Оценка синаптических кратности, используя поклеточного патч зажим электрофизиологии

Резюме

Здесь мы представляем протокол для оценки функциональных синаптических кратности, используя патч поклеточного зажим электрофизиологии острого мозга ломтиками.

Аннотация

В центральной нервной системе пара нейронов часто образуют несколько синаптических контактов и/или функциональных нейромедиатора релиз сайтов (синаптических кратности). Синаптических многообразие является пластика и изменения на протяжении развития и различных физиологических условиях, будучи важным определяющим фактором эффективности синаптической передачи. Здесь мы приводим экспериментов для оценки степени кратности синапсы, прекращения на данной постсинаптических нейрон, используя патч поклеточного зажим электрофизиологии острого мозга ломтиками. В частности мембраной запись используется для сравнения разницы между амплитуда спонтанное возбуждающих постсинаптических токов (sEPSCs) и миниатюрные возбуждающих постсинаптических токов (mEPSCs). Теория позади этот метод является, что афферентные входов, которые демонстрируют многообразие покажет большой, потенциал действия зависимой sEPSCs благодаря синхронного выхода, что происходит на каждом синаптического контакта. В отличие от этого потенциал действия независимый релиз (которая является асинхронным) будет генерировать меньше амплитуда mEPSCs. Эта статья рассматривается ряд экспериментов и анализа характеризовать существование синаптических кратности и требования и ограничения метода. Этот метод может быть применен к расследованию как различные поведенческие, фармакологическим или экологических мероприятий в vivo влияют на организацию синаптических контактов в областях различных мозга.

Введение

Синаптической передачи является основным механизмом для связи между нейронами и следовательно, мозга функции. Синаптической передачи также лабильных и может изменить его эффективности на основе зависящих от деятельности, а также ответ модулирующее сигналы¹. Таким образом рассмотрение синаптического функция был ключевым направлением исследований неврологии. Патч поклеточного зажим электрофизиологии — это универсальный метод, который позволяет нам понять, разработки экспериментальных проектов и анализ данных, углубленные биофизические и молекулярные механизмы синаптической передачи. Часто используемый подход, возможно благодаря простоте технику и концепции, является измерение миниатюрные возбуждающим/тормозной постсинаптический токов (mE / IPSCs) под напряжением зажим конфигурации^{2,3, 4 , 5 , 6}. отдельные mPSCs представляют поток ионов через ИОНОТРОПНЫХ постсинаптических рецепторов (например, АМПА и ГАМК-_А рецепторов) в ответ на привязку их соответствующих нейротрансмиттеров, выпустила Пресинаптический терминала ⁷ . Поскольку запись получается при наличии напряжения закрытый Na⁺ канала блокатор Тетродотоксин (TTX), потенциал действия независимые и выпуска обычно включает один синаптических пузырьков, содержащий нейромедиатора. Основываясь на этом предположении, средняя амплитуда mPSCs широко используется как сырой смету для квантильного размер, который представляет количество и функциональность постсинаптических рецепторов, против сайта сингл. С другой стороны частота mPSCs, как считается, представляют собой сочетание общего числа синапсов, прекращения на постсинаптической клетке и вероятность их средняя выпуска. Однако, эти параметры не измеряют другой переменной мультипликативность синапсы, или синаптических кратности, которая имеет важное значение для эффективности синаптической передачи.

Основываясь на квантильного теории синаптической передачи^7,8,9, сила данного соединения между парой нейронов зависит от трех факторов: количество функциональных синапсов (N), постсинаптического ответа на выпуск одного синаптических пузырьков (квантовый размер; Q) и вероятность нейромедиатора релиз (P-_r). Синаптических кратности эквивалентен N. Развитию синаптических кратности или обрезка мультипликативной синапсы — пластик на протяжении развития и различные болезни государства^3,4,6,10. По этой причине характеризующие синаптических кратность имеет важные последствия для понимания эффективности синаптической передачи в здоровье и болезни. Методы, такие как электронная микроскопия можно определить структурные доказательства синаптических кратности, обнаружение нескольких синаптических контактов, возникая от же аксон на же постсинаптических нейронов^{11,12, 13,14}. Однако эти структурно определенных multisynapses может быть функционально немого^15,16. Точное функциональные обследования N требует технически сложных электрофизиологических подходы, такие как парные поклеточного записей, которые можно определить ли данного соединения имеет несколько функциональных релиз сайтов и минимальным стимуляция подходы, которые стремятся нанимать одного предполагаемого аксон.

В этом протоколе мы опишем простой метод для оценки синаптических кратности, приняв метод, первоначально разработанный Hsia et al². Этот метод предполагает измерение спонтанного Чок (sPSCs) и mPSCs с помощью зажима электрофизиологии поклеточного патч, который позволяет нам оценить степень синаптических многообразие во всех материалов для данного нейрона.  Как ранее определенных, синаптических кратности отражает количество синапсов между данной предварительной и постсинаптических нейрона. Если несколько синапсы набираются в синхронности действий потенциал, будет высокой вероятностью височной суммирование отдельных (т.е. квантильного) Чок, создавая большую амплитуду PSC.  В записях mPSC (в котором потенциалы действия блокируются TTX), низка вероятность временной суммирование отдельных (не синхронный) mPSCs. Используя это обоснование, синаптических кратность можно оценить путем сравнения амплитуды СКТУ (с релиз действий потенциал зависимых) mPSC амплитуде.

Чтобы проверить существование множества мы описываем четырех экспериментов и их анализа с использованием глутаматергические EPSCs качестве примера. Однако, такой же подход может использоваться для быстрой передачи ГАМК/glycinergic (IPSCs). Ниже приводится краткое обоснование каждого эксперимента. Во-первых как объяснялось выше, синаптических кратность можно оценить путем сравнения амплитуды sEPSCs к mEPSCs. Существуют два требования для этого подхода; 1) Пресинаптический аксоны должен стрелять достаточное количество потенциалы действия во время записи, и 2) P_r должны быть высокой, так что несколько синапсы освобождение нейромедиатора по прибытии потенциал действия. Чтобы соответствовать этим требованиям, sEPSCs сначала записываются в низкой Ca^{2 +} искусственный спинномозговой жидкости (ФАГО) и затем записал присутствии низкой концентрации антагонистов канал K⁺ , 4-Aminopyridine (4-AP) для увеличения действий P_rи потенциальные увольнения. Затем огонь потенциал действия заблокирован TTX и Pr, снизился на закрытом напряжения Ca^{2 +} канала блокатор Cd^{2 +}. Амплитуда sEPSCs (с 4AP) по сравнению с mEPSC (с 4AP, TTX и Cd^{2 +}). Во втором эксперименте Ca^{2 +} заменяется эквимолярных Sr^{2 +} в фаго десинхронизироваться везикул выпуска. Как Ca^{2 +} требуется для синхронный выпуске везикулы, замена с Sr^{2 +} следует устранить sEPSCs большой амплитуды, которая свидетельствует о множественности. В-третьих, механически, многообразие может быть результатом либо несколько синаптических контактов же постсинаптических нейронов или multivesicular выпуска (то есть несколько везикулы, выпущенные в течение одного синаптического контакта)^17,18. Проводить различие между двумя типами кратности, третий эксперимент использует низкого сродства, быстро разъединять конкурентным антагонистом рецепторов АМПА, γ-D-glutamylglycine (γ-DGG)^17,18 , чтобы определить, является ли большой sEPSC являются результатом временной суммирование независимых синапсов или multivesicular релиз, действуя на перекрывающихся населения постсинаптических рецепторов. Если большой амплитуды события вытекают из multivesicular выпуска, γ-DGG будет менее эффективным в ингибирующих больше по сравнению с небольших sEPSCs, тогда как большой sEPSCs, которые возникают от височной суммирование нескольких синаптических контактов будут аналогичным образом затронуты Γ-DGG. В четвертом эксперимент более физиологический метод используется для повысить потенциал действия стрельбы, а именно афферентных синаптических стимуляции. Всплесков синаптической активности может временно увеличить/облегчить самопроизвольно потенциал действия стрельбы и выпуска вероятность стимулировали афферентов. Таким образом этот подход позволяет кратности проявляться в более физиологическим способом.

Следующий протокол описывает метод для проведения этих экспериментов в мыши гипоталамуса ткани. В частности используются АКТГ выпуская инкреть (ЦРБ) нейронов паравентрикулярного ядра гипоталамуса (ПВН). Мы описывать процедуры для проведения поклеточного патч зажим электрофизиологии и объяснить конкретные эксперименты для проверки синаптических кратности.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все эксперименты на животных утверждаются Комитетом животное уход из университета Западного Онтарио в соответствии с канадского Совета по животных уход Руководство (АУП #2014-031).

1. решения

1. Нарезки решение
   1. Обратитесь к таблице 1 для состава нарезки раствора.
   2. Заранее подготовить 20 x Стоковый раствор и хранить его на 4 ° C до 1 месяца.
   3. 1 x нарезки решения Растворите₃, глюкоза и сахароза в ddH₂O NaHCO и добавьте бульон 20 x. Убедитесь, что между 315-320 мОсм осмолярности и сохранить решение для не более чем на 1 неделю при 4 ° C.
   4. Залейте 100 мл нарезки решение двух стаканах и покрыть их с парафина. Холод решение в морозильник до тех пор, пока решение становится частично заморожен (приблизительно 20 минут в морозильник-80 ° C). С помощью трубки газа дисперсии, пузырь обоих стаканах нарезки решение с 95% O₂/5% CO₂ на 20 мин на льду.

	Концентрация раствора (мм)
	Нарезка	Нормальный фаго	Низкий Ca2 + фаго	Фаго SR+	Пипетка/внутреннего
NaCl	87	126	126	126	-
KCl	2.5	2.5	2.5	2.5	8
CaCl2	0.5	2.5	0.5	-	-
SrCl2	-	-	-	2.5	-
2 MgCl	7	1.5	2.5	1.5	2
NaH2PO4	1.25	1.25	1.25	1.25	-
NaHCO3	25	26	26	26	-
Глюкоза	25	10	10	10	-
Сахароза	75	-	-	-	-
K-глюконат	-	-	-	-	116
Na глюконат	-	-	-	-	12
HEPES	-	-	-	-	10
K2-EGTA	-	-	-	-	1
K2ATP	-	-	-	-	4
Na3GTP	-	-	-	-	0,3

Таблица 1: Состав различных решений.

2. Фаго (для обслуживания и восстановления срез)
   1. Для состава фаго обратитесь к таблице 1 .
   2. Заранее подготовить 20 x Стоковый раствор и хранить его на 4 ° C до 1 месяца.
   3. 1 x фаго растворяют NaHCO₃ и глюкозы в ddH₂O и добавьте бульон 20 x. Убедитесь, что между 298-300 мОсм осмолярности. Используйте решение в течение 1 дня.
3. Фаго (низкий Ca^{2 +} для записи)
   1. Для состава низкой Ca^{2 +} фаго обратитесь к таблице 1 .
   2. Заранее подготовить 20 x Стоковый раствор и хранить его на 4 ° C до 1 месяца.
   3. 1 x низкой Ca^{2 +} фаго, растворяют NaHCO₃ и глюкозы в ddH2O и добавить 20 x (CaCl₂ и MgCl₂ бесплатно) запасов, CaCl₂ и₂ MgCl для указанной концентрации. Убедитесь, что между 298-300 осмолярности. Используйте решение в течение 1 дня.
4. Фаго (Sr^{2 +} для записи)
   1. Для состава Sr^{2 +} фаго обратитесь к таблице 1 .
   2. Заранее подготовить 20 x Стоковый раствор и хранить его на 4 ° C до 1 месяца.
   3. 1 x Sr^{2 +} фаго, растворяют NaHCO₃ и глюкозы ddH₂O и добавить 20 x (CaCl₂ и MgCl₂ бесплатно) запасов, SrCl₂ и₂ MgCl для указанной концентрации. Убедитесь, что между 298-300 осмолярности. Используйте решение в течение 1 дня.
5. Внутреннее решение
   1. Обратитесь к таблице 1 для состава K-глюконат на основе внутреннего решения.
   2. Чтобы сделать 20 мл раствора внутреннего, добавьте 15 мл воды молекулярной биологии класса Тюбик 50 мл. Выполните последующие шаги на льду.
   3. Подготовьте следующие решения заблаговременно до 1 М складе концентраций в молекулярной биологии класса воды. Добавить (в мл): 2.32 K-глюконат, 0.24 Na глюконат, 0.20 HEPES, 0,16 KCl, 0,05 K2-EGTA, 0,04 MgCl₂ с Тюбик 50 мл.
   4. 100 мкл 0,3 М Na₃ГТФ.
   5. Весят 44.08 мг K₂ATP в 2-мл пробирку microcentrifuge и добавьте 1 mL молекулярной биологии класса воды, затем добавить 50 мл трубки.
   6. Отрегулируйте pH 7,2-7.4 с 1 M Кох. Убедитесь, что между 283-289 мОсм осмолярности.

2. фрагмент подготовка

1. Подготовить инструменты
   1. Добавить 200 мл фаго восстановления палате (построена из 250 мл стакан с 4 скважины и сетка) и место восстановления камеры на водяной бане (35 ° C).
   2. Обложка камеры с пленкой парафина и постоянно пузырь фаго с 95% O₂/5% CO₂ с помощью стеклянной трубки дисперсии для по крайней мере 20 мин.
   3. Подготовьте для вскрытия путем создания инструментов (скальпель, угловой тонкой ножницы, пинцет, тонкой кистью, пластиковой ложкой).
   4. Заполните 60 мл шприц с примерно 15 мл раствора ледяной нарезки из шага 1.1.4.
   5. Подготовьте платформу рассечение, поместив документ фильтр на крышке хорошо пластины.
   6. Подготовьте режущей камеры, поместив его в лоток для льда и заполнение лоток со льдом.
   7. Настройка vibratome путем обеспечения одноразовые лезвие в держатель лезвий.
   8. Сделайте передачу пипетки, разбив кончиком пипетки Пастера и надевание резиновую грушу на сломанной конца.
2. Вскрыть мозг мыши
   1. Анестезировать животного в камере, насыщенных с 4% изофлюрановая до тех пор, пока отсутствуют рефлексы спинного мозга.
   2. Обезглавить животное с помощью гильотины и быстро удалить мозга.
      1. Сделайте срединной линии разреза с лезвием скальпеля № 22 от ростральной к хвостовой.
      2. Боков Пил кожи головы на каждой стороне головы.
      3. Использование тонкой ножницы, чтобы вырезать черепа на одной стороне от хвостового ростральной (включая части лобной кости), использование осторожно чтобы не повредить мозг.
      4. Используйте корнцанг снять часть черепа от мозга и быстро охладить мозга с 15 мл раствора ледяной нарезки, используя шприц с шагом 2.1.4.
      5. Поднимите мозг из черепа.
      6. Место мозга в одном из мензурки, наполненный ледяной нарезки раствор (из шага 1.1.4) кипела с 95% O₂/5% CO₂.
3. Подготовить ломтики мыши гипоталамус
   1. Блокировать мозга для области желаемого мозг и сократить угол (например, корональных гипоталамуса фрагментов, обрезать ткани ростральной зрительных нервов и каудально к Понс, с помощью лезвия и обеспечить хвостового блок имеет плоскую поверхность перпендикулярно основанию мозга).
   2. С помощью отрезанный кусок фильтровальной бумаги, подобрать мозг от передней стороны и клей с задней стороны Холдинг пластине используя мгновенный клея.
   3. Быстро поместить пластину холдинг в зале нарезки и заполнить камеры с нарезки решение от второй стакан на шаге 1.1.4.
   4. Закрепите режущей камеры и льда лоток на vibratome.
   5. Определить области срезов (передний и задний мозг) и начать нарезки 250 мкм толщина корональные срезы. Рекомендуемые параметры: скорость 0,10 мм/с, амплитуда 2 мм.
   6. Подрезать ломтики до соответствующего размера для области желаемого мозг.
   7. Восстановите ломтики на 35 ° C за 30-45 мин. Затем удалите восстановления камеры от потепления бани и позволяют фрагментов восстановить при комнатной температуре на дополнительные 30 мин ломтики держать при комнатной температуре для остальной части дня и продолжать пузырь ванне постоянно с 95% O₂/5% CO₂ .

3. поклеточного патч ClampRecording

1. Вытяните патч пипетки
   1. Используя предлагаемые параметры для всего ячейки записи из пипетки съемник руководство, тяните патч пипетки из стекла толщиной стеной для пипетки сопротивление 3-5 MΩ.
   2. Использование microsyringe (коммерческие или домашний), заполните наконечник пипетки с отфильтрованной внутреннего решения. Сделать microsyringe, сжечь кончик 1 мл шприц и позволить кончик падать создание штрафом длинный наконечник.
2. Получение конфигурации поклеточного
   1. Место записи пипеткой чуть выше фрагмент и смещение пипеткой ток в режиме напряжение зажим. Применять небольшое положительное давление на дозатор и зафиксируйте краном.
   2. Выберите здоровых клеток с нетронутыми мембраны и подход ячейку с пипеткой. Положительное давление должно вызывать незначительные нарушения в тканях (т.е. медленные волны в тканях при входе).
   3. Медленно продолжать доводить пипеткой ближе к ячейке с помощью диагональные движения до тех пор, пока пипеткой образует небольшой ямочка на поверхности клеток.
   4. Разблокирование под положительным давлением. Ячейка будет начать сформировать печать и сопротивление будет увеличиваться выше 1 GΩ. В напряжение зажим, занимают ячейку в-68 МВ.
   5. Слегка оторваться от ячейки по диагонали для удаления избыточного давления от ячейки.
   6. Компенсации для быстрой и медленной пипеткой емкости.
   7. Примените краткий всасывания через трубку, подключенных к держателю пипеткой прорваться через ячейки и получить поклеточного конфигурации.
   8. Переключение в режим ячейки на мембране теста окно в электрофизиологии сбора данных и анализа программного обеспечения (например, Clampex).
   9. Перед каждой мембраной записи выполнить тест мембраны, используя то же программное обеспечение и записывать соответствующие параметры в книге лаборатории (мембраны сопротивление, сопротивление доступа и емкости).
   10. Поддерживать температуру ванны записи на 27 – 30 ° C и скорости потока в 1,5-2,0 мл/мин для последующих экспериментов.

4. множественность эксперименты

1. Эксперимент 1: оценки кратности, используя 4-AP
   1. В напряжение зажим, занимают ячейку в-68 МВ. С помощью того же программного обеспечения, записи sEPSCs во время perfusing Ванна с низкой Ca^{2 +} фаго. Запись для по крайней мере 5 минут после начала поклеточного конфигурации для обеспечения стабильной базовой записи как синаптической активности может быть высокой вскоре после пробоя мембраны.
   2. С помощью микропипеткой, добавить 4-AP фаго и ванна применять 30 мкм 4-ю запись sEPSCs для по крайней мере 10 мин для получения полного наркотический эффект.
   3. Добавить 0,5 мкм TTX и 10 мкм Cd^{2 +} фаго с 4-AP и запись mEPSCs для по крайней мере 10 мин.
   4. Для анализа в автономном режиме используйте последний 1 мин базовых непосредственно перед применением 4-AP (в низких Ca^{2 +} фаго), 10 мин приложения 4-AP и 10 мин TTX приложения.
2. Эксперимент 2: десинхронизироваться везикул выпуска с помощью Sr^{2 +}
   1. Во время perfusing Ванна с нормальной Ca^{2 +} Фаго (так же, как ванна фаго) запись sEPSCs для по крайней мере 5 минут.
   2. Переход от нормального Ca^{2 +} фаго и начать perfusing Sr^{2 +} Фаго (из шага 1.4) и записи sEPSCs.
   3. Для анализа в автономном режиме чтобы определить, являются ли большой амплитуды sEPSCs из-за синхронный выпуске везикулы, Сравните последний 1 мин базовой линии (в нормальных фаго) к 10-^й минуте Sr^{2 +} фаго приложения.
3. Эксперимент 3: тест на multivesicular выпуска с помощью Γ- DGG
   1. В низких Ca^{2 +} фаго запись sEPSCs для по крайней мере 5 минут.
   2. Добавьте 30 мкм 4-AP фаго через систему перфузии. Запись sEPSCs для по крайней мере 10 мин.
   3. Добавить 200 мкм γ-DGG фаго с 4-AP и запись sEPSCs для по крайней мере 10 мин.
   4. Как управления эксперимента в отдельную ячейку, выполните шаги 1-3 но применить низкой концентрации (125 Нм) от DNQX вместо γ-DGG.
   5. Для автономных анализа анализа последний мин каждого применения наркотиков.
4. Эксперимент 4: Стимулировать афферентные вклад увеличить потенциал действия стрельбы.
   1. Запись sEPSCs в обычных Ca^{2 +} фаго.
   2. Стимулировать афферентов, используя монополярной Стеклянный электрод, наполненный фаго со скоростью 20 Гц для 2 s и повторите 10 раз с интервалом между взрыв 20 сек.
   3. Для анализа используйте 5000 мс перед первым стимулом как базовый и сравнить с 10-300 мс после окончательного стимул, а затем взять среднее изменение амплитуды и частоты свыше 10 испытаний.

5. анализ

1. Анализ sEPSCs и mEPSCs, с помощью программы, которая определяет и анализирует синаптических течения (например, Mini анализ программного обеспечения).
   1. С помощью этого программного обеспечения, используйте параметры предложенных обнаружения для обнаружения АМПА рецептора EPSCs (или EPSCs рецептор ГАМК если запись ингибирующее токов).
   2. Использование функции нон-стоп анализа для обнаружения EPSCs в записи.
   3. Вручную проверять каждую запись для обеспечения программы точно обнаружение каждое событие (например, обеспечить события не являются пропустил или учтен дважды).
   4. Экспортируйте данные события, копируя его в буфер обмена и вставьте его в программное обеспечение управления данными (например, Excel)
   5. Расчет средней частоты и/или амплитуды для каждого препарата лечения и выполнять соответствующие статистические анализы.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Вышеупомянутый Протокол описывает метод для использования электрофизиологии зажим поклеточного патч для изучения степени синаптических кратности, с помощью мыши нейронов гипоталамуса в качестве примера. Эта техника подготовки фрагмента следует дать здоровые жизн?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Одно из важных требований для успешного патч зажим электрофизиологии эксперимента является получение здоровых фрагменты/клеток. Наши описывается протокол оптимизирован для гипоталамуса фрагментов, которые содержат PVN нейронов. Другие мозга, которая районах может потребоваться изме?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe	BD	309659
10 blade	Fisher Scientific/others	35698
22 blade	VWR/others	21909-626
22 μM syringe filters	Milipore	09-719-000
Adson foreceps	Harvard Instruments	72-8547
Angled sharp scissors	Harvard Instruments	72-8437
Clampex	Molecular Devices	pClamp 10
Double edge blade	VWR	74-0002
Filter paper	Sigma/others	1001090
Fine paintbrush	Fisher/various	15-183-35/various
Gas Dispersion Tube	VWR	LG-8680-120
Isoflurane	Fresenius Kabi/others	M60303
Krazy glue	various	various
Mini analysis	Synaptosoft	MiniAnalysis 6
Osmomoter	Wescor Inc	Model 5600
Parafilm	Sigma	PM-996
Pasteur pipette	VWR	14672-200
ph meter	Mettler Toledo	FE20-ATC
Rubber bulb	VWR	82024-550
Scalpel handle No. 3	Harvard Instruments	72-8350
Scalpel handle No. 4	Harvard Instruments	72-8356
Single edge blade	VWR	55411-050
Vibratome slicer	Leica	VT1200S
Water Purification System	Millipore	Milli-Q Academic A10
Well plate lid	Fisher/various	07-201-590/various
Chemicals/reagents
4-AP	Sigma	275875
BAPTA	molecular probes	B1204
CaCl2*2H2O	Sigma	C7902
CdCl2	sigma	202908
DNQX	Tocris	189
EGTA	Sigma	E3889
glucose	Sigma	G5767
HEPES	Sigma	H3375
K2-ATP	Sigma	A8937
KCl	Sigma	P9333
K-gluconate	Sigma	G4500
MgCl2*6H2O	Sigma	M2670
Molecular biology grade water	Sigma	W4502-1L
Na3GTP	Sigma	G8877
NaCl	Bioshop	SOD001.1
Na-gluconate	Sigma	S2054
NaH2PO4	Sigma	71504
NaHCO3	Sigma	S6014
Picrotoxin	sigma	P1675
SrCl	Sigma	255521
sucrose	Bioshop	SUC507.1
TTX	Alamone Labs	T-550
yDGG	Tocris	6729-55-1