تنشأ من مجموع الزمانية لعدة جهات اتصال متشابك Γ-استيراد. في التجربة الرابعة، استخدمت طريقة أكثر فيزيولوجية لتعزيز إمكانات عمل إطلاق النار، وهما الزبائ التحفيز متشابك. عابر رشقات نارية باتجاه النشاط متشابك الزيادة/تيسير عفوية العمل إمكانية إطلاق النار، والإفراج عن احتمال أفيرينتس حفز. ويسمح هذا النهج لذلك، تعدد في المجاهرة بطريقة أكثر فسيولوجية.

البروتوكول التالية توضح طريقة إجراء هذه التجارب في الأنسجة طائي الماوس. وتستخدم على وجه التحديد، كورتيكوتروبين الإفراج عن هرمون (CRH) الخلايا العصبية من نواة تحت المهاد (التشفيير) بارافينتريكولار. تصف الإجراءات المتعلقة بإجراء تصحيح كامل الخلية المشبك الكهربية، وشرح التجارب المحددة لاختبار لتعدد متشابك.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

جميع التجارب على الحيوانات تقرها "اللجنة العناية بالحيوان" لجامعة ويسترن أونتاريو وفقا "المجلس الكندي لإرشادات العناية بالحيوان" (سياسة الاستخدام المقبول #2014-031).

1-الحلول

  1. تشريح الحل
    1. الرجوع إلى الجدول 1 لتكوين الحل تشريح.
    2. إعداد حل أسهم 20 x مسبقاً وتخزينها عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
    3. 1 x تشريح حل، حل3والجلوكوز السكروز في ddH2س ناكو، وإضافة الأسهم 20 x. التأكد من الاسموليه بين موسم 315-320 وتخزين الحل لمدة أسبوع واحد لا يزيد على 4 درجة مئوية.
    4. ملء قنينة اثنين مع 100 مل من تقطيع الحل وغطاء لهم مع بارافيلم. البرد الحل في ثلاجة حتى يصبح تجميد الحل جزئيا (حوالي 20 دقيقة في الثلاجة-80 درجة مئوية). استخدام أنبوب غاز تشتت، فقاعة كل قنينة من تقطيع الحل مع 95% O25% CO2 لمدة 20 دقيقة على الجليد.
الحل تركيزات (مم)
تشريحقام عاديقام منخفضة Ca2 +قام ريال+ماصة/الداخلية
كلوريد الصوديوم87126126126-
بوكل2.52.52.52.58
كاكل2 0.52.50.5--
سركل2 ---2.5-
مجكل2 71.52.51.52
نة2بو4 1.251.251.251.25-
ناكو3 25262626-
الجلوكوز25101010-
السكروز75----
كغلوكونات----116
غ-غلوكونات----12
حبيس----10
اجتا K2----1
K2ATP----4
أنشئ نا3----0.3

الجدول 1: تكوين حلول مختلفة.

  1. قام (لاسترداد شريحة والصيانة)
    1. الرجوع إلى الجدول 1 لتكوين قام.
    2. إعداد حل أسهم 20 x مسبقاً وتخزينها عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
    3. قام 1 x، حل NaHCO3 والجلوكوز في ddH2س وإضافة الأسهم 20 x. ضمان الاسموليه بين موسم 298-300. استخدام الحل في يوم واحد.
  2. قام (انخفاض Ca2 + لتسجيل)
    1. الرجوع إلى الجدول 1 لتكوين منخفض Ca2 + قام.
    2. إعداد حل أسهم 20 x مسبقاً وتخزينها عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
    3. 1 × Ca2 + قام منخفضة، حل ناكو3 والجلوكوز في ddH2O وإضافة 20 x (كاكل2 ومجكل2 مجاناً) الأسهم وكاكل2 مجكل2 لتحديد تركيزات. ضمان الاسموليه بين 298-300. استخدام الحل في يوم واحد.
  3. قام (ريال2 + لتسجيل)
    1. الرجوع إلى الجدول 1 لتكوين ريال2 + قام.
    2. إعداد حل أسهم 20 x مسبقاً وتخزينها عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
    3. 1 ×2 + قام ريال، حل NaHCO3 والجلوكوز في ddH2س وإضافة 20 x (كاكل2 ومجكل2 مجاناً) الأوراق المالية، سركل2 و مجكل2 لتحديد تركيزات. ضمان الاسموليه بين 298-300. استخدام الحل في يوم واحد.
  4. حل داخلي
    1. الرجوع إلى الجدول 1 لتكوين كغلوكونات أساس الحل الداخلية.
    2. لجعل 20 مل من محلول الداخلية، إضافة 15 مل مياه الصف البيولوجيا الجزيئية إلى أنبوب 50 مل. نفذ الخطوات التالية على الجليد.
    3. إعداد الحلول التالية قبل الوقت بتركيزات 1 م الأسهم في البيولوجيا الجزيئية المياه الصف. إضافة (في مل): غلوكونات ك 2.32، 0.24 غ-غلوكونات، 0.20 حبيس، 0.16 بوكل، 0.05 K2-عطا، 0.04 مجكل2 إلى أنبوب 50 مل.
    4. إضافة 100 ميليلتر من 0.3 م غ3أنشئ.
    5. وزن ملغ 44.08 ك2ATP في أنبوب ميكروسينتريفوجي 2 مل وإضافة 1 مل مياه الصف البيولوجيا الجزيئية، ثم إضافة إلى أنبوب 50 مل.
    6. قم بضبط درجة الحموضة إلى 7.2-7.4 مع 1 م كوه. ضمان الاسموليه بين موسم 283-289.

2. إعداد الشريحة

  1. إعداد الأدوات
    1. إضافة 200 مل قام إلى قاعة الإنعاش (شيدت من كوب 250 مل مع 4 آبار والمعاوضة) ووضع في غرفة الإنعاش في حمام مائي (35 درجة مئوية).
    2. تغطية الدائرة مع فيلم بارافين واستمرار الفقاعة قام مع 95% O2%5 CO2 استخدام أنبوب تشتت زجاج لمدة 20 دقيقة على الأقل.
    3. التحضير للتشريح بإعداد الأدوات (المبضع، مقص غرامة الزاوية، الملقط، فرشاة طلاء غرامة، ملعقة بلاستيكية).
    4. ملء المحاقن 60 مل مع حوالي 15 مل الحل تشريح المثلج من الخطوة 1.1.4.
    5. إعداد منصة التشريح عن طريق وضع ورقة تصفية على غطاء لوحة جيدا.
    6. إعداد قاعة تشريح بوضعه في علبة الجليد وملء العلبة مع الجليد.
    7. إعداد فيبرتوم طريق تأمين شفرة المتاح في حامل بليد.
    8. جعل ماصة نقل بكسر غيض من ماصة باستور ووضع لمبة مطاط أكثر من نهاية مكسورة.
  2. تشريح الدماغ الماوس
    1. تخدير الحيوان في دائرة مشبعة إيسوفلوراني 4% حتى ردود الفعل العمود الفقري غائبة.
    2. قطع رأس الحيوان باستخدام مقصلة وإزالة الدماغ بسرعة.
      1. جعل شق خط الوسط مع شفرة المبضع رقم 22 من روسترال إلى والذيلية.
      2. قشر فروة الرأس أفقياً على كل جانب من الرأس.
      3. استخدام مقص جيد قطع الجمجمة على جانب واحد من والذيلية إلى روسترال (بما في ذلك الجانب من عظام أمامي)، استخدام الحذر لا إلى تلف الدماغ.
      4. استخدام الملقط برفع قطعة الجمجمة قبالة الدماغ وتبريد الدماغ مع 15 مل حل تشريح المثلج باستخدام المحاقن من الخطوة 2.1.4 بسرعة.
      5. رفع المخ خارج الجمجمة.
      6. مكان الدماغ في واحدة من قنينة مملوءة بالحل تشريح المثلج (من الخطوة 1.1.4) bubbled مع 95% O25% CO2.
  3. إعداد شرائح من تحت المهاد الماوس
    1. كتلة في الدماغ لمنطقة الدماغ المرجوة وقص زاوية (مثلاً، لشرائح طائي الاكليلية، تقليم قبالة الأنسجة روسترال إلى chiasm البصرية ووالذيليه إلى بونس استخدام شفرة وضمان كتلة والذيلية خط عمودي على سطح مستو لقاعدة للدماغ).
    2. استخدام قطع قطعة من ورق الترشيح، تلتقط الدماغ من الجانب الأمامي والصق على الجانب الخلفي للوحة عقد استخدام الغراء الفورية.
    3. بسرعة ضع لوحة عقد في قاعة تشريح وملء الدائرة مع تقطيع الحل من الكأس الثانية في خطوة 1.1.4.
    4. تأمين علبة الدائرة والجليد تشريح على فيبرتوم.
    5. تحديد مجال تشريح (الأمامي والخلفي للدماغ) والبدء في تقطيع 250 ميكرون سمك شرائح الاكليلية. وأوصت المعلمات: 0.10 mm/s، السعة بسرعة 2 مم.
    6. تقليم الشرائح إلى الحجم المناسب لمنطقة الدماغ المرجوة.
    7. استرداد الشرائح عند 35 درجة مئوية لمدة 30-45 دقيقة. ثم إزالة غرفة الإنعاش من حمام الاحترار والسماح للشرائح لاسترداد في درجة حرارة الغرفة مقدار 30 إضافية للحفاظ على شرائح في درجة حرارة الغرفة لبقية اليوم وتواصل فقاعة حمام باستمرار مع 95% O25% CO2 .

3. كلامبريكوردينج تصحيح كامل الخلية

  1. سحب الماصات التصحيح
    1. استخدام معلمات المقترح للجامعة-خلية تسجيل من دليل ساحبة ماصة، سحب الماصات التصحيح من الزجاج السميك مسورة لمقاومة ماصة من 3-5 MΩ.
    2. استخدام تعبئة (تجارية أو محلية الصنع)، ميكروسيرينجي تلميح ماصة مع الحل الداخلية التي تمت تصفيتها. لتجعل من ميكروسيرينجي، وحرق غيض من حقنه 1 مل والسماح بالتلميح سقوط إنشاء تلميح غرامة طويلة.
  2. الحصول على تكوين كامل الخلية
    1. ضع ماصة تسجيل فقط فوق ماصة شريحة والإزاحة الحالية في وضع المشبك الجهد. تطبيق ضغط إيجابي طفيف على ماصة وقفل في محبس الحنفية.
    2. حدد خلية صحية مع غشاء سليمة والاقتراب من الخلية التي تحتوي الماصة. الضغط الإيجابي ينبغي أن يسبب اضطرابات طفيفة في الأنسجة (أي موجه بطيئة في الأنسجة عند إدخال).
    3. وتواصل ببطء جلب ماصة أقرب إلى الخلية باستخدام اقتراح قطري حتى الماصة النماذج نقرة صغيرة على سطح الخلية.
    4. فك القفل الضغط الإيجابي. سوف تبدأ الخلية لتشكيل ختم، وسوف يزيد المقاومة أعلاه 1 GΩ. في المشبك الجهد، عقد الخلية في-68 أم.
    5. سحب قليلاً بعيداً عن الخلية قطرياً لإزالة الضغط الزائد من الخلية.
    6. التعويض عن السعة ماصة سريعة وبطيئة.
    7. تطبيق شفط موجزة من خلال أنبوب متصل بحامل ماصة اختراق الخلية والحصول على تكوين كامل الخلية.
    8. التبديل إلى وضع الخلية في الغشاء اختبار نافذة في الكهربية الحصول على البيانات وتحليل البرمجيات (مثلاً، كلامبيكس).
    9. قبل كل تسجيل المشبك الجهد، إجراء اختبار غشاء باستخدام نفس البرنامج وتسجيل المعلمات ذات الصلة في كتاب مختبر (غشاء المقاومة والمقاومة الوصول والسعة).
    10. الحفاظ على درجة حرارة الحمام التسجيل في 27 – 30 درجة مئوية ومعدل التدفق في 1.5-2.0 مل/دقيقة للتجارب اللاحقة.

4-تعدد التجارب

  1. التجربة 1: تقدير تعدد استخدام 4-أ فب
    1. في المشبك الجهد، عقد الخلية في-68 أم. باستخدام البرنامج نفسه، سجل في سيبسكس بينما بيرفوسينج الحمام مع انخفاض Ca2 + قام. سجل لمدة 5 دقائق على الأقل بعد بدء تكوين كامل الخلية لضمان تسجيل أساس مستقرة كما قد يكون النشاط متشابك عالية بعد وقت قصير من اختراقه في الغشاء.
    2. ميكروبيبيتي، باستخدام إضافة 4-AP إلى قام وحمام تطبيق 30 ميكرون 4-آب سجل سيبسكس لمدة 10 دقيقة على الأقل للحصول على تأثير المخدرات الكاملة.
    3. إضافة 0.5 ميكرومتر ت و 10 ميكرون Cd2 + إلى قام مع 4-آب وتسجيل ميبسكس لمالا يقل عن 10 دقيقة.
    4. لتحليل العمل دون اتصال، استخدام الماضي 1 دقيقة من الأساس قبل تطبيق 4-AP (بانخفاض Ca2 + قام)، دقيقة العاشرة لتطبيق 4-AP ودقيقة العاشرة ت التطبيق مباشرة.
  2. التجربة 2: لﻻستخدام الإصدار حويصلة ريال2 + باستخدام
    1. بينما بيرفوسينج الحمام مع العادي Ca2 + قام (نفس قام حمام) السجل سيبسكس لمدة 5 دقائق على الأقل.
    2. التبديل من العادي Ca2 + قام وتبدأ بيرفوسينج ريال2 + قام (من الخطوة 1، 4)، وسجل سيبسكس.
    3. للتحليل دون اتصال، تحديد ما إذا كانت سيبسكس السعة الكبيرة نتيجة إطلاق متزامن حويصلات، قارن 1 دقيقة الأخيرة من خط الأساس (في قام العادي) في الدقيقةال 10 ريال2 + قام التطبيق.
  3. تجربة 3: اختبار لاستخدام الإصدار مولتيفيسيكولار Γ- استيراد
    1. في انخفاض Ca2 + قام السجل سيبسكس لمدة 5 دقائق على الأقل.
    2. إضافة 30 ميكرون 4-AP قام من خلال نظام التروية. سجل سيبسكس لمالا يقل عن 10 دقيقة.
    3. إضافة 200 ميكرومتر γ-DGG قام مع 4-آب وتسجيل سيبسكس لمالا يقل عن 10 دقيقة.
    4. كما تجربة التحكم في خلية منفصلة، قم بإجراء الخطوات 1-3 ولكن يطبق بتركيز منخفض (125 شمال البحر الأبيض المتوسط) من دنقكس بدلاً من استيراد γ.
    5. لتحليل غير متصل، تحليل دقيقة الأخير لكل تطبيق المخدرات.
  4. التجربة 4: حفز الزبائ المدخلات لزيادة إمكانات عمل إطلاق النار.
    1. سجل سيبسكس في Ca2 + قام العادي.
    2. تنشيط أفيرينتس استخدام زجاج أحادي القطب كهربائي مليئة قام بمعدل 20 هرتز 2 s وكرر 10 مرات بفاصل بين انفجر من 20 ثانية.
    3. للتحليل واستخدام ms 5,000 قبل أن الحافز الأول كخط الأساس وقارن إلى ms 10-300 بعد الحافز النهائي وثم تأخذ تغيير السعة والتردد المتوسط ما يزيد على 10 محاكمات.

5-تحليل

  1. تحليل سيبسكس وميبسكس باستخدام برنامج يكتشف ويحلل التيارات متشابك (مثلاً، برامج تحليل مصغرة).
    1. باستخدام هذا البرنامج، استخدم المعلمات الكشف المقترحة للكشف عن امبا مستقبلات ابسكس (أو ابسكس مستقبلات GABA إذا كان تسجيل التيارات المثبطة).
    2. استخدم الدالة "التحليل دون توقف" للكشف عن ابسكس في التسجيل.
    3. التفحص يدوياً كل تسجيل التأكد من البرنامج هو الكشف بدقة عن كل حدث (مثل ضمان لا يتم أحداث غاب أو عدها مرتين).
    4. تصدير بيانات الحدث بنسخها إلى "الحافظة" ولصقه في برنامج إدارة بيانات (مثل Excel)
    5. حساب متوسط التردد و/أو السعة لكل العلاج من تعاطي المخدرات، وإجراء التحليلات الإحصائية ذات الصلة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

البروتوكول أعلاه توضح طريقة لاستخدام تصحيح كامل الخلية المشبك الكهربية لفحص درجة تعدد متشابك، استخدام الماوس طائي الخلايا العصبية كمثال. ينبغي أن يؤدي هذا الأسلوب إعداد شريحة الخلايا قابلة للحياة السليمة التي لم تقم تورم الغشاء أو نواة (الشكل 1). كل خطوة في البر...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

واحد شرط هام لتجربة الكهربية المشبك تصحيح ناجح هو الحصول على شرائح/الخلايا السليمة. لدينا بروتوكول وصف هو الأمثل لطائي الشرائح التي تحتوي على الخلايا العصبية التشفيير. الدماغ الأخرى مجالات قد تتطلب تعديل الحلول و تشريح أساليب21،،،من2223

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

الكتاب لا تمت بصلة إلى الكشف عن

Acknowledgements

ج. س. تلقي "المنح الدراسية العليا في أونتاريو". W.I. تلقت "زمالة محقق جديد" من كندا "بحوث الصحة العقلية". ويدعم هذا العمل العاملة المنح إلى W.I من العلوم الطبيعية ومجلس البحوث الكندي الهندسية (06106-2015 رجبين) والمعهد الكندي "البحوث الصحية" (PJT 148707).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL syringeBD309659
10 bladeFisher Scientific/others35698
22 bladeVWR/others21909-626
22 μM syringe filtersMilipore09-719-000
Adson forecepsHarvard Instruments72-8547
Angled sharp scissorsHarvard Instruments72-8437
ClampexMolecular DevicespClamp 10
Double edge bladeVWR74-0002
Filter paperSigma/others1001090
Fine paintbrushFisher/various15-183-35/various
Gas Dispersion TubeVWRLG-8680-120
IsofluraneFresenius Kabi/othersM60303
Krazy gluevariousvarious
Mini analysisSynaptosoftMiniAnalysis 6
OsmomoterWescor IncModel 5600
ParafilmSigmaPM-996
Pasteur pipetteVWR14672-200
ph meterMettler ToledoFE20-ATC
Rubber bulbVWR82024-550
Scalpel handle No. 3Harvard Instruments72-8350
Scalpel handle No. 4Harvard Instruments72-8356
Single edge bladeVWR55411-050
Vibratome slicerLeicaVT1200S
Water Purification SystemMilliporeMilli-Q Academic A10
Well plate lidFisher/various07-201-590/various
Chemicals/reagents
4-APSigma275875
BAPTAmolecular probesB1204
CaCl2*2H2OSigmaC7902
CdCl2sigma202908
DNQXTocris189
EGTASigmaE3889
glucoseSigmaG5767
HEPESSigmaH3375
K2-ATPSigmaA8937
KClSigmaP9333
K-gluconateSigmaG4500
MgCl2*6H2OSigmaM2670
Molecular biology grade waterSigmaW4502-1L
Na3GTPSigmaG8877
NaClBioshopSOD001.1
Na-gluconateSigmaS2054
NaH2PO4Sigma71504
NaHCO3SigmaS6014
PicrotoxinsigmaP1675
SrClSigma255521
sucroseBioshopSUC507.1
TTXAlamone LabsT-550
yDGGTocris6729-55-1

References

  1. Abbott, L. F., Nelson, S. B. Synaptic plasticity: taming the beast. Nature Neuroscience. 3 (Supp), 1178-1183 (2000).
  2. Hsia, A. Y., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Development of Excitatory Circuitry in the Hippocampus. Journal of Neurophysiology. 79 (4), 2013-2024 (1998).
  3. Zhan, Y., et al. Deficient neuron-microglia signaling results in impaired functional brain connectivity and social behavior. Nature neuroscience. 17 (3), 400-406 (2014).
  4. Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science (New York, N.Y). 333 (6048), 1456-1458 (2011).
  5. Schrader, L. A., Tasker, J. G. Presynaptic Modulation by Metabotropic Glutamate Receptors of Excitatory and Inhibitory Synaptic Inputs to Hypothalamic Magnocellular Neurons. Journal of Neurophysiology. 77 (2), 527(1997).
  6. Salter, E. W., Sunstrum, J. K., Matovic, S., Inoue, W. Chronic stress dampens excitatory synaptic gain in the paraventricular nucleus of the hypothalamus. The Journal of Physiology. 596 (17), 4157-4172 (2018).
  7. Redman, S. Quantal analysis of synaptic potentials in neurons of the central nervous system. Physiological Reviews. 70 (1), 165-198 (1990).
  8. Del Castillo, J., Katz, B. Quantal components of the end-plate potential. The Journal of physiology. 124 (3), 560-573 (1954).
  9. Stevens, C. F. Quantal release of neurotransmitter and long-term potentiation. Cell. 72 Suppl, 55-63 (1993).
  10. Deger, M., Helias, M., Rotter, S., Diesmann, M. Spike-timing dependence of structural plasticity explains cooperative synapse formation in the neocortex. PLoS computational biology. 8 (9), e1002689(2012).
  11. van den Pol, A. N., Wuarin, J. P., Dudek, F. E. Glutamate, the dominant excitatory transmitter in neuroendocrine regulation. Science (New York, N.Y). 250 (4985), 1276-1278 (1990).
  12. Miklós, I. H., Kovács, K. J. Reorganization of synaptic inputs to the hypothalamic paraventricular nucleus during chronic psychogenic stress in rats. Biological Psychiatry. 71 (4), 301-308 (2012).
  13. Korn, H., Triller, A., Mallet, A., Faber, D. S. Fluctuating responses at a central synapse: n of binomial fit predicts number of stained presynaptic boutons. Science (New York, N.Y.). 213 (4510), 898-901 (1981).
  14. Tracey, D. J., Walmsley, B. Synaptic input from identified muscle afferents to neurones of the dorsal spinocerebellar tract in the cat. The Journal of physiology. 350, 599-614 (1984).
  15. Lin, J. W., Faber, D. S. Synaptic transmission mediated by single club endings on the goldfish Mauthner cell. II. Plasticity of excitatory postsynaptic potentials. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 8 (4), 1313-1325 (1988).
  16. Atwood, H. L., Tse, F. W. Changes in binomial parameters of quantal release at crustacean motor axon terminals during presynaptic inhibition. The Journal of physiology. 402, 177-193 (1988).
  17. Li, G. L., Keen, E., Andor-Ardó, D., Hudspeth, A. J., von Gersdorff, H. The unitary event underlying multiquantal EPSCs at a hair cell’s ribbon synapse. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (23), 7558-7568 (2009).
  18. Wadiche, J. I., Jahr, C. E. Multivesicular release at climbing fiber-Purkinje cell synapses. Neuron. 32 (2), 301-313 (2001).
  19. Oliet, S. H., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Bidirectional control of quantal size by synaptic activity in the hippocampus. Science (New York, N.Y.). 271 (5253), 1294-1297 (1996).
  20. Inoue, W., et al. Noradrenaline is a stress-associated metaplastic signal at GABA synapses. Nature Neuroscience. 16 (5), 605-612 (2013).
  21. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute Brain Slice Methods for Adult and Aging Animals: Application of Targeted Patch Clamp Analysis and Optogenetics. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). , 1183-242 (2014).
  22. Richerson, G. B., Messer, C. Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing. Experimental neurology. 131 (1), 133-143 (1995).
  23. Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. Journal of neuroscience methods. 171 (1), 118-125 (2008).
  24. Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons. Journal of neuroscience methods. 158 (2), 251-259 (2006).
  25. Gunn, B. G., et al. Dysfunctional astrocytic and synaptic regulation of hypothalamic glutamatergic transmission in a mouse model of early-life adversity: relevance to neurosteroids and programming of the stress response. Journal of Neuroscience. 33 (50), 19534-19554 (2013).
  26. Su, H., Alroy, G., Kirson, E. D., Yaari, Y. Extracellular calcium modulates persistent sodium current-dependent burst-firing in hippocampal pyramidal neurons. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 21 (12), 4173-4182 (2001).
  27. Frankenhaeuser, B., Hodgkin, A. L. The action of calcium on the electrical properties of squid axons. The Journal of physiology. 137 (2), 218-244 (1957).
  28. Xiong, G., Metheny, H., Johnson, B. N., Cohen, A. S. A Comparison of Different Slicing Planes in Preservation of Major Hippocampal Pathway Fibers in the Mouse. Frontiers in neuroanatomy. 11, 107(2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

146

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved