Evaluación de multiplicidad sináptica mediante electrofisiología Patch-clamp de celulares

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para la evaluación de la multiplicidad sináptica funcional utilizando electrofisiología de abrazadera de parche de célula entera en rebanadas de cerebro agudo.

Resumen

En el sistema nervioso central, un par de neuronas forman a menudo múltiples contactos sinápticos o sitios de liberación de neurotransmisor funcional (multiplicidad sináptica). Multiplicidad sináptica es de plástico y cambios a lo largo de desarrollo y en diferentes condiciones fisiológicas, siendo un factor determinante para la eficacia de la transmisión sináptica. Aquí, describimos experimentos para estimar el grado de multiplicidad de sinapsis que termina en una neurona postsináptica dada utilizando electrofisiología de abrazadera de parche de célula entera en rebanadas de cerebro agudo. Concretamente, grabación de pinza de voltaje se utiliza para comparar la diferencia entre la amplitud de las corrientes postsinápticas excitatorias espontáneas (sEPSCs) y miniatura corrientes postsinápticas excitatorias (mEPSCs). La teoría detrás de este método es que las entradas aferentes que exhiben multiplicidad mostrará sEPSCs grande, dependiente del potencial de acción debido a la liberación sincrónica que se produce en cada contacto sináptico. Por el contrario, lanzamiento independiente del potencial de acción (que es asincrónico) generará más pequeño amplitud mEPSCs. Este artículo describe un conjunto de experimentos y análisis para caracterizar la existencia de multiplicidad de synaptic y discute los requisitos y limitaciones de la técnica. Esta técnica puede aplicarse para investigar cómo las diferentes intervenciones conductuales, farmacológicas o ambientales en vivo afectan la organización de contactos sinápticos en diversas áreas del cerebro.

Introducción

Transmisión sináptica es un mecanismo fundamental para la comunicación entre las neuronas y por lo tanto, la función del cerebro. Transmisión sináptica es también lábil y puede cambiar su eficacia de una manera dependiente de la actividad, así como en respuesta a moduladores señales¹. Por lo tanto, examinar la función sináptica ha sido un foco clave de la investigación de la neurociencia. Electrofisiología de abrazadera de parche de células enteras es una técnica versátil que nos permite entender, por idear diseños experimentales y análisis de datos, profundidad mecanismos biofísicos y moleculares de la transmisión sináptica. Un enfoque comúnmente utilizado, quizás debido a la simplicidad de la técnica y el concepto, es la medida de miniatura excitatoria/inhibitoria postsináptica (mE / IPSCs) bajo la tensión de la abrazadera de configuración^{2,3, 4 , 5 , 6}. mPSCs individuales representan el flujo de iones a través de receptores ionotrópicos postsinápticos (por ejemplo, receptores AMPA y GABA_A ) en respuesta a la Unión de sus respectivos neurotransmisores liberados desde la terminal presináptica ⁷ . Porque la grabación se obtiene en presencia del voltaje-bloqueado Na⁺ canal bloqueador tetrodotoxin (TTX), el lanzamiento es independiente del potencial de acción y consiste normalmente en una sola vesícula sináptica que contiene el neurotransmisor. Partiendo de este supuesto, la amplitud media de mPSCs es ampliamente utilizada como una estimación cruda del tamaño cuántico, que representa el número y la funcionalidad de los receptores postsinápticos oponerse un sitio sencillo. Por otra parte, la frecuencia de mPSCs se considera representan una combinación del número total de sinapsis que termina en la célula postsináptica y la probabilidad de liberación promedio. Sin embargo, estos parámetros no miden otra variable-multiplicativity de sinapsis, o multiplicidad sináptica — que es importante para la eficacia de la transmisión sináptica.

Basado en la teoría cuántico de la transmisión sináptica^7,8,9, la fuerza de una conexión determinada entre un par de neuronas depende de tres factores: el número de sinapsis funcionales (N), el respuesta postsináptica a la liberación de una sola vesícula sináptica (tamaño cuántico; Q) y la probabilidad de liberación de neurotransmisor (P_r). Multiplicidad de Synaptic es equivalente a N. El desarrollo de multiplicidad de synaptic o la poda de las sinapsis multiplicativas es plástico a lo largo de desarrollo y en enfermedades diferentes Estados^3,4,6,10. Por ello, caracterizar multiplicidad sináptica tiene implicaciones importantes para la comprensión de la eficacia de la transmisión sináptica en salud y enfermedad. Técnicas como la microscopia electrónica pueden identificar evidencia estructural de multiplicidad sináptica mediante la detección de múltiples contactos sinápticos origina el axón mismo sobre la misma neurona postsynaptic^{11,12, 13,14}. Sin embargo, estos multisynapses estructuralmente identificados pueden ser funcionalmente silencioso^15,16. Examen funcional precisa de N requiere técnicamente difícil métodos electrofisiológicos, como pares grabaciones de celulares que pueden determinar si una conexión determinada tiene múltiples sitios de liberación funcional y mínima enfoques de estimulación que tienen como objetivo reclutar un solo axón putativo.

En este protocolo, se describe un método simple para estimar la multiplicidad sináptica mediante la adopción de un método desarrollado originalmente por Hsia et al². Esta técnica consiste en la medición de espontánea PSC (sPSCs) y mPSCs mediante electrofisiología de abrazadera de parche de células enteras, que nos permite estimar el grado de multiplicidad sináptica a través de todas las entradas a una determinada neurona.  Previamente definida, synaptic multiplicidad refleja el número de sinapsis entre la neurona pre y postsináptica dada. Si múltiples sinapsis son reclutadas en sincronía por un potencial de acción, habrá una alta probabilidad de suma temporal de PSC (es decir cuántico) individual, generando una mayor amplitud PSC.  En grabaciones de mPSC (en que los potenciales de acción son bloqueados por TTX), es baja la probabilidad de la suma temporal de los mPSCs (asíncronos). Utilizando este razonamiento, multiplicidad sináptica puede estimarse mediante la comparación de la amplitud de nacionales (con lanzamiento dependiente del potencial de acción) a la amplitud del mPSC.

Para examinar la existencia de multiplicidad Describimos cuatro experimentos y sus análisis mediante EPSCs glutamatérgica como ejemplo. Sin embargo, el mismo enfoque puede ser utilizado para la rápida transmisión de GABAergic/glycinergic (IPSCs). A continuación se describe una breve justificación para cada experimento. En primer lugar, como se explicó anteriormente, multiplicidad sináptica puede estimarse mediante la comparación de la amplitud de sEPSCs a mEPSCs. Existen dos requisitos para ello; axones 1) presinápticas deben disparar un número suficiente de potenciales de acción durante la grabación, y 2) P_r debe ser alta para que múltiples sinapsis liberan neurotransmisores a la llegada de un potencial de acción. Para cumplir estos requisitos, sEPSCs se registró por primera vez en baja Ca^{2 +} artificial líquido cerebroespinal (aCSF) y luego grabados en presencia de una concentración baja del antagonista de canales de K⁺ , 4-aminopiridina (4-AP) para aumentar la acción potencial disparo y P_r. Entonces potencial de acción de la leña se bloquea por TTX y Pr disminuido por un voltaje Ca^{2 +} bloqueador de canales de Cd^{2 +}. La amplitud de sEPSCs (con 4AP) es comparada con la de mEPSC (con 4AP, TTX y Cd^{2 +}). En el segundo experimento, Ca^{2 +} se sustituye por equimolar Sr^{2 +} en la aCSF a desincronizar la liberación de la vesícula. Como Ca^{2 +} se requiere para la versión sincrónica de vesículas, reemplazo con Sr^{2 +} debe eliminar la sEPSCs de gran amplitud que son indicativos de la multiplicidad. En tercer lugar, mecánico, multiplicidad puede resultar de cualquiera de los dos múltiples contactos sinápticos a la misma neurona postsináptica o liberación multivesicular (es decir, múltiples vesículas lanzadas dentro de un único contacto sináptico)^17,18. Para distinguir entre los dos tipos de multiplicidad, el tercer experimento utiliza una baja afinidad, la rápida disociación antagonista competitivo de los receptores AMPA, γ-D-glutamylglycine (γ-DGG)^17,18 para determinar si grandes sEPSC son el resultado de la suma temporal de sinapsis independiente o lanzamiento multivesicular actuando sobre una población de superposición de los receptores postsinápticos. Si los eventos de gran amplitud surgen de liberación multivesicular, γ-DGG serán menos eficaces en la inhibición de sEPSCs comparado con el más pequeño más grande, mientras que sEPSCs grandes que surgen de la suma temporal de múltiples contactos sinápticos se verán afectados de manera similar por Γ-DGG. En el cuarto experimento, un método más fisiológico se utiliza para mejorar el potencial de acción disparar, es decir, aferente estimulación sináptica. Ráfagas de actividad sináptica pueden transitorio aumento/facilitar la probabilidad de disparo y liberación de potencial de acción espontáneo de los aferentes estimuladas. Por lo tanto, este enfoque permite multiplicidad de manifestar de una manera más fisiológica.

El siguiente protocolo describe el método para realizar estos experimentos en tejido hipotalámico de ratón. Específicamente, se utilizan las neuronas de la hormona (CRH) liberando corticotropina del núcleo paraventricular del hipotálamo (PVN). Describir los procedimientos para la realización de electrofisiología de celulares patch clamp y explicar los experimentos específicos para probar la multiplicidad sináptica.

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Protocolo

Todos los experimentos con animales son aprobados por el Comité de cuidado Animal de la Universidad de Ontario Occidental según el Consejo Canadiense sobre directrices de cuidado Animal (AUP #2014-031).

1. las soluciones

1. Solución de corte
   1. Consulte la tabla 1 para la composición de la solución de corte.
   2. Prepara una solución madre de 20 x con antelación y almacenar a 4 ° C durante 1 mes.
   3. 1 x solución corte, disolver NaHCO₃, glucosa y sacarosa en ddH₂O y añadir el caldo de 20 x. Garantizar la osmolaridad entre los 315-320 mOsm y almacenar la solución para no más de 1 semana a 4 ° C.
   4. Llene dos vasos con 100 mL de solución de corte y tapa con parafilm. Enfríe la solución en el congelador hasta que la solución se congela parcialmente (aproximadamente 20 minutos en el congelador de-80 ° C). Usando un tubo de dispersión de gas, burbuja ambos vasos de corte solución con 95% O₂5% CO₂ por 20 min en hielo.

	Solución concentraciones (mM)
	De corte	ACSF normal	Bajo Ca2 + aCSF	ACSF Sr+	Pipeta/interno
NaCl	87	126	126	126	-
KCl	2.5	2.5	2.5	2.5	8
CaCl2	0.5	2.5	0.5	-	-
SrCl2	-	-	-	2.5	-
MgCl2	7	1.5	2.5	1.5	2
NaH2PO4	1.25	1.25	1.25	1.25	-
NaHCO3	25	26	26	26	-
Glucosa	25	10	10	10	-
Sacarosa	75	-	-	-	-
Gluconato de K	-	-	-	-	116
Na-gluconato de	-	-	-	-	12
HEPES	-	-	-	-	10
K2-EGTA	-	-	-	-	1
K2ATP	-	-	-	-	4
Na3GTP	-	-	-	-	0.3

Tabla 1: La composición de diversas soluciones.

2. aCSF (para manutención y recuperación de la rebanada)
   1. Consulte la tabla 1 para la composición de la aCSF.
   2. Prepara una solución madre de 20 x con antelación y almacenar a 4 ° C durante 1 mes.
   3. Para 1 x aCSF, disolución de NaHCO₃ y glucosa en ddH₂O y añadir el caldo de 20 x. Asegúrese de que la osmolaridad es entre 298-300 mOsm. Usar la solución dentro de 1 día.
3. aCSF (baja Ca^{2 +} para la grabación)
   1. Consulte la tabla 1 para la composición de la baja Ca^{2 +} aCSF.
   2. Prepara una solución madre de 20 x con antelación y almacenar a 4 ° C durante 1 mes.
   3. Para 1 x baja Ca^{2 +} aCSF, disolver NaHCO₃ y glucosa en ddH2O y añadir 20 x (CaCl₂ y MgCl₂ gratis) stock, CaCl₂ y MgCl₂ especificaron las concentraciones. Asegúrese de que la osmolaridad es entre 298-300. Usar la solución dentro de 1 día.
4. aCSF (Sr^{2 +} para la grabación)
   1. Consulte la tabla 1 para la composición de la Sr^{2 +} aCSF.
   2. Prepara una solución madre de 20 x con antelación y almacenar a 4 ° C durante 1 mes.
   3. Para 1 x Sr^{2 +} aCSF, disolver NaHCO₃ y glucosa en ddH₂O y añadir 20 x (CaCl₂ y MgCl₂ gratis) stock, SrCl₂ y MgCl₂ especificaron las concentraciones. Asegúrese de que la osmolaridad es entre 298-300. Usar la solución dentro de 1 día.
5. Solución interna
   1. Consulte la tabla 1 para la composición de la solución de gluconato de K base interna.
   2. Para hacer 20 mL de solución interna, añadir 15 mL de agua de grado biología molecular a un tubo de 50 mL. Realice los pasos siguientes en el hielo.
   3. Preparar las siguientes soluciones antes de tiempo a 1 M stock concentraciones en biología molecular agua de calidad. Añadir (en mL): 2.32 de gluconato de K, Na-gluconato de 0,24 0,20 HEPES, 0.16 KCl, K2-EGTA 0.05, 0.04 MgCl₂ al tubo de 50 mL.
   4. Añada 100 μl de 0,3 M Na₃GTP.
   5. Pesar de 44,08 mg de K₂ATP en un tubo de microcentrífuga de 2 mL y añadir 1 mL de agua de grado biología molecular, luego añadir a tubo de 50 mL.
   6. Ajustar el pH a 7.2-7.4 con 1 M de KOH. Asegúrese de que la osmolaridad es entre 283-289 mOsm.

2. sector preparación

1. Preparar herramientas
   1. Añadir 200 mL de aCSF a la cámara de recuperación (construida a partir de un vaso de precipitados de 250 mL con 4 pozos y red) y la cámara de recuperación en un baño de agua (35 ° C).
   2. Cubrir la cámara con una película de parafina y constantemente la burbuja la aCSF con 95% O₂5% CO₂ utilizando un tubo de cristal de dispersión para por lo menos 20 minutos.
   3. Preparar para la disección por la configuración de las herramientas (bisturí, tijeras finas angulosas, pinzas, pincel fino, cuchara de plástico).
   4. Llene una jeringa de 60 mL con aproximadamente 15 mL de la solución de corte helado de paso 1.1.4.
   5. Preparar la plataforma de disección colocando un papel de filtro en la tapa de una placa bien.
   6. Preparar la cámara de corte colocando en la bandeja de hielo y llenar la bandeja con hielo.
   7. Configurar el vibratome asegurando una cuchilla desechable en el sujetador de la cuchilla.
   8. Hacer una pipeta por romper la punta de una pipeta Pasteur y colocar un bulbo de goma en el extremo roto.
2. Disección de cerebro de ratón
   1. Anestesiar al animal en una cámara saturada con 4% de isoflurano hasta reflejos espinales están ausentes.
   2. Decapitar al animal con una guillotina y quitar rápidamente el cerebro.
      1. Haga una incisión de línea media con una hoja de bisturí no. 22 de rostral a caudal.
      2. Lateralmente, pelar el cuero cabelludo a cada lado de la cabeza.
      3. Uso de tijeras finas para cortar el cráneo por un lado de caudal a rostral (incluyendo el lado de los huesos frontales), con cuidado no se dañe el cerebro.
      4. Uso de fórceps para levantar el pedazo de cráneo del cerebro y enfríen rápidamente el cerebro con 15 mL de solución corte helado usando la jeringa de paso 2.1.4.
      5. Levante el cerebro fuera del cráneo.
      6. Lugar del cerebro en uno de los vasos con solución helada rebanador (de paso 1.1.4) burbujeado con 95% O₂5% CO₂.
3. Preparar las rebanadas de hipotálamo de ratón
   1. Bloquear el cerebro para el área de cerebro deseada y ángulo de corte (para rebanadas hipotalámicos coronales, recorte el tejido rostral al quiasma óptico y caudal para el puente de Varolio usando una hoja y asegurar el bloque caudal tiene un superficie plana perpendicular a la base del cerebro).
   2. Con una pieza cortada de papel de filtro, recoger el cerebro de la parte anterior y pegue el lado posterior de la placa de retención con pegamento instantáneo.
   3. Coloque la placa de retención en la cámara de corte y llenar la cámara con solución de corte del segundo vaso en el paso 1.1.4 rápidamente.
   4. Fije la bandeja de hielo y cámara de corte en el vibratome.
   5. Definir el área de corte (anterior y posterior del cerebro) y comenzar a cortar rebanadas coronales de 250 μm de espesor. Recomienda los parámetros: velocidad de 0.10 mm/seg, amplitud 2 mm.
   6. Recortar los cortes al tamaño apropiado para el área deseada del cerebro.
   7. Recuperar las rebanadas a 35 ° C durante 30-45 minutos. Entonces, retire la cámara de recuperación del calentamiento baño y permite las rebanadas recuperar a temperatura ambiente durante un adicional 30 minutos rodajas de mantener a temperatura ambiente durante el resto del día y continúan burbuja el baño constantemente con 95% O un₂5% CO₂ .

3. celulares parche ClampRecording

1. Tire de las pipetas de parche
   1. Utilizando los parámetros sugeridos para la grabación de manual del tirador de la pipeta celulares, parche de tirar pipetas de cristal grueso de pared a una resistencia de la pipeta de 3 a 5 MΩ.
   2. Utilizando una microjeringa (comercial o casera), llenar una pipeta con la solución interna filtrada. Una microjeringa, quemar la punta de una jeringa de 1 mL y permitir que la punta caiga creando un fino largo punta.
2. Obtener la configuración de celulares
   1. Coloque la pipeta de grabación justo por encima de la pipeta de segmento y el desplazamiento actual en el modo de pinza de voltaje. Aplique una ligera presión positiva a la pipeta y cerrar la llave de paso.
   2. Seleccione una célula sana con una membrana intacta y acercarse a la celda con la pipeta. La presión positiva debe causar una alteración leve en el tejido (es decir, una onda lenta en el tejido al entrar).
   3. Poco a poco seguir traer la pipeta más cercana a la celda con un movimiento diagonal hasta que la pipeta de forma un pequeño hoyuelo en la superficie celular.
   4. Liberar el bloqueo de presión positiva. La célula comenzará a formar un sello y la resistencia aumentará por encima de 1 GΩ. En abrazadera del voltaje, mantener la célula en -68 mV.
   5. Tire ligeramente de la celda diagonalmente para eliminar el exceso de presión de la célula.
   6. Compensar la capacidad de la pipeta rápido y lento.
   7. Aplicar una breve succión a través del tubo conectado al titular de la pipeta para romperse a través de la celda y obtener configuración de célula entera.
   8. Cambie al modo de la célula en la membrana de prueba ventana en una electrofisiología adquisición de datos y software de análisis (por ejemplo, Clampex).
   9. Antes de cada abrazadera de tensión de grabación, realizar una prueba de membrana usando el mismo software y registrar los parámetros pertinentes en un libro de laboratorio (resistencia de la membrana, acceso a resistencia y capacitancia).
   10. Mantener la temperatura del baño de la grabación en 27 – 30 ° C y el caudal de 1.5 – 2.0 mL/min para experimentos posteriores.

4. multiplicidad experimentos

1. Experimento 1: estimar la multiplicidad con la 4-AP
   1. En abrazadera del voltaje, mantener la célula en -68 mV. Usando el mismo software, grabar el sEPSCs mientras inunda el baño con bajo Ca^{2 +} aCSF. Registro de al menos 5 minutos después del comienzo de la configuración de célula entera para una grabación de línea de base estable como la actividad sináptica puede llegar poco después de la ruptura de la membrana.
   2. Usando una micropipeta, agregar 4-AP a la aCSF y baño Aplique 30 μm 4-AP. registro sEPSCs para por lo menos 10 min obtener el efecto completo de la droga.
   3. Añadir 0,5 μm TTX y μm 10 Cd^{2 +} a la aCSF con 4-AP y grabar mEPSCs para por lo menos 10 minutos.
   4. Para el análisis fuera de línea, utilice el pasado 1 min de base inmediatamente antes de la aplicación de la 4-AP (en baja Ca^{2 +} aCSF), lo 10 min de aplicación AP 4 y los 10 minutos de aplicación de TTX.
2. Experimento 2: desincronizando la liberación de la vesícula con Sr^{2 +}
   1. Mientras que inunda el baño con normal Ca^{2 +} aCSF (igual que el baño aCSF) registro sEPSCs para por lo menos 5 minutos.
   2. Interruptor de la Ca^{2 +} aCSF normal y comenzar perfundiendo Sr^{2 +} aCSF (desde el paso 1.4) y registro sEPSCs.
   3. Para el análisis fuera de línea, para determinar si las sEPSCs de gran amplitud debido a la liberación sincrónica de las vesículas, comparar el pasado 1 min de línea de base (en aCSF normal) a los 10 minutos de^th de la aplicación de Sr^{2 +} aCSF.
3. Experimento 3: prueba de liberación multivesicular usando Γ- DGG
   1. En baja Ca^{2 +} aCSF registro sEPSCs para por lo menos 5 minutos.
   2. Añadir 30 μm 4-AP a la aCSF a través del sistema de perfusión. SEPSCs registro de al menos 10 minutos.
   3. Añadir 200 μm γ-DGG a la aCSF con 4-AP y grabar sEPSCs para por lo menos 10 minutos.
   4. Como un experimento de control en una celda separada, realice los pasos 1-3 pero aplicar una concentración baja (125 nM) de DNQX en vez de γ-DGG.
   5. Para el análisis fuera de línea, analizar el último minuto de cada aplicación de la droga.
4. Experimento 4: Estimular entradas aferentes para aumentar el potencial de acción de disparo.
   1. SEPSCs registro de Ca^{2 +} aCSF normal.
   2. Estimulan aferentes utilizando un electrodo monopolar vidrio llenado con aCSF a una tasa de 20 Hz durante 2 s y repetir 10 veces con un intervalo entre ráfagas de 20 seg.
   3. Para el análisis, utilice 5.000 ms ante el primer estímulo como base y comparar al 10-300 ms después del estímulo final y luego la variación promedio de la amplitud y frecuencia durante 10 ensayos.

5. Análisis

1. Analizar sEPSCs y mEPSCs con un programa que detecta y analiza las corrientes sinápticas (por ejemplo, software de análisis de Mini).
   1. Uso de este software, utilice los parámetros de detección sugerido para detectar EPSCs del Receptor de AMPA (o GABA Receptor EPSCs si se graba corrientes inhibitorias).
   2. Utilice la función de análisis directo para detectar EPSCs en la grabación.
   3. Analizar manualmente cada grabación para asegurar que el programa es detectar con precisión cada evento (por ejemplo, garantizar eventos no están perdidas o cuentan dos veces).
   4. Exportar los datos del evento por copiar al portapapeles y pegarlo en un software de gestión de datos (por ejemplo, Excel)
   5. Calcular la media frecuencia o amplitud para cada tratamiento y realizar los análisis estadísticos pertinentes.

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Resultados

El anterior protocolo describe un método para el uso de electrofisiología de abrazadera de parche de célula entera para examinar el grado de multiplicidad sináptica, mediante neuronas hipotalámicas de ratón como un ejemplo. Esta técnica de preparación de rebanada debe generar células viables sanas que no tienen una membrana hinchada o núcleo (figura 1). Cada paso en el protocolo es importante para la salud del tejido y la calidad de las grabaciones.

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Discusión

Un requisito importante para un éxito parche abrazadera electrofisiológico experimento es la obtención de rodajas/las células sanas. Nuestro protocolo descrito está optimizado para rebanadas hipotalámicas que contienen neuronas PVN. Otro cerebro áreas pueden requerir modifica soluciones y corte métodos^21,22,23,24. Para la grabación, es crítica para aceptar sólo grabaciones estables c...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe	BD	309659
10 blade	Fisher Scientific/others	35698
22 blade	VWR/others	21909-626
22 μM syringe filters	Milipore	09-719-000
Adson foreceps	Harvard Instruments	72-8547
Angled sharp scissors	Harvard Instruments	72-8437
Clampex	Molecular Devices	pClamp 10
Double edge blade	VWR	74-0002
Filter paper	Sigma/others	1001090
Fine paintbrush	Fisher/various	15-183-35/various
Gas Dispersion Tube	VWR	LG-8680-120
Isoflurane	Fresenius Kabi/others	M60303
Krazy glue	various	various
Mini analysis	Synaptosoft	MiniAnalysis 6
Osmomoter	Wescor Inc	Model 5600
Parafilm	Sigma	PM-996
Pasteur pipette	VWR	14672-200
ph meter	Mettler Toledo	FE20-ATC
Rubber bulb	VWR	82024-550
Scalpel handle No. 3	Harvard Instruments	72-8350
Scalpel handle No. 4	Harvard Instruments	72-8356
Single edge blade	VWR	55411-050
Vibratome slicer	Leica	VT1200S
Water Purification System	Millipore	Milli-Q Academic A10
Well plate lid	Fisher/various	07-201-590/various
Chemicals/reagents
4-AP	Sigma	275875
BAPTA	molecular probes	B1204
CaCl2*2H2O	Sigma	C7902
CdCl2	sigma	202908
DNQX	Tocris	189
EGTA	Sigma	E3889
glucose	Sigma	G5767
HEPES	Sigma	H3375
K2-ATP	Sigma	A8937
KCl	Sigma	P9333
K-gluconate	Sigma	G4500
MgCl2*6H2O	Sigma	M2670
Molecular biology grade water	Sigma	W4502-1L
Na3GTP	Sigma	G8877
NaCl	Bioshop	SOD001.1
Na-gluconate	Sigma	S2054
NaH2PO4	Sigma	71504
NaHCO3	Sigma	S6014
Picrotoxin	sigma	P1675
SrCl	Sigma	255521
sucrose	Bioshop	SUC507.1
TTX	Alamone Labs	T-550
yDGG	Tocris	6729-55-1