جيل أورجانويدس من القنوات الصفراوية اكستراهيباتيك الماوس

Summary

ويصف هذا البروتوكول إنتاج نظام ثلاثي الأبعاد أورجانويد القناة الصفراوية اكستراهيباتيك الماوس. يمكن الاحتفاظ بهذه أورجانويدس الصفراوية في الثقافة لدراسة البيولوجيا تشولانجيوسيتي. التعبير عن علامات للسلف والخلايا الصفراوية الصفراوية أورجانويدس وتتكون من الخلايا الظهارية الاستقطاب.

Abstract

تشولانجيوباثيس، التي تؤثر على القناة الصفراوية اكستراهيباتيك (اهبدس)، تتضمن الكبدية الصفراوية والتهاب الأوعية الصفراوية المصلب cholangiocarcinoma. لديهم لا الخيارات العلاجية الفعالة. أدوات لدراسة عبد محدودة جداً. وكان هدفنا وضع نموذج تشولانجيوسيتي المستمدة من الخلايا الجذعية، والاكلينيكية الخاصة بالجهاز، وتنوعاً، والكبار التي يمكن إنشاؤها بسهولة من نوع البرية والفئران المهندسة وراثيا. وهكذا، نحن تقرير عن تقنية الرواية من وضع نظام ثقافة عبد أورجانويد (عبدو) من اهبدس الماوس الكبار. هذا النموذج فعالة من حيث التكلفة، وقادرة على سهولة تحليلها، ولها تطبيقات متعددة المتلقين للمعلومات. على وجه التحديد، يمكننا وصف المنهجية للماوس عبد العزلة والانفصال من خلية مفردة وبدء الثقافة أورجانويد، والدعوة، والصيانة على المدى الطويل وتخزين. كما توضح هذه المخطوطة اهبدو معالجة إيمونوهيستوتشيميستري ومجهر فلوري كوانتيتاتيون وفرة مرناً بالنسخ العكسي الكمية في الوقت الحقيقي تفاعل البوليميراز المتسلسل (قرت-PCR). هذا البروتوكول له مزايا كبيرة بالإضافة إلى إنتاج أورجانويدس عبد على حدة. استخدام وسيلة مكيفة من الخلايا L-تحذير يقلل كثيرا من تكلفة هذا النموذج. ويوفر استخدام الماوس اهبدس الأنسجة غير محدود تقريبا لتوليد ثقافة، خلافا للأنسجة البشرية. ابدوس الماوس الذي تم إنشاؤه يحتوي على عدد سكان نقية من الخلايا الظهارية مع علامات السلف اندوديرمال ومتباينة الخلايا الصفراوية. أورجانويدس مثقف الحفاظ على مورفولوجيا متجانسة من خلال ممرات متعددة، ويمكن استردادها بعد فترة تخزين طويلة الأجل في النتروجين السائل. هذا النموذج يسمح لدراسة انتشار الخلايا السلف الصفراوية ويمكن التلاعب بها عقاقيري، ويمكن إنشاؤها من الفئران المهندسة وراثيا. الدراسات المستقبلية مطلوبة لتحسين ظروف الثقافة من أجل زيادة الكفاءة والطلاء، وتقييم نضج الخلايا الوظيفية، وتمايز الخلية مباشرة. تطوير نماذج الثقافة المشتركة ومصفوفة محايدة أكثر بيولوجيا الخلية أيضا مرغوب فيه.

Introduction

تشولانجيوباثيس هي اضطرابات تقدمية المزمنة المستعصية التي تؤثر على خلايا الصفراوية الموجودة في داخلها والقنوات الصفراوية اكستراهيباتيك (اهبدس)¹. بعض تشولانجيوباثيس، مثل التهاب الأوعية الصفراوية المصلب، cholangiocarcinoma والكبدية الصفراوية والخراجات تشوليدوتشال، يؤثر في الغالب اهبدس. تطوير علاجات تشولانجيوباثيس مقيد بمحدودية توافر نماذج الإكلينيكية. وباﻹضافة إلى ذلك، ركزت الدراسات السابقة على تشولانجيوباثيس التي تم تجميعها معا: الكبد وداخلها، واهبدس. ومع ذلك، داخل اهبدس ذات منشأ جنينية متميزة و، وبالتالي، ينبغي أن تعتبر الأمراض الجزيئي متميزة. القناة الصفراوية أحياناً وضع لوحات الأقنية أحياناً وجزء الجمجمة من رتج الكبد، ووضع اهبدس كله من الجزء والذيلية ل الكبد رتج². كما أنها تعتمد على السلف مختلفة الخلية مقصورات للتوازن الكبار، بما في ذلك قنوات هيرينغ في القناة الصفراوية أحياناً والغدد بيريبيلياري في اهبدس^2،3. استخدام نماذج حيوانية للدراسات الإكلينيكية محدود بالمصروفات وينبغي تدنية لأسباب أخلاقية. ومن ثم، اختزالية، استنساخه، الوقت وفعالة من حيث التكلفة من نماذج في المختبر مرغوب فيه للغاية.

استخدمت معظم الدراسات السابقة من تشولانجيوباثيس الماوس العادي أو نماذج سرطان الفئران، أو خطوط الخلايا البشرية cholangiocarcinoma المستمدة من داخلها واهبدس^4،5،،من⁶⁷. ومع ذلك، هذه نماذج خلايا المحولة ولا الخص البيولوجيا تشولانجيوسيتي العادي في التوازن، أو في حالة صحية. أتاح التقدم الذي أحرز مؤخرا في وضع نماذج الثقافة أورجانوتيبيك لتطوير هياكل ثلاثية الأبعاد من أنواع الأنسجة المختلفة، بما في ذلك أنسجة الكبد، على الرغم من أن الماوس العادية لا^{، اهبدس،من89 10}. هذه الهياكل "مثل جهاز" تهدف إلى محاكاة الأنسجة الأولية وتزرع في مكانة مصطنعة دعم التجديد الذاتي ل الخلايا الجذعية/السلف الخاصة بالجهاز¹¹.

"أورجانويد" مصطلح واسع أن معظم عادة يصف نماذج ثلاثية الأبعاد 3-الأنسجة المستمدة من الخلايا الجذعية. أورجانويدس يمكن أن تتولد من أعيدت برمجتها pluripotent الخلايا الجذعية ممثلة بالخلايا الجذعية الجنينية والتي يتسبب فيها الخلايا الجذعية pluripotent. كما أنها يمكن أن تتولد من الخلايا الجذعية الخاصة بالجهاز¹². لقد تم اقتراح بعض نماذج أورجانويد تشولانجيوسيتي في الدراسات البحثية السابقة. وهكذا، أورجانويدس المستمدة من الخلايا الجذعية pluripotent البشرية وقد تم الإبلاغ عن^7،،من⁹¹³ وتوفير أداة فعالة قيمة، وقت أن يسمح لجيل واحد من أنواع مختلفة من الخلايا. ومع ذلك، لا تعكس هذه أورجانويدس المستمدة من الخلايا الجذعية pluripotent تماما على هيكل ووظائف من الابتدائي تشولانجيوسيتيس عبد الكبار.

أورجانويدس المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية⁹ وكما اقترح الماكر¹⁰ الكبد. نماذج الماكر ليست متاحة على نطاق واسع وتكون محدودة عتاد أداة لأغراض الدراسة. وعلاوة على ذلك، لا نموذج تلك المستمدة من الكبد الكبار المستمدة من الخلايا الجذعية أورجانويدس تشولانجيوسيتيس اكستراهيباتيك ولكن تشولانجيوسيتيس بدلاً من ذلك أحياناً.

أبلغ عبد أورجانويد جيل من الإنسان العادي اهبدس¹⁴ والفأر عبد تشولانجيوكارسينوما¹⁵. بيد الوصول إلى الأنسجة البشرية أهبد محدودة للغاية، وأورجانويدس المستمدة من نموذج موريني وراثية cholangiocarcinoma¹⁵ لا تمثل الأحياء تشولانجيوسيتي صحية في التوازن والمشتقة من خلايا معدلة وراثيا.

لمعالجة قيود pluripotent المستمدة من الخلايا الجذعية والكبد تشولانجيوسيتي أورجانويد نماذج ومحدودية الوصول إلى الأنسجة البشرية اللازمة في نماذج الإكلينيكية، قمنا بتطوير نموذج أورجانويد عبد مورين (الشكل 1A). ويصف هذه المخطوطة تطوير تقنية للماوس أورجانويدس أهبد المستمدة من أنسجة البالغين. سوف تكون هذه أورجانويدس عبد اسمه ابدوس أداة هامة في المختبر لدراسة الآليات التي تقوم عليها عمليات التوازن ومرض اهبدس تشولانجيوسيتي، مثل تشولانجيوباثيس.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من "جامعة ميتشجان".

1-إعداد المعدات والمواد اللازمة لعزل أهبد الماوس

1. إعداد متوسطة البذر والغسيل المخزن المؤقت (جدول المواد) في 50 مل أنابيب مخروطية والاحتفاظ بها عند 4 درجة مئوية أو على الجليد حتى الاستخدام.
2. قم بإعداد جدول جراحية (الشكل 1B). إعداد تعقيم الأدوات الجراحية (الشكل 1).
3. مكان لوحة 24-جيدا عقيمة في 37 درجة مئوية زراعة الأنسجة الحاضنة الدافئة قبل ذلك.
4. مكان قاسمة لمصفوفة الطابق السفلي على الجليد. استخدام مصفوفة الطابق السفلي فقط عند هو مسيل تماما.

2-أهبد العزلة والمرارة أورجانويد الثقافة

1. العزلة، وإعداد تعليق خلية واحدة للماوس عبد
   1. Euthanize ماوس الكبار (كبار السن من 2 أشهر) وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية. ضع الماوس في وضع ضعيف. فتح تجويف البطن باستخدام نهج خط الوسط وسحب الكبد للراحة على الحجاب الحاجز.
   2. تحديد القناة الصفراوية المشتركة الموجودة مباشرة أسفل هيلوم الكبد عن طريق سحب بلطف العفج الدانية مع هيموستات. فصل عبد من الأنسجة المحيطة بها باستخدام شفرة المبضع. عقد نهاية الدانية من القناة الصفراوية المشتركة مع الملقط، تشريح أنه ديستالي فقط أعلاه في المنعطف مع العفج، ثم تشريح الدانية نهاية القناة من الكبد (الشكل 1). فورا وضع عبد معزولة (الشكل 1E) في البرد الغسيل المخزن المؤقت.
   3. إزالة عبد من المخزن المؤقت الغسيل وتخطر أقسام 0.5 مم باستخدام شفرة مشرط معقم. ضع الأنسجة على طبق من زجاج على الجليد أثناء الإجراء (الشكل 1B).
   4. وضع المقاطع عبد في أنبوب يحتوي على 500 ميليلتر من المخزن المؤقت الانفصال. احتضان لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تحييد المخزن المؤقت الانفصال بإضافة 500 ميليلتر من مستنبت الخلية المثلج.
   5. تريتوراتي تعليق خلية صعودا وهبوطاً تتقدم عن طريق الإبر 18 ز وز 20، 20 مرة كل. تصفية تعليق خلية عن طريق مصفاة خلية 70 ميكرومتر وجمع خلال التدفق في أنبوب 50 مل.
      ملاحظة: قبل شرط المصفاة مع 500 ميليلتر من المالحة مخزنة الفوسفات العقيمة (PBS) قبل تصفية لتسهيل مرور تعليق خلية.
2. إنشاء عبد أورجانويدس
   1. أجهزة الطرد المركزي التدفق من خلال الخطوة 2.1.5 في 300 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
   2. بعناية إزالة المادة طافية. ريسوسبيند الخلايا الموجودة في 1 مل من المثلج PBS العقيمة. نقل استثارة في أنبوب 1.5 مل جديدة. كرر الخطوة 2.2.1.
   3. بعد الطرد المركزي، بعناية إزالة المادة طافية من غسلها الخلايا التي يتم جمعها في أسفل الأنبوبة. ريسوسبيند بيليه الخلية في 120 ميليلتر من الطابق السفلي المثلج المسيلة مصفوفة من بيبيتينج صعودا وهبوطاً باستخدام تلميحات P200.
      ملاحظة: وقد استثارة بيليه الخلية في الطابق السفلي المصفوفة المراد تنفيذها على الجليد-حمام.
   4. لوحة ميليلتر 40 من تعليق خلية في مصفوفة الطابق السفلي في وسط بئر في صفيحة 24-جيدا قبل دافئة.
      ملاحظة: تجنب المص الهواء أثناء التعامل مع مصفوفة الطابق السفلي منع تكوين فقاعة.
   5. العودة اللوحة مع خلايا حراكه في مصفوفة الطابق السفلي للحاضنة زراعة الأنسجة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، أو حتى هو توطد مصفوفة الطابق السفلي. إضافة 600 ميليلتر من المتوسط بذر ارتفعت درجة حرارة تصل إلى 37 درجة مئوية لكل بئر (جدول المواد). العودة اللوحة إلى حاضنة استنبات الأنسجة 37 درجة مئوية.
   6. استبدال المتوسطة البذر مع 600 ميليلتر من مستنبت أورجانويد طازجة في 3 أيام وكل 3 أيام بعد ذلك. رصد النمو أورجانويد مع مجهر مقلوب. ويلاحظ استخدام أورجانويدس للتطبيق المصب أو تقسيم كل 7 إلى 9 أيام قبل تراكم انهيار الأنقاض وأورجانويد إينترالومينال (الشكل 2A).

3-عبد أورجانويد مرور وتخزين

1. مرور أهبد أورجانويدس 1:3 إلى 1:4 كل أيام 7 إلى 9
   1. إزالة المتوسطة من البئر وإضافة 400 ميليلتر من برنامج تلفزيوني المثلج. ريسوسبيند أورجانويدس بلطف بيبيتينج الخليط صعودا وهبوطاً 10 مرات في البئر. نقل الخليط إلى أنبوب 1.5 مل.
   2. مرور المخلوط من خلال إبرة 25 غ 4 مرات لننأى أورجانويدس. الطرد المركزي المخلوط في 400 x ز لمدة دقيقة 4 في 4 درجات مئوية.
   3. بعناية إزالة المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في المصفوفة الطابق السفلي (1:3 إلى 1:4) لزيادة استزراع (الخطوة 2.2.4.) أو غسل الخلايا مع الجليد الباردة برنامج تلفزيوني لمزيد من المعالجة.
      ملاحظة: عادة، يتم مطلي خلايا 250-300 إلى لوحة 24-جيدا للتطبيقات المتلقين للمعلومات. تصفيح الكفاءة يمكن تقييمه بحقل مشرق الفحص المجهري استخدام مجهر مقلوب في يوم 3-5 بعد باساجينج بإحصاء عدد أورجانويدس وحساب المئة من عدد الخلايا الأولية. يمكن أن يكون مرناً معزولة من ابدوس غسلها في برنامج تلفزيوني استخدام بروتوكول قياسي باستخدام جوانيدينيوم ثيوسيانات-الفينول-كلوروفورم الاستخراج.
2. التخزين على المدى الطويل من أهبد أورجانويدس
   1. إزالة المتوسطة من البئر وتغسل أورجانويدس مع درجة حرارة الغرفة برنامج تلفزيوني. قم بإزالة برنامج تلفزيوني من البئر دون الإخلال بإسقاط مصفوفة الطابق السفلي.
   2. إضافة 500 ميليلتر من الخلية المثلج تجميد المتوسطة إلى البئر. بلطف ريسوسبيند أورجانويدس في مصفوفة المسيلة الطابق السفلي وخلية تجميد المتوسطة ونقل الخليط في قارورة المبردة.
   3. تخزين القنينات في-80 درجة مئوية ل h. 48 نقل القنينات لخزان النتروجين للتخزين طويل الأجل في مرحلة بخار.

4-أهبد أورجانويد بروسيسينج لتضمين البارافين

1. ريسوسبيند ابدوس في 500 ميليلتر من المثلج PBS (4 درجة مئوية) قبل بيبيتينج صعودا وهبوطاً 5 إلى 10 مرات. جمع اهبدو حراكه في مصفوفة الطابق السفلي المسيلة في أنبوب 1.5 مل.
   ملاحظة: لتجنب كسر أورجانويدس وقطع الجزء السفلي 2-3 مم طرف P1000 وإزالة المادة طافية بعناية فائقة.
2. بعناية إزالة أجهزة الطرد المركزي عبد أورجانويدس في 350 x ز للحد الأدنى 5 المادة طافية دون إزعاج بيليه أورجانويد.
3. إضافة 1 مل من المثلج 4% بارافورمالدهيد (منهاج عمل بيجين) إلى أورجانويدس واحتضان أورجانويدس في 4% بين عشية وضحاها منهاج عمل بيجين في 4 درجات مئوية. إزالة 4% منهاج العمل من أورجانويدس استخدام تلميح P1000 بعد الحضانة بين عشية وضحاها.
4. إضافة 1000 ميليلتر من درجة حرارة الغرفة برنامج تلفزيوني للأنبوب مع أورجانويدس واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). الطرد المركزي الأنبوب مع أورجانويدس في برنامج تلفزيوني في 350 x ز لأدنى 5 كرر هذه العملية مرتين أخريين.
5. إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 1 مل إيثانول 30% أورجانويدس. احتضان لمدة 5 دقائق في الرايت
6. الطرد المركزي الأنبوب في 350 x ز لمدة 5 دقائق في إزالة الرايت 30 ٪ الإيثانول. أضف 1 مل إيثانول 70% واحتضان لمدة 5 دقائق في الرايت
7. سينتريفوجاتي في س 350 ز لإزالة الحد الأدنى 5 70% إيثانول. أضف 1 مل إيثانول 100% واحتضان لمدة 5 دقائق في الرايت
   ملاحظة: أورجانويدس يمكن أن يوضع في الإيثانول 100% عند درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 48 ساعة قبل إجراء مزيد من المعالجة.
8. الحرارة هلام تجهيز العينة في فرن ميكروويف ل 20 ق أو حتى المسال. إضافة 50 ميكروليتر من عينة تجهيز جل في الأنبوب مع أورجانويدس. ضع الأنبوب على الجليد حتى هو توطد العينة تجهيز هلام.
9. إزالة قطره العينة تجهيز هلام مع أورجانويدس من الأنبوب ووضعه بين منصات الأسفنج الأزرق في كاسيت لمزيد من المعالجة في النسيج المعالج. استخدم 15 دقيقة لكل خطوة في امبيدير البارافين خلال إجراء مزيد من المعالجة...
10. قسم أورجانويدس جزءا لا يتجزأ من البارافين في العينة تجهيز هلام في 4 ميكرومتر. المضي قدما مع المناعي تلطيخ كما هو موضح سابقا¹⁶.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

لدينا بروتوكول وصف جيل أورجانويدس عبد الماوس الخاصة بالانسجة والكبار المستمدة من الخلايا الجذعية. بعد تستزرع في أورجانويدس، وتشكيل هيكل الكيسي يمكن ملاحظة لها في أقرب وقت بعد أن عزلة أهبد يوم 1. التلوث مع الليفية لا يحترم عادة خلال جيل الثقافة. عبدو تصفيح الكفاءة هو حوال?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

ويصف هذا العمل إنشاء نموذج ثلاثي الأبعاد للماوس تشولانجيوسيتيس أهبد أورجانوتيبيك. وتشمل الخطوات الهامة في توليد ثقافة عبدو تشريح عبد دقيق لتفادي التلوث خلية البنكرياس، الحفاظ على ظروف معقمة لمنع التلوث البكتيرية والفطرية، والتلاعب بعناية بعد الطرد المركزي لتجنب فقدان المواد الخلوية. م...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
L-WRN cell culture medium
Advanced DMEM/F12		Life Technologies	12634-010
Fetal Bovine Serum (FBS)	1%	Life Technologies	10437-028
Penicillin-Streptomycin	100 U/mL	Life Technologies	15140-122
Washing buffer
Phosphate Buffered Saline (PBS)	50 mL	Life Technologies	10010-023
Penicillin-Streptomycin	125 U/mL	Life Technologies	15140-122
Amphotericin B	6.25 µg/mL	Life Technologies	15290-018
Organoid culture medium
L-WRN Conditioned medium	1:1	ATCC	CRL-3276
Advanced DMEM/F12	1:1	Life Technologies	12634-010
Penicillin-Streptomycin	100 U/mL	Life Technologies	15140-122
N-Glutamine	10 µl/mL	Life Technologies	35050-061
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid, HEPES	10 mM	Life Technologies	15630-080
B27	10 µl/mL	Gibco	17504-044
N2	10 µl/mL	Gibco	17502-048
Organoid seeding medium
Organoid culture medium
Epidermal growth factor (EGF)	50 ng/mL	Invitrogen	PMG8041
Fibroblast growth factor-10 (FGF10)	100 ng/mL	PeproTech	100-26
Primary antibodies
Anti-Cytokeratin 19 (CK19) antibody, Rabbit	1:250	Abcam	ab53119
Sex-Determining Region Y-Box 9 (SOX9) antibody, Rabbit	1:200	Santa Cruz	sc-20095
Pancreatic Duodenal Homeobox 1 (PDX1) antibody, Rabbit	1:2000	DSRB	F109-D12
E-cadherin antibody, Goat	1:500	Santa Cruz	sc-31020
Acetylated α-tubulin antibody, Mouse	1:500	Sigma-Aldrich	T6793
Secondary antibodies
488 labeled anti-rabbit, Donkey IgG	1:1000	Invitrogen	A-21206
594 labeled anti-goat, Donkey IgG	1:1000	Invitrogen	A-11058
568 labeled anti-mouse, Goat IgG2b	1:500	Invitrogen	A-21144
TopFlash Wnt reporter assay
TopFlash HEK293 cell line		ATCC	CRL-1573
Luciferase Assay Kit		Biotium	30003-2
0.05% Trypsin-EDTA		Life Technologies	25300054
0.4% Trypan Blue Solution		Life Technologies	15250061
Additional materials and reagents
Basement matrix, phenol free Matrigel		CORNING	356237
Dissociation buffer, Accutase		Gibco	A1110501
Cell culture freezing medium, Recovery		Life Technologies	12648010
Cell strainer (70 µm, steriled)		Fisherbrand	22363548
Guanidinium thiocyanate-phenol RNA extraction, TRIzol		Invitrogen	15596026
Specimen processing gel, HistoGel		Thermo Fisher Scientific	HG-4000-012
Universal mycoplasma detection kit		ATCC	30-1012K
1.5 mL microcentrifuge tube		Fisherbrand	05-408-129
24 well plate		USA Scientific	CC7682-7524
50 mL conical centrifuge tube		Fisher scientific	14-432-22
Fluorescence microscope		Nikon	Eclipse E800
Inverted microscope		Biotium	30003-2
Necropsy tray		Fisherbrand	13-814-61