Geração de Organoids de vias biliares extra-hepáticas Mouse

Resumo

Este protocolo descreve a produção de um sistema de 3-dimensional organoides biliar extra-hepática do mouse. Estes organoids biliares podem ser mantidas em cultura para estudar Biologia cholangiocyte. Organoids biliares expressar marcadores do progenitor e células biliares e são compostos de células epiteliais polarizadas.

Resumo

Cholangiopathies, que afectam os ductos biliares extra-hepáticas (EHBDs), incluem atresia biliar, colangite esclerosante primária e colangiocarcinoma. Eles não têm nenhuma opção terapêutica eficaz. Ferramentas para estudar EHBD são muito limitadas. Nosso objetivo foi desenvolver um modelo de órgão específico, versátil, adulto pré-clínicos, células-tronco derivadas de cholangiocyte que pode ser facilmente gerado de tipo selvagem e camundongos geneticamente modificados. Assim, relatamos a nova técnica de desenvolvimento de um sistema de cultura de organoides (EHBDO) EHBD de EHBDs de rato adulto. O modelo é custo-eficiente, capaz de ser prontamente analisadas, e tem múltiplas aplicações a jusante. Especificamente, descrevemos a metodologia de isolamento de EHBD de rato e dissociação de célula única, iniciação de cultura organoides, propagação e manutenção a longo prazo e armazenamento. Este manuscrito também descreve EHBDO processamento de imuno-histoquímica, microscopia fluorescente e quantificação de abundância de mRNA pela reação em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa transcrição reversa (qRT-PCR). Este protocolo tem vantagens significativas, além de produzir organoids EHBD específicos. O uso de um meio condicionado de células L-WRN reduz significativamente o custo deste modelo. O uso do mouse EHBDs fornece tecido quase ilimitado para geração de cultura, ao contrário de tecido humano. EHBDOs rato gerado contêm uma população pura de células epiteliais com marcadores de endodermal progenitor e biliares células diferenciadas. Organoids cultivadas manter homogénea morfologia através de múltiplas passagens e podem ser recuperados após um período de armazenamento a longo prazo em nitrogênio líquido. O modelo permite o estudo da proliferação das células progenitoras biliar, pode ser manipulado farmacologicamente e pode ser gerado a partir de camundongos geneticamente modificados. Futuros estudos são necessários para otimizar as condições de cultura a fim de aumentar a eficiência do chapeamento, avaliar a maturidade funcional celular e diferenciação celular direto. Desenvolvimento de modelos de co-cultura e uma matriz extracelular mais biologicamente neutro também são desejáveis.

Introdução

Cholangiopathies são incuráveis crônicos progressivos distúrbios que afetam as células biliares localizadas no intrae canais biliares extra-hepáticas (EHBDs)¹. Alguns cholangiopathies, como Colangiocarcinoma, colangite esclerosante primária, atresia biliar e cistos coledocianos, afetam predominantemente EHBDs. Desenvolvimento de terapias para cholangiopathies é restringido pela disponibilidade limitada de modelos pré-clínicos. Além disso, estudos anteriores focada em cholangiopathies agrupados: fígado, intrae EHBDs. No entanto, intrae EHBDs têm uma origem embrionária distinta e, portanto, devem ser consideradas distintas patologias moleculares. Biliares intra-hepáticos se desenvolvem a partir das placas intra Ductais e a parte cranial do divertículo hepático, EHBDs todo desenvolvem da parte caudal do divertículo hepático². Eles também contam com compartimentos de células progenitoras diferentes para homeostase adulto, incluindo canais de Hering em glândulas de peribiliary em EHBDs^2,3e biliares intra-hepáticos. Utilização de modelos animais para estudos pré-clínicos é limitada pela despesa e deve ser minimizada por razões éticas. Portanto, reducionista, reprodutível, tempo e custo-eficiente modelos in vitro são altamente desejáveis.

A maioria dos estudos prévios de cholangiopathies utilizaram rato normal ou modelos de câncer do rato ou linhas de células humanas Colangiocarcinoma derivadas intrae EHBDs^4,5,6,7. No entanto, estes são modelos de células transformadas e não recapitular biologia cholangiocyte normal em homeostase ou em um estado saudável. Recentes progressos no desenvolvimento de modelos de cultura organotypic permitiu o desenvolvimento de estruturas 3-dimensional de tipos de tecido diferentes, incluindo tecidos de vilosidades, embora não normal do rato EHBDs^{8,9, 10}. Estes "órgãos" estruturas destinadas a imitando tecido primário e são cultivadas em um nicho artificial apoiando auto-renovação de células tronco/progenitoras de órgão específico¹¹.

"Organoides" é um amplo termo que mais comumente descreve modelos de tecido 3-dimensional derivados de células-tronco. Organoids podem ser gerados de pluripotentes reprogramadas, células-tronco representado por células-tronco embrionárias e induzido por células-tronco pluripotentes. Eles também podem ser gerados a partir de células-tronco adultas órgão específico¹². Alguns modelos de organoides cholangiocyte têm sido propostos em estudos anteriores. Assim, organoids, derivados de células-tronco pluripotentes humanas têm sido relatados^7,9,13 e fornecer um tempo valioso, eficiente ferramenta que permite a geração simultânea de diferentes tipos de células. No entanto, essas organoids de células-tronco derivadas de pluripotentes não refletem totalmente a estrutura e a funcionalidade do adulto primário EHBD cholangiocytes.

Organoids derivados de células-tronco adultas do humano⁹ e felino¹⁰ fígado também foram propostos. Modelos de felinos não estão amplamente disponíveis e limitaram o arsenal de ferramentas para fins de estudo. Além disso, estes organoids células-tronco derivadas adultos derivado de fígado não modelo cholangiocytes extra-hepática mas prefiro intra-hepática cholangiocytes.

Geração de organoides EHBD foi relatada de humano normal EHBDs¹⁴ e mouse EHBD Colangiocarcinoma¹⁵. No entanto, acesso ao tecido EHBD humano é extremamente limitado, e organoids derivados de um modelo murino genético de colangiocarcinoma¹⁵ não representam saudável cholangiocyte biologia na homeostase e são derivadas de células geneticamente modificadas.

Para lidar com as limitações dos modelos organoides cholangiocyte de células-tronco e fígado-derivadas de pluripotentes e o acesso limitado aos tecidos humanos necessários em modelos pré-clínicos, desenvolvemos um modelo murino de organoides EHBD (figura 1A). Este manuscrito descreve o desenvolvimento de uma técnica para mouse organoids EHBD-derivado de tecido adulto. Estes organoids EHBD chamados EHBDOs será uma importante ferramenta in vitro para o estudo dos mecanismos subjacentes EHBDs cholangiocyte homeostase e doença de processos, tais como cholangiopathies.

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) da Universidade de Michigan e institucional Cuidado Animal.

1. preparação de equipamentos e materiais para isolamento de Mouse EHBD

1. Preparar o meio de semeadura e tampão de lavagem (Tabela de materiais) em 50 mL tubos cónicos e mantê-los em 4 ° C ou em gelo até o uso.
2. Configure uma mesa cirúrgica (figura 1B). Prepare os instrumentos cirúrgicos esterilizados (Figura 1).
3. Coloque uma placa estéril de 24 a 37 ° C incubadora de cultura de tecidos de pré-aquecimento.
4. Coloque uma parte alíquota da matriz de porão no gelo. Use o porão matriz somente quando ele é completamente liquefeito.

2. EHBD isolamento e cultura de organoides biliar

1. Isolamento e preparação de uma suspensão de célula única do mouse EHBD
   1. Eutanásia em um rato adulto (mais de 2 meses) de acordo com as orientações institucionais. Coloque o mouse em uma posição supina. Abrir a cavidade abdominal, usando uma abordagem de linha média e retração do fígado para descansar sobre o diafragma.
   2. Identifica o ducto biliar comum localizado imediatamente abaixo do hilo hepático, puxando suavemente o duodeno proximal com uma pinça hemostática. EHBD separe os tecidos circunvizinhos usando uma lâmina de bisturi. Segurando a extremidade proximal do ducto biliar comum com fórceps, dissecá-lo distalmente logo acima de sua junção com o duodeno, em seguida, dissecar a extremidade proximal do ducto do fígado (Figura 1). Imediatamente coloque isolado EHBD (Figura 1E) no frio de tampão de lavagem.
   3. Remover o EHBD do buffer de lavar e picar em seções de 0,5 mm, usando uma lâmina de bisturi estéril. Coloque o tecido sobre uma placa de vidro no gelo durante o procedimento (figura 1B).
   4. Coloca as seções EHBD num tubo contendo 500 µ l de buffer de dissociação. Incubar durante 20 min a 37 ° C. Neutralize o buffer de dissociação adicionando 500 µ l do meio de cultura celular gelada.
   5. Triture a suspensão de eritrócitos e descer progredir através de agulhas de 18 e 20 G, 20 vezes cada um. Filtrar a suspensão através de um filtro de célula 70 µm e coletar o escoamento em um tubo de 50 mL.
      Nota: Pré-condição do filtro com 500 µ l de tampão fosfato solução salina estéril (PBS) antes da filtragem para facilitar a passagem da suspensão celular.
2. Estabelecimento de EHBD organoids
   1. Centrifugue a passagem da etapa 2.1.5 a 300 x g por 5 min a 4 ° C.
   2. Remova cuidadosamente o sobrenadante. Ressuspender as células em 1 mL de PBS estéril gelada. Transferi a ressuspensão em um novo tubo de 1,5 mL. Repita a etapa 2.2.1.
   3. Após a centrifugação, Retire cuidadosamente o sobrenadante de lavado células coletadas na parte inferior do tubo. Resuspenda o pellet de células em 120 µ l de matriz liquefeito cave gelada pipetando subir e descer usando dicas P200.
      Nota: Ressuspensão de sedimento celular em matriz de porão tem de ser realizada em banho de gelo.
   4. Placa de 40 µ l da ressuspensão de célula na matriz de porão para o centro de um poço em uma placa de 24 previamente aquecido.
      Nota: Evite a aspiração de ar durante a manipulação de matriz do porão para evitar a formação de bolhas.
   5. Devolve a chapa com células resuspended na matriz de porão para a incubadora de cultura de tecidos de 37 ° C por 15 min ou até a matriz do porão é solidificado. Adicione 600 µ l do meio de propagação aquecido a 37 ° C para cada poço (Tabela de materiais). Devolve a chapa para a incubadora de cultura de tecidos de 37 ° C.
   6. Substitua o meio de semeadura com 600 µ l do meio de cultura fresco organoides em 3 dias e depois a cada 3 dias. Monitorar o crescimento de organoides com um microscópio invertido. Uso organoids para uma aplicação a jusante ou divididos em 7 a 9 dias antes de acumulação do colapso de restos e organoides intraluminal são observados (Figura 2A).

3. EHBD organoides passagem e armazenamento

1. Passagem de EHBD organoids 1:3 a 1:4 em 7 a 9 dias
   1. Retire o meio do poço e adicione 400 µ l de PBS gelado. Ressuspender o organoids pipetando suavemente a mistura acima e para baixo 10 vezes no poço. Transfira a mistura para um tubo de 1,5 mL.
   2. Passagem a mistura através de uma agulha 25g 4 vezes para dissociar o organoids. Centrifugue a mistura a 400 x g durante 4 min a 4 ° C.
   3. Remova cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender as células em uma matriz de porão (1:3 a 1:4) para mais de cultivo (etapa 2.2.4.) ou lavar as células com gelo frio PBS para processamento adicional.
      Nota: Normalmente, as células de 250-300 são banhadas na placa de 24 para aplicações a jusante. Chapeamento de eficiência pode ser avaliado pela microscopia de campo claro, usando um microscópio invertido no dia 3-5, após a passagem pela contagem do número de organoids e calcular seus por cento do número de célula inicial. mRNA pode ser isolado de EHBDOs lavados em PBS, usando o protocolo padrão usando extração de guanidínio tiocianato-fenol-clorofórmio.
2. Armazenamento a longo prazo de organoids EHBD
   1. Retire o meio do poço e lave o organoids com temperatura PBS. Remova o PBS do poço sem perturbar a queda de matriz do porão.
   2. Adicione 500 µ l de cela gelada congelamento médio para o poço. Delicadamente resuspenda o organoids na matriz de porão liquefeito e célula congelamento médio e transfira a mistura dentro dos frascos criogênicos.
   3. Armazene os frascos de-80 ° C por 48 h. transferência os frascos para um tanque de nitrogênio para armazenamento a longo prazo em uma fase de vapor.

4. EHBD Pprocessing de organoides para a incorporação de parafina

1. Ressuspender os EHBDOs em 500 µ l de PBS gelado (4 ° C) por pipetagem e descer de 5 a 10 vezes. Colete EHBDO ressuspensão em matriz liquefeito porão em um tubo de 1,5 mL.
   Nota: Para evitar a interrupção organoids, cortar a parte inferior 2-3mm de uma dica de P1000 e remover o sobrenadante com muito cuidado.
2. Centrífuga EHBD organoids a 350 x g durante 5 min. Retire com cuidado o sobrenadante sem perturbar o sedimento de organoides.
3. Adicionar 1 mL de gelado paraformaldeído 4% (PFA) para o organoids e incubar a organoids em 4% PFA overnight a 4° C. Remover 4% PFA do organoids usando uma dica P1000 após incubação durante a noite.
4. Adicionar 1000 µ l de PBS temperatura ambiente para o tubo com o organoids e incubar durante 5 min à temperatura ambiente (RT). Centrifugar o tubo com organoids em PBS em 350 x g durante 5 min. Repita este processo mais duas vezes.
5. PBS de remover e adicionar 1 mL de etanol a 30% para o organoids. Incubar durante 5 min à RT.
6. Centrifugar o tubo a 350 x g durante 5 min à RT. Remove 30% de etanol. Adicione 1 mL de etanol a 70% e incubar durante 5 min à RT
7. Centrifugate a 350 x g durante 5 min. remover etanol a 70%. Adicione 1 mL de etanol 100% e incubar durante 5 min à RT
   Nota: Organoids podem ser mantidos em etanol 100% à temperatura ambiente por até 48 h antes de processamento adicional.
8. Aqueça o gel de processamento da amostra no microondas por 20 s ou até liquefeito. Adicione 50 µ l de amostra de gel dentro do tubo com organoids de processamento. Coloca o tubo no gelo até o espécime processamento gel é solidificado.
9. Retirar a gota de gel com organoids do tubo de processamento de amostra e coloque entre as almofadas de esponja azul em uma gaveta para processamento adicional no processador de tecido. Use 15 min para cada etapa em embedder a parafina durante a transformação...
10. Seção organoids de parafina numa amostra de processamento gel em 4 µm. Proceda com imuno-histoquímica coloração como descrito anteriormente,¹⁶.

Resultados

Nosso protocolo descreve a geração de organoids EHBD de rato que são específicos para tecidos e células-tronco derivadas de adulto. Depois que os organoids são cultivadas, uma formação de estrutura cística pode ser observada logo em 1 dia após o isolamento do EHBD. Contaminação com fibroblastos não é tipicamente observada durante a geração de cultura. EHBDO, chapeamento de eficiência é de aproximadamente 2% quando isolado de neonatal ou adultos (mais de 2 meses) ratos (<...

Discussão

Este trabalho descreve a geração de um modelo de 3-dimensional organotypic do mouse cholangiocytes EHBD. Passos importantes na geração de cultura EHBDO incluem minuciosa dissecação de EHBD para evitar a contaminação de células do pâncreas, manutenção de condições estéreis para evitar a contaminação bacteriana e fúngica e manipulação cuidadosa após a centrifugação, para evitar o perda de material celular. Uma estreita aderência às condições descritas de temperatura é necessária. Existem alguma...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
L-WRN cell culture medium
Advanced DMEM/F12		Life Technologies	12634-010
Fetal Bovine Serum (FBS)	1%	Life Technologies	10437-028
Penicillin-Streptomycin	100 U/mL	Life Technologies	15140-122
Washing buffer
Phosphate Buffered Saline (PBS)	50 mL	Life Technologies	10010-023
Penicillin-Streptomycin	125 U/mL	Life Technologies	15140-122
Amphotericin B	6.25 µg/mL	Life Technologies	15290-018
Organoid culture medium
L-WRN Conditioned medium	1:1	ATCC	CRL-3276
Advanced DMEM/F12	1:1	Life Technologies	12634-010
Penicillin-Streptomycin	100 U/mL	Life Technologies	15140-122
N-Glutamine	10 µl/mL	Life Technologies	35050-061
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid, HEPES	10 mM	Life Technologies	15630-080
B27	10 µl/mL	Gibco	17504-044
N2	10 µl/mL	Gibco	17502-048
Organoid seeding medium
Organoid culture medium
Epidermal growth factor (EGF)	50 ng/mL	Invitrogen	PMG8041
Fibroblast growth factor-10 (FGF10)	100 ng/mL	PeproTech	100-26
Primary antibodies
Anti-Cytokeratin 19 (CK19) antibody, Rabbit	1:250	Abcam	ab53119
Sex-Determining Region Y-Box 9 (SOX9) antibody, Rabbit	1:200	Santa Cruz	sc-20095
Pancreatic Duodenal Homeobox 1 (PDX1) antibody, Rabbit	1:2000	DSRB	F109-D12
E-cadherin antibody, Goat	1:500	Santa Cruz	sc-31020
Acetylated α-tubulin antibody, Mouse	1:500	Sigma-Aldrich	T6793
Secondary antibodies
488 labeled anti-rabbit, Donkey IgG	1:1000	Invitrogen	A-21206
594 labeled anti-goat, Donkey IgG	1:1000	Invitrogen	A-11058
568 labeled anti-mouse, Goat IgG2b	1:500	Invitrogen	A-21144
TopFlash Wnt reporter assay
TopFlash HEK293 cell line		ATCC	CRL-1573
Luciferase Assay Kit		Biotium	30003-2
0.05% Trypsin-EDTA		Life Technologies	25300054
0.4% Trypan Blue Solution		Life Technologies	15250061
Additional materials and reagents
Basement matrix, phenol free Matrigel		CORNING	356237
Dissociation buffer, Accutase		Gibco	A1110501
Cell culture freezing medium, Recovery		Life Technologies	12648010
Cell strainer (70 µm, steriled)		Fisherbrand	22363548
Guanidinium thiocyanate-phenol RNA extraction, TRIzol		Invitrogen	15596026
Specimen processing gel, HistoGel		Thermo Fisher Scientific	HG-4000-012
Universal mycoplasma detection kit		ATCC	30-1012K
1.5 mL microcentrifuge tube		Fisherbrand	05-408-129
24 well plate		USA Scientific	CC7682-7524
50 mL conical centrifuge tube		Fisher scientific	14-432-22
Fluorescence microscope		Nikon	Eclipse E800
Inverted microscope		Biotium	30003-2
Necropsy tray		Fisherbrand	13-814-61