הערכה של ריבוי סינפטית באמצעות תאים כל תיקון-קלאמפ אלקטרופיזיולוגיה

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להערכת תפקודית הריבוי סינפטית באמצעות תיקון שלם-תא קלאמפ אלקטרופיזיולוגיה פרוסות המוח חריפה.

Abstract

במערכת העצבים המרכזית, זוג של הנוירונים יוצרים לעתים קרובות מספר קשרים סינפטיים ו/או אתרים שחרור נוירוטרנסמיטר פונקציונלי (ריבוי סינפטית). ריבוי סינפטית היא פלסטיק ושינויים במהלך הפיתוח, בתנאים פיזיולוגיים שונים, להיות דטרמיננטה חשוב עבור היעילות של ההעברה הסינאפסית. כאן, אנחנו חלוקה לרמות ניסויים עבור הערכת מידת הריבוי של הסינפסות הפסקת אל נוירון postsynaptic נתון באמצעות תיקון שלם-תא קלאמפ אלקטרופיזיולוגיה פרוסות המוח חריפה. באופן ספציפי, מתח-קלאמפ הקלטה משמש כדי להשוות את ההבדל בין את משרעת של זרמי postsynaptic סינאפסות ספונטנית (sEPSCs) וזרמים מיניאטורי סינאפסות postsynaptic (mEPSCs). התיאוריה מאחורי שיטה זו הוא כי תשומות מביא כי התערוכה ריבוי יראה sEPSCs גדול, תלויי-פוטנציאל הפעולה בעקבות יציאתו סינכרונית המתרחשת על כל איש קשר סינפטית. לעומת זאת, שחרור ללא תלות פוטנציאל הפעולה (וזה אסינכרוני) יפיק mEPSCs משרעת קטנים יותר. מאמר זה מתאר קבוצה של ניסויים וניתוחים לאפיין את קיומו של ריבוי סינפטית ודן את הדרישות ואת המגבלות של הטכניקה. טכניקה זו ניתן להחיל לחקור כמה שונה התערבויות התנהגותיות, תרופתי או סביבתיים בתחום vivo משפיעים על הארגון של קשרים סינפטיים באזורי מוח שונים.

Introduction

הסינאפסית הוא מנגנון בסיסי עבור תקשורת בין נוירונים, לפיכך, תפקוד המוח. הסינאפסית גם יציב, באפשרותך לשנות את יעילותה באופן תלוי-פעילות כמו גם כמו בתגובה אותות modulatory¹. לפיכך, בחינת תפקוד סינפטית היה מוקד מרכזי של חקר המוח. אלקטרופיזיולוגיה מלחציים תיקון כל תא הוא טכניקה תכליתי המאפשר לנו להבין, על-ידי להמציא עיצובים מוטוריים וניתוחים נתונים, מעמיק מנגנונים biophysical ומולקולרית של ההעברה הסינאפסית. בגישה נפוץ, אולי בשל הפשטות של טכניקה, קונספט, הוא המדד של זרמי postsynaptic סינאפסות מעכבות מיניאטורי (בי / IPSCs) תחת המתח תהדק את תצורת^{2,3, 4 , 5 , 6}. mPSCs בודדים לייצג את הזרימה של יונים דרך רצפטורים postsynaptic ionotropic (למשל קולטנים אמפא ו- GABA_A ) בתגובה הכריכה של נוירוטרנסמיטורים בהתאמה שלהם שוחרר ממסוף presynaptic ⁷ . כי ההקלטה מתקבל בנוכחות ממותגת מתח Na⁺ ערוץ חוסם טטרודוטוקסין (TTX), שחרורו אינו תלוי-פוטנציאל הפעולה, בדרך כלל כרוך שלפוחית סינפטית יחיד המכיל עצבי. בהתבסס על הנחה זו, משרעת הממוצע של mPSCs הוא בשימוש נרחב הערכה גסה עבור גודל quantal, המייצגת את המספר ואת הפונקציונליות של קולטנים postsynaptic מנוגדות אתר שחרור יחיד. מצד שני, התדירות של mPSCs נחשבת מייצגים שילוב של המספר הכולל של הסינפסות הפסקת אל התא postsynaptic והסתברות שחרור הממוצע שלהם. עם זאת, פרמטרים אלה לא מאפשרות למדוד משתנה נוסף-multiplicativity של הסינפסות, או ריבוי סינפטית – דבר חשוב היעילות של ההעברה הסינאפסית.

בהתבסס על תורת הסינאפסית^7,8,9quantal, הכוח של חיבור נתון בין זוג נוירונים הוא תלוי בשלושה גורמים: המספר של הסינפסות פונקציונלי (N), postsynaptic בתגובה שחרורו של שלפוחית סינפטית יחיד (גודל quantal; Q), ההסתברות של שחרור נוירוטרנסמיטר (P_r). ריבוי סינפטית שווה ל N. הפיתוח של ריבוי סינפטית או על גיזום של הסינפסות אוילר הוא פלסטיק במהלך הפיתוח, מחלות שונות הברית^3,4,6,10. מסיבה זו, אפיון ריבוי סינפטית יש השלכות חשובות להבנת את היעילות של ההעברה הסינאפסית על בריאות ומחלה. טכניקות, כגון מיקרוסקופ אלקטרונים ניתן לזהות ראיות מבניות של ריבוי סינפטית על ידי גילוי מספר מגעים סינפטית שמקורם הדנדריטי לאקסון אותו על גבי אותו נוירון postsynaptic^{11,12, 13,14}. עם זאת, multisynapses מזוהה מבחינה מבנית האלו ניתן באופן פונקציונלי שקט^15,16. ירידה תפקודית מדוקדקת של N דורש טכנית מאתגר גישות אלקטרופיזיולוגיות, כגון הקלטות שלם-תא לזווג אשר יכול לזהות אם חיבור נתון יש מספר אתרי פרסום פונקציונלי מינימלית גישות גירוי שואפים לגייס של האקסון בשם יחיד.

ב פרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה פשוטה עבור הערכת ריבוי סינפטית על ידי אימוץ שיטה שפותחה במקור מאת Hsia ואח '². טכניקה זו כרוכה המדידה של ספונטנית מגירסה (sPSCs), mPSCs באמצעות תיקון שלם-תא קלאמפ אלקטרופיזיולוגיה, אשר מאפשר לנו לאמוד את מידת הריבוי סינפטית על-פני כל כניסות ליציאה נוירון מסוים.  כפי שהוגדרו בעבר, סינפטית ריבוי משקף את המספר של הסינפסות בין נוירון קדם ו postsynaptic נתון. אם הסינפסות מרובים גייסו בסנכרון ידי פוטנציאל הפעולה, תהיה הסתברות גבוהה של סיכום זמני של הפרט מגירסה (קרי quantal), יצירת של משרעת גדולה PSC.  בהקלטות mPSC (איזה פוטנציאל פעולה הנחסמים על-ידי TTX), ההסתברות של סיכום זמני של הפרט mPSCs (שאינם סינכרוני) הוא נמוך. באמצעות רציונל זה, ריבוי סינפטית יכול להיות מוערך על-ידי השוואת את משרעת sPSC (עם פוטנציאל הפעולה תלוית שחרור) משרעת mPSC.

כדי לבחון את קיומו של ריבוי אנו מתארים ארבעה ניסויים וניתוחים שלהם glutamatergic EPSCs כדוגמא. לעומת זאת, אותה גישה יכול לשמש עבור הצום שידור GABAergic/glycinergic (IPSCs). תירוץ קצר עבור כל הניסוי המתואר להלן. ראשית, כפי שהוסבר לעיל, יכול להיות מוערך ריבוי סינפטית על-ידי השוואת את משרעת של sEPSCs כדי mEPSCs. ישנם שתי דרישות גישה זו; אקסונים presynaptic 1) חייב לירות מספר מספיק של פוטנציאל פעולה במהלך ההקלטה, ועל 2) P_r להיות גבוהה כך הסינפסות מרובים שחרור נוירוטרנסמיטר בעת ההגעה של פוטנציאל הפעולה. על מנת לעמוד בדרישות אלה, sEPSCs הן שהוקלט לראשונה ב נמוך Ca^{2 +} מלאכותי השדרתי (כלנית חדד), לאחר מכן הקליט בנוכחות ריכוז נמוך של אנטגוניסט ערוץ K⁺ , פמפרידין (4-AP) כדי להגדיל את הפעולה ירי פוטנציאל ו- P_r. ואז פוטנציאל הפעולה ירי חסומה על-ידי TTX ו- Pr הופחתו ממותגת מתח Ca^{2 +} ערוץ חוסם Cd^{2 +}. משרעת של sEPSCs (עם 4AP) בהשוואה לזה של mEPSC (עם 4AP, TTX ו Cd^{2 +}). הניסוי השני, Ca^{2 +} מוחלף על-ידי equimolar Sr^{2 +} ב חנה המבר כדי בטל סינכרון שלפוחית שחרור. כפי Ca^{2 +} נדרש לשחרור סינכרונית של שלפוחית, החלפת עם Sr^{2 +} אמור לחסל את sEPSCs משרעת גדולה זה מרמז על ריבוי. שלישית, mechanistically, ריבוי יכול לנבוע גם קשרים סינפטיים מרובים באותו נוירון postsynaptic או שחרור multivesicular (קרי מספר שלפוחית שוחרר איש קשר סינפטית יחיד)^17,18. כדי להבדיל בין שני סוגים של ריבוי, הניסוי השלישי משתמש עם זיקה נמוכה, מהיר בריא תחרותי אנטגוניסט של אמפא רצפטורים, γ-D-glutamylglycine (γ-DGG)^17,18 כדי לקבוע אם גדול sEPSC הם התוצאה של סיכום טמפורלית הסינפסות עצמאית או שחרור multivesicular פועל על אוכלוסיה חופפים של קולטני postsynaptic. אם האירועים משרעת גדולה נובעים שחרור multivesicular, וγ-DGG יהיה פחות יעיל עיכוב sEPSCs בהשוואה קטן יותר גדול יותר, ואילו sEPSCs גדולים הנובעים מן הסיכום הטמפורלי של אנשי קשר מרובים סינפטית יושפעו באופן דומה על-ידי Γ-DGG. במהלך הניסוי הרביעי, שיטה יותר פיזיולוגית משמש כדי לשפר את פוטנציאל הפעולה בירי, כלומר מביא לגירוי סינפטית. התפרצויות של פעילות סינפטית יכול transiently עלייה/להקל על פוטנציאל הפעולה הספונטנית ירי ושחרור ההסתברות afferents מגורה. לכן, גישה זו מאפשרת ריבוי להפגין בצורה יותר פיזיולוגית.

הפרוטוקול הבא מתאר את שיטת עבור ניסויים אלה ברקמת היפותלמי העכבר. באופן ספציפי, משמשים corticotropin נוירונים הורמון (CRH) שיחרור של גרעין paraventricular ההיפותלמוס (PVN). אנו מתארים את נהלי ביצוע תיקון שלם-תא קלאמפ אלקטרופיזיולוגיה, להסביר את הניסויים ספציפיים כדי לבדוק את הריבוי סינפטית.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

ניסויים בבעלי חיים כל המאושרים על ידי ועדת אכפת של מאוניברסיטת מערב אונטריו לפי המועצה הקנדית על הנחיות טיפול בעלי חיים (AUP #2014-031) של בעלי חיים.

1. פתרונות

1. פתרון עם פרוסות
   1. עיין טבלה 1 לקבלת ההרכב של הפתרון עם פרוסות.
   2. להכין פתרון מניות 20 x מראש ואחסן אותו ב 4 ° C עד כחודש.
   3. 1 x עם פרוסות הפתרון, להמיס₃NaHCO, גלוקוז, סוכרוז ddH₂O, והוסף את המניה 20 x. להבטיח osmolarity בין mOsm 315-320 ולאחסן את הפתרון עבור לא יותר משבוע 1-4 מעלות צלזיוס.
   4. למלא שני בקבוקונים עם 100 מ של בציעת פתרון, לכסות אותם עם מצלמות-מיקרוסקופים. מקררים את הפתרון במקפיא עד הפתרון הופך להיות קפוא (כ 20 דקות במקפיא-80 ° C). באמצעות צינור פיזור גז, בועה שני בקבוקונים ששיספתי פתרון ב- 95% או₂/5% CO₂ במשך 20 דקות על קרח.

	פתרון ריכוזי (מ מ)
	חותך	חנה המבר נורמלי	Ca נמוך2 + כלנית חדד	חנה המבר Sr+	פיפטה/פנימי
NaCl	87	126	126	126	-
אשלגן כלורי	2.5	2.5	2.5	2.5	8
CaCl2	0.5	2.5	0.5	-	-
SrCl2	-	-	-	2.5	-
MgCl2	7	1.5	2.5	1.5	2
2PO NaH4	1.25	1.25	1.25	1.25	-
NaHCO3	25	26	26	26	-
גלוקוז	25	10	10	10	-
סוכרוז	75	-	-	-	-
K-gluconate	-	-	-	-	116
נה-gluconate	-	-	-	-	12
HEPES	-	-	-	-	10
K2-EGTA	-	-	-	-	1
K2ATP	-	-	-	-	4
נה3GTP	-	-	-	-	0.3

טבלה 1: ההרכב של פתרונות שונים.

2. כלנית חדד (עבור תחזוקה ושחזור פרוסה)
   1. עיין טבלה 1 לקבלת הרכב כלנית חדד.
   2. להכין פתרון מניות 20 x מראש ואחסן אותו ב 4 ° C עד כחודש.
   3. עבור 1 x כלנית חדד, להמיס NaHCO₃ וגלוקוז ddH₂O ולהוסיף את המניה 20 x. ודא osmolarity בין mOsm 298-300. השתמש הפתרון תוך יום אחד.
3. כלנית חדד (נמוך Ca^{2 +} עבור הקלטה)
   1. עיין טבלה 1 לקבלת ההרכב של Ca^{2 +} יצחק גרגיר נמוך.
   2. להכין פתרון מניות 20 x מראש ואחסן אותו ב 4 ° C עד כחודש.
   3. 1 x Ca נמוך^{2 +} כלנית חדד, להמיס NaHCO₃ וגלוקוז ב ddH2O ולהוסיף 20 x (CaCl₂ ו- MgCl₂ חינם) מניות, CaCl₂ ו- MgCl₂ כדי לציין ריכוזים. ודא osmolarity בין 298-300. השתמש הפתרון תוך יום אחד.
4. כלנית חדד (Sr^{2 +} הקלטה)
   1. עיין טבלה 1 לקבלת ההרכב של Sr^{2 +} כלנית חדד.
   2. להכין פתרון מניות 20 x מראש ואחסן אותו ב 4 ° C עד כחודש.
   3. 1 x Sr^{2 +} כלנית חדד, להמיס NaHCO₃ וגלוקוז ddH₂O ולהוסיף 20 x (CaCl₂ ו- MgCl₂ חינם) מניות, SrCl₂ ו- MgCl₂ כדי לציין ריכוזים. ודא osmolarity בין 298-300. השתמש הפתרון תוך יום אחד.
5. פתרון פנימי
   1. עיין טבלה 1 לקבלת ההרכב של הפתרון הפנימי מבוסס gluconate-K.
   2. כדי להפוך את 20 מ של הפתרון הפנימי, להוסיף 15 מ"ל של מים כיתה ביולוגיה מולקולרית שפופרת 50 מ. בצע את השלבים הבאים על הקרח.
   3. הכינו הפתרונות הבאים מבעוד מועד על ריכוזי 1 מ' מניות ב ביולוגיה מולקולרית כיתה מים. להוסיף (ב מ ל): K 2.32-gluconate, 0.24 Na-gluconate, 0.20 HEPES, 0.16 אשלגן כלורי, 0.05 K2-EGTA, MgCl 0.04₂ כדי הצינור 50 מ ל.
   4. להוסיף 100 µL של 0.3 M נה₃GTP.
   5. שוקל מ"ג 44.08 של K₂ATP צינור microcentrifuge 2 מ"ל, להוסיף 1 מ"ל של מים כיתה ביולוגיה מולקולרית, לאחר מכן להוסיף שפופרת 50 מ.
   6. להתאים את ה-pH ל 7.2-7.4 עם 1 מ' KOH. ודא osmolarity בין mOsm 283-289.

2. פרוסה הכנה

1. הכנת כלים
   1. להוסיף 200 מ של חנה המבר לחדר התאוששות (בנוי גביע 250 מ עם 4 בארות, כילות) ולמקם לחדר התאוששות באמבט מים (35 ° C).
   2. מכסה התא עם סרט פרפין, כל הזמן בועה של כלנית חדד עם 95% או₂/5% CO₂ באמצעות צינור הפיזור זכוכית לפחות 20 דקות.
   3. להכין הקרע על-ידי הגדרת את הכלים (, בזווית בסדר מספריים אזמל, מלקחיים, מברשת צבע יפה, כף של פלסטיק).
   4. ממלאים מזרק 60 מ כ 15 מ"ל של הפתרון עם פרוסות כקרח מהשלב 1.1.4.
   5. להכין פלטפורמת לנתיחה על ידי הנחת נייר סינון על המכסה של צלחת היטב.
   6. להכין את החדר עם פרוסות על-ידי הצבתו במגש קרח וממלאים את המגש עם קרח.
   7. להגדיר את vibratome על-ידי אבטחת להב חד פעמיות ב בעל להב.
   8. הפוך פיפטה של העברה על ידי שבירת קצה פיפטה פסטר, הצבת דרך הנורה גומי מעל הקצה השבור.
2. לנתח מוח העכבר
   1. עזים ומתנגד החיה בתוך תא רווי איזופלוריין 4% עד רפלקסים בעמוד השדרה נעדרים.
   2. לערוף את החיה באמצעות גיליוטינה, להסיר במהירות את המוח.
      1. עושים חתך קו האמצע עם להב סכין מס 22 מ rostral כדי סימטרית.
      2. רוחבית לקלף את הקרקפת בכל צד של הראש.
      3. השתמש בסדר מספריים כדי לגזור את הגולגולת מצד אחד מן סימטרית אל rostral (כולל את הצד של עצמות המצח), באמצעות התראה שלא יגרמו נזק למוח.
      4. שימוש מלקחיים להרים את פיסת הגולגולת במהירות מגניב המוח עם 15 מ"ל של קרח פתרון עם פרוסות באמצעות המזרק מהשלב 2.1.4 לסירוגין המוח.
      5. הרם את המוח מחוץ לגולגולת.
      6. המקום המוח באחת ספלים מלאים פתרון עם פרוסות כקרח (מתוך שלב 1.1.4) מבעבע עם 95% או₂/5% CO₂.
3. להכין פרוסות של העכבר היפותלמוס
   1. לחסום את המוח לאזור המוח הרצוי ולחתוך זווית (למשל, עבור הילתית פרוסות היפותלמי, לקצץ את הרקמה rostral הצנטר ולא סימטרית פונס באמצעות להב ו להבטיח הבלוק סימטרית של משטח שטוח מאונך לבסיס של המוח).
   2. באמצעות פיסת נייר סינון לחתוך, לאסוף את המוח מהצד הקדמי והדבק את הצד האחורי לצלחת אחזקות באמצעות דבק מיידית.
   3. מקם את הצלחת להחזיק אל החדר עם פרוסות ובמהירות למלא את החדר עם פרוסות פתרון מ הספל השני בשלב 1.1.4.
   4. אבטח את המגש עם פרוסות של הקאמרית וקרח על vibratome.
   5. להגדיר את האזור עם פרוסות (anterior ואת אחורי אל המוח) ולהתחיל לחתוך פרוסות הילתית עובי מיקרומטר 250. מומלץ פרמטרים: מהירות 0.10 מ"מ/s, משרעת 2 מ מ.
   6. חתוך לפרוסות לגודל המתאים לאזור המוח הרצוי.
   7. לשחזר את הפרוסות ב 35 מעלות צלזיוס למשך 30-45 דקות. לאחר מכן, להסיר לחדר התאוששות מהאמבטיה התחממות כדור הארץ, לאפשר את הפרוסות לשחזר בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות נוספות פרוסות לשמור בטמפרטורת החדר למשך שארית היום ולהמשיך בועה לאמבטיה. כל הזמן עם 95% או_2%/5 CO₂ .

3. תיקון שלם-תא ClampRecording

1. משוך את פיפטות תיקון
   1. באמצעות הפרמטרים המוצע עבור התא-כל הקלטה ממצד ידני של פולר פיפטה, למשוך תיקון פיפטות זכוכית חומה עבה כדי התנגדות פיפטה של 3-5 MΩ.
   2. שימוש microsyringe (מסחרי או תוצרת בית), מילוי טיפ פיפטה עם פתרון פנימי מסונן. אל microsyringe, לשרוף את קצה מזרק 1 מ"ל ומאפשרים את הטיפ ליפול יצירת קנס ארוך עצה.
2. להשיג את תצורת כל-תא
   1. מקם את ההקלטה פיפטה מעל הפרוסה וההיסט פיפטה הנוכחי במצב קלאמפ מתח. חלות לחץ חיובי קל פיפטה ונעל את צימוד.
   2. בחר תא בריא עם ממברנה ללא פגע ולאחר לגשת לתא עם פיפטה. הלחץ אמור לגרום הפרעה קלה ברקמות (כלומר גל איטי ברקמה בעת הזנת).
   3. לאט לאט ממשיכים להביא את פיפטה קרוב יותר אל התא באמצעות תנועה באלכסון עד פיפטה טפסים גומת חן קטנות על פני התא.
   4. שחרר את המנעול! הלחץ. התא תתחיל להקים גושפנקה, ההתנגדות יגדל מעל 1 GΩ. מתח קלאמפ, להחזיק את התא ב-68 mV.
   5. מעט משוך מן התא באלכסון כדי להסיר לחץ עודף מהתא.
   6. לפצות על קיבוליות פיפטה מהיר ואיטי.
   7. החל יניקה קצרה דרך הצינור מחובר למחזיק פיפטה לפרוץ דרך התא ולקבל כל-תא תצורה.
   8. עבור למצב התא על הקרום מבחן חלון באלקטרופיזיולוגיה חדרי קירור והקפאה, ניתוח תוכנה (לדוגמה, Clampex).
   9. לפני כל הקלטה קלאמפ מתח, לבצע בדיקה ממברנה באמצעות תוכנה זהה, להקליט את הפרמטרים הרלוונטיים בספר מעבדה (התנגדות הממברנה הגישה התנגדות, קיבול).
   10. לשמור על הטמפרטורה של האמבטיה הקלטה ב 27 – 30 מעלות צלזיוס, קצב הזרימה ב 1.5-2.0 mL/min לניסויים הבאים.

4. ריבוי ניסויים

1. ניסוי 1: הערכת הריבוי באמצעות 4-AP
   1. מתח קלאמפ, להחזיק את התא ב-68 mV. באמצעות תוכנה זהה, להקליט את sEPSCs תוך פרפוזיה האמבט עם Ca^{2 +} יצחק גרגיר נמוך. שיא לפחות 5 דקות לאחר תחילת כל-תא התצורה כדי לוודא הקלטה בסיסית יציבה כמו פעילות סינפטית עשויה להיות גבוהה זמן קצר לאחר פריצת הדרך של הקרום.
   2. שימוש של micropipette, להוסיף 4-AP חנה המבר ולהחיל אמבט 30 מיקרומטר, 4-AP. שיא sEPSCs לפחות 10 דקות לקבל את האפקט המלא.
   3. להוסיף 0.5 מיקרומטר TTX ו- 10 מיקרומטר תקליטור^{2 +} יצחק גרגיר עם 4-AP ולהקליט את mEPSCs לפחות 10 דקות.
   4. לניתוח במצב לא מקוון, השתמש את 1דקות. האחרונה של התוכנית הבסיסית מיד לפני היישום של 4-AP (ב Ca נמוך^{2 +} כלנית חדד), את ה-10 דקות של יישום 4-AP, את ה-10 דקות של TTX יישום.
2. ניסוי 2: בטל סינכרון שלפוחית לשחרר באמצעות Sr^{2 +}
   1. בזמן פרפוזיה האמבט עם נורמלי Ca^{2 +} כלנית חדד (זהה כלנית חדד אמבטיה) הרשומה sEPSCs לפחות 5 דקות.
   2. מעבר Ca^{2 +} חנה המבר נורמלי ולהתחיל פרפוזיה Sr^{2 +} כלנית חדד (מתוך שלב 1.4) ו- sEPSCs שיא.
   3. לניתוח במצב לא מקוון, כדי לקבוע אם sEPSCs משרעת גדולה בשל שחרורו סינכרונית של שלפוחית, להשוות את 1דקות. האחרון של נתוני בסיס (ב כלנית חדד נורמלי) 10^בתאנון לדקה של Sr^{2 +} חנה המבר יישום.
3. ניסוי 3: מבחן לשימוש שחרור multivesicular Γ- DGG
   1. ב נמוך Ca^{2 +} חנה המבר רשומה sEPSCs לפחות 5 דקות.
   2. להוסיף 30 מיקרומטר 4-AP חנה המבר דרך מערכת זלוף. SEPSCs שיא לפחות 10 דקות.
   3. להוסיף 200 מיקרומטר וγ-DGG חנה המבר עם 4-AP ולהקליט את sEPSCs לפחות 10 דקות.
   4. כמו ניסוי בקרה בתא נפרד, בצע שלבים 1-3 אבל להחיל ריכוז נמוך (125 ננומטר) של DNQX במקום γ-DGG.
   5. לניתוח במצב לא מקוון, לנתח את דקות האחרונות של כל יישום סמים.
4. ניסוי 4: לעורר תשומות מביא להגברת ירי פוטנציאל הפעולה.
   1. SEPSCs רשומה ב- Ca רגיל^{2 +} כלנית חדד.
   2. לעורר את afferents באמצעות אלקטרודת זכוכית monopolar מלא עם חנה המבר בקצב של 20 הרץ עבור 2 s ו- repeat 10 פעמים במרווח הבין-הפרץ של 20 שניות.
   3. לניתוח, להשתמש ms 5,000 לפני הגירוי הראשון כקו הבסיס להשוות ms 10-300 אחרי הגירוי הסופי, ומקבל השינוי הממוצע של משרעת ותדירות מעל 10 ניסויים.

5. ניתוח

1. לנתח את sEPSCs ואת mEPSCs באמצעות תוכנית מזהה ומנתח זרמי סינפטית (למשל, ניתוח מיני תוכנה).
   1. שימוש בתוכנה זו, השתמש בפרמטרים לזיהוי המוצע לגילוי אמפא קולטן EPSCs (או EPSCs קולטן GABA, אם הקלטת הזרמים מעכבות).
   2. השתמש בפונקציה ניתוח ללא הפסקה כדי לזהות EPSCs בהקלטה.
   3. סריקה ידנית כל ההקלטות על מנת להבטיח התוכנית באופן מדויק מזהה כל אירוע (למשל, להבטיח אירועים מתבצעת לא החמיץ או נספרים פעמיים).
   4. ייצוא נתוני האירוע להעתיקו ללוח ולהדביקו תוכנת ניהול נתונים (לדוגמה, Excel)
   5. לחשב את התדירות הממוצעת ו/או משרעת עבור כל הטיפול ולבצע את הבדיקות הסטטיסטיות הרלוונטיות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

הפרוטוקול הנ ל מתאר שיטה באמצעות תיקון שלם-תא קלאמפ אלקטרופיזיולוגיה לבחון את מידת הריבוי סינפטית, נוירונים היפותלמי העכבר כדוגמא. טכניקה זו הכנה פרוסה אמור להניב התאים קיימא בריא זה לא יש ממברנה נפוחות או גרעין (איור 1). כל שלב בפרוטוקול זה חשוב לבריאות של רקמות,...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

דרישה חשובה אחת עבור ניסוי אלקטרופיזיולוגיה מלחציים תיקון מוצלח הוא קבלת פרוסות/תאים בריאים. הפרוטוקול המתואר שלנו ממוטב היפותלמי פרוסות המכילות PVN נוירונים. אחרים במוח אזורים עשויים לדרוש ששינה פתרונות, עם פרוסות שיטות^21,22,23,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe	BD	309659
10 blade	Fisher Scientific/others	35698
22 blade	VWR/others	21909-626
22 μM syringe filters	Milipore	09-719-000
Adson foreceps	Harvard Instruments	72-8547
Angled sharp scissors	Harvard Instruments	72-8437
Clampex	Molecular Devices	pClamp 10
Double edge blade	VWR	74-0002
Filter paper	Sigma/others	1001090
Fine paintbrush	Fisher/various	15-183-35/various
Gas Dispersion Tube	VWR	LG-8680-120
Isoflurane	Fresenius Kabi/others	M60303
Krazy glue	various	various
Mini analysis	Synaptosoft	MiniAnalysis 6
Osmomoter	Wescor Inc	Model 5600
Parafilm	Sigma	PM-996
Pasteur pipette	VWR	14672-200
ph meter	Mettler Toledo	FE20-ATC
Rubber bulb	VWR	82024-550
Scalpel handle No. 3	Harvard Instruments	72-8350
Scalpel handle No. 4	Harvard Instruments	72-8356
Single edge blade	VWR	55411-050
Vibratome slicer	Leica	VT1200S
Water Purification System	Millipore	Milli-Q Academic A10
Well plate lid	Fisher/various	07-201-590/various
Chemicals/reagents
4-AP	Sigma	275875
BAPTA	molecular probes	B1204
CaCl2*2H2O	Sigma	C7902
CdCl2	sigma	202908
DNQX	Tocris	189
EGTA	Sigma	E3889
glucose	Sigma	G5767
HEPES	Sigma	H3375
K2-ATP	Sigma	A8937
KCl	Sigma	P9333
K-gluconate	Sigma	G4500
MgCl2*6H2O	Sigma	M2670
Molecular biology grade water	Sigma	W4502-1L
Na3GTP	Sigma	G8877
NaCl	Bioshop	SOD001.1
Na-gluconate	Sigma	S2054
NaH2PO4	Sigma	71504
NaHCO3	Sigma	S6014
Picrotoxin	sigma	P1675
SrCl	Sigma	255521
sucrose	Bioshop	SUC507.1
TTX	Alamone Labs	T-550
yDGG	Tocris	6729-55-1