Поколение Organoids от мыши внепеченочных желчных протоков

Этот протокол описывает производства система 3-мерного органоид мыши внепеченочных желчных протоков. Эти желчных organoids может поддерживаться в культуре для изучения биологии cholangiocyte. Желчных organoids Экспресс маркеры прародителем и желчных клетки и состоят из поляризованные эпителиальных клеток.

Аннотация

Cholangiopathies, которые затрагивают внепеченочных желчных протоков (EHBDs), включают в себя Билиарной атрезией, первичный склерозирующий холангит и холангиокарцинома. Они имеют без эффективных терапевтических вариантов. Инструменты для изучения EHBD весьма ограничены. Нашей целью было разработать органоспецифическая, универсальный, взрослых стволовых клеток, доклинические cholangiocyte модели, которые могут быть легко сгенерированы от дикого типа и генетически мышей. Таким образом мы сообщаем о Роман методика разработки системы культуры органоид (EHBDO) EHBD от взрослых мыши EHBDs. Модель является экономически эффективным, могут легко анализироваться, и имеет несколько нисходящие приложения. В частности мы описываем методологии мыши EHBD изоляции и одноклеточного диссоциации, органоид культуры посвящения, распространения и долгосрочного обслуживания и хранения. Этот манускрипт также описывает EHBDO обработки для иммуногистохимии, флуоресцентной микроскопии и мРНК изобилие количественный реального времени Количественная обратная транскрипция полимеразной цепной реакции (qRT ПЦР). Этот протокол имеет значительные преимущества в дополнение к производству EHBD-конкретных organoids. Использование условных среды от клеток L-WRN значительно снижает стоимость этой модели. Использование мыши EHBDs обеспечивает практически неограниченные ткани для формирования культуры, в отличие от человеческих тканей. Сгенерированный мышью EHBDOs содержат чисто населения эпителиальных клеток с маркерами эндодермы прародителя и дифференцированной желчных клетки. Культивированный organoids поддерживать однородные морфология через множественные проходы и могут быть восстановлены после долгосрочного хранения в жидком азоте. Модель позволяет для изучения желчных прародитель пролиферации клеток, можно манипулировать фармакологически и может быть создан из генетически мышей. Будущие исследования необходимы для оптимизации условий культуры с целью повысить эффективность покрытия, оценки функциональных клеток зрелости и прямой клеточная дифференцировка. Желательно также разработка совместного культуры моделей и более биологически нейтральной внеклеточного матрикса.

Введение

Cholangiopathies являются неизлечимой хронической прогрессивного расстройств, которые влияют на желчных клеток, расположенных в интра - и внепеченочных желчных протоков (EHBDs)¹. Некоторые cholangiopathies, как первичный склерозирующий холангит, холангиокарцинома, Билиарной атрезией и Киста холедоха, преимущественно влияет на EHBDs. Разработка терапии для cholangiopathies ограничивается ограниченное наличие доклинических моделей. Кроме того, предыдущие исследования сосредоточены на cholangiopathies, сгруппированных вместе: печень, интра- и EHBDs. Однако внутри - и EHBDs имеют собственный эмбриональное происхождение и, таким образом, следует рассматривать в качестве отдельных молекулярной патологии. Внутрипеченочных желчных протоков развиваются из внутрипеченочных протоковой пластины и черепной частью печеночная дивертикул, весь EHBDs развивать из хвостовой части печени дивертикул². Они также полагаются на разных прародителя клеточных компартментов для взрослых гомеостаза, включая каналы Геринга внутрипеченочных желчных протоков и peribiliary желез в EHBDs²^,³. Использование животных моделей для доклинических исследований ограничивается расходами и должно быть сведено к минимуму, по этическим соображениям. Таким образом упрощенный, воспроизводимость, время и экономически эффективным в пробирке модели являются весьма желательно.

Большинство предыдущих исследований cholangiopathies использованы нормальные мыши или крысы рака модели или человека холангиокарцинома клеточных линий, полученных от интра - и EHBDs⁴^,⁵^,⁶^,⁷. Однако эти модели трансформированных клеток и не повторить, нормальный cholangiocyte биологии гомеостаза или в здоровом состоянии. Недавний прогресс в разработке моделей organotypic культуры позволил развитие 3-мерных структур из тканей различных типов, включая гепатобилиарной тканей, хотя не нормальные мыши EHBDs⁸^,⁹^, ¹⁰. Эти структуры «орган как» направленные на пародирование основной ткани и выращиваются в искусственной ниши, поддержки самообновления органоспецифическая стволовых/прогениторных клеток¹¹.

«Organoid»-это широкий термин, наиболее часто описывает модели 3-мерной ткани, полученные из стволовых клеток. Organoids могут быть сгенерированы из перенесенной плюрипотентных стволовых клеток представлено эмбриональных стволовых клеток и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Они также может быть создан из¹²органоспецифическая взрослых стволовых клеток. Некоторые cholangiocyte органоид модели были предложены в предыдущих исследований. Таким образом organoids, производный от человеческих плюрипотентных стволовых клеток были сообщил⁷^,⁹^,¹³ и предоставить ценные, время эффективным инструментом, который позволяет для одновременной генерации различных типов клеток. Однако эти плюрипотентных стволовых клеток organoids не в полной мере отражает структуру и функциональность основного взрослого EHBD cholangiocytes.

Organoids производным от взрослых стволовых клеток человека⁹ и кошачьих¹⁰ печени были также предложены. Кошачий модели не широко доступны и имеют ограниченный инструмент взята для целей исследования. Кроме того эти функции печени производные взрослых стволовых клеток, полученных organoids не модель внепеченочных cholangiocytes, но скорее внутрипеченочных cholangiocytes.

EHBD органоид поколения было сообщено от человека нормальный EHBDs¹⁴ и мыши EHBD холангиокарцинома¹⁵. Однако чрезвычайно ограничен доступ к EHBD ткани человека, и organoids производным от генетических мышиных модель холангиокарцинома¹⁵ не представляют здорового cholangiocyte биологии гомеостаза и являются производными от генетически модифицированные клетки.

Для устранения ограничений плюрипотентных стволовых клеток и печени, полученных cholangiocyte органоид моделей и ограниченный доступ к ткани человека, необходимо в доклинических моделях, мы разработали модель мышиных EHBD органоид (рис. 1A). Эта рукопись описывается разработка методики для мыши EHBD-производные organoids от взрослых ткани. Эти EHBD organoids с именем EHBDOs будет важным инструментом в пробирке для изучения механизмов, лежащих в основе EHBDs cholangiocyte гомеостаза и болезней процессов, таких как cholangiopathies.

протокол

Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) Мичиганского университета.

1. Подготовка оборудования и материалов для мыши EHBD изоляции

Подготовить посевной средних и стиральные буфера (Таблица материалов) в 50 мл конические трубы и держать их на 4 ° C или на льду до использования.
Настройте таблицу хирургические (рис. 1B). Подготовьте стерилизации хирургических инструментов (рис. 1 c).
Место стерильным 24-ну пластины в инкубатор культуры ткани 37 ° C для предварительного подогрева.
Место Алиготе подвале матрицы на льду. Подвале матрицу следует используйте только тогда, когда он полностью сжиженный.

2. EHBD изоляции и желчных органоид культура

Изоляция и приготовление суспензии одну ячейку мыши EHBD
1. Усыпить взрослых (старше 2 месяцев) мыши согласно институциональных руководящих принципов. Поместите указатель мыши в лежачем положении. Откройте брюшной полости, используя подход срединной и убрать печени отдохнуть на диафрагму.
2. Определение общего желчного протока, расположенный сразу под печени рубчика, осторожно потянув проксимальной двенадцатиперстную кишку с кровоостанавливающий. Отделите EHBD от окружающих тканей, с использованием лезвием скальпеля. Проведению проксимального конца общего желчного протока с щипцами, вскрыть его дистально чуть выше его этапе с двенадцатиперстную кишку, а затем вскрыть проксимальный конец воздуховода из печени (рис. 1 d). Сразу же место изолированные EHBD (Рисунок 1E) в холодной отмывающего буфера.
3. Удалить EHBD из Отмывающий буфер и фарша 0.5 мм разделов с помощью лезвия стерильным скальпель. Место ткани на стеклянную пластину на льду во время процедуры (рис. 1B).
4. Место разделы EHBD в пробирку, содержащую 500 мкл буфера диссоциации. Проинкубируйте втечение 20 мин при температуре 37 ° C. Нейтрализовать диссоциации буфера, добавив 500 мкл ледяной клеток питательной среды.
5. Нарезанных суспензию клеток вверх и вниз прогрессирует через 18 G и 20 G иглы, 20 раз каждый. Фильтрации суспензии клеток через стрейнер ячейки 70 мкм и собирать потока через в 50 мл трубки.
  Примечание: Предварительное условие ситечко с 500 мкл стерильных фосфат амортизированное saline (PBS) до фильтрации для облегчения прохождения суспензию клеток.
Создание EHBD organoids
1. Центрифуга потока через от шага 2.1.5 на 300 x g 5 мин при 4 ° C.
2. Осторожно удалите супернатант. Ресуспензируйте клеток в 1 мл ледяной стерильные PBS. Перенесите ресуспендирования в новой 1,5 мл трубки. Повторите шаг 2.2.1.
3. После центрифугирования тщательно удалите супернатант промывают ячеек, собранные в нижней части трубки. Ресуспензируйте Пелле клеток в 120 мкл сжиженного ледяной подвале матрицы, закупорить вверх и вниз с помощью Р200 советы.
  Примечание: Клетки Пелле ресуспендирования в подвале матрица должна быть выполнена на льду баня.
4. Пластина 40 мкл клетки ресуспендирования в подвале матрицы в центр хорошо в подогретым пластине 24-хорошо.
  Примечание: Избегайте отсоса воздуха во время манипулирования подвале матрицы для предотвращения формирования пузыря.
5. Возвращение пластину с клетками высокомобильна в подвале матрицы в инкубатор культуры ткани 37 ° C 15 минут или пока не затвердевших подвале матрица. Добавьте 600 мкл посева носителя нагревают до 37 ° C для каждой скважины (Таблица материалов). Возвращение пластину в инкубатор культуры ткани 37 ° C.
6. Замените средство заполнения 600 мкл свежие органоид питательной среды в 3 дней и каждые 3 дней после этого. Монитор органоид рост с инвертированным микроскопом. Использование organoids течению приложения или Сплит каждые 7 до 9 дней до накопления мусора и органоид распада внутрипросветная наблюдаются (рис. 2A).

3. EHBD органоид прохода и хранения

Прохождение EHBD organoids 1:3 до 1:4 каждые 7 до 9 дней
1. Удалите носитель из колодца и 400 мкл ледяной PBS. Ресуспензируйте organoids, нежно дозирование смеси вверх и вниз 10 раз в колодец. Передача смеси 1.5 мл.
2. Проход смесь через иглу 25 G 4 раза не присоединяться organoids. Центрифуга смеси на 400 x g 4 мин при 4 ° C.
3. Тщательно удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки в подвале матрица (1:3 до 1:4) для дальнейшего культивирования (шаг 2.2.4.) или вымыть клетки с лед холодной PBS для дальнейшей обработки.
  Примечание: Как правило 250-300 клетки покрыты в пластину 24-хорошо для нисходящие приложения. Покрытие эффективность может оцениваться по микроскопии яркие поля с помощью инвертированного микроскопа на 3-5 день после пассированый путем подсчета количества organoids и расчета их процент от количества первоначальных клеток. мРНК могут быть изолированы от EHBDOs, промывают в PBS, используя стандартный протокол, с помощью Гуанидиновые тиоцианат фенол хлороформ добычи.
Длительное хранение EHBD organoids
1. Удалите носитель из колодца и мыть organoids с комнатной температуре PBS. Удаление PBS из колодца не нарушая падение матрица подвале.
2. 500 мкл ледяной ячейки замораживание среднего колодец. Нежно ресуспензируйте organoids в сжиженный подвале матрицы и замораживание среднего и перенесите смесь в криогенных флаконов.
3. Храните флаконов на-80 ° C в течение 48 ч. Передача пузырьки азота бак для длительного хранения в паровой фазе.

4. EHBD органоид Pprocessing для встраивания парафин

Ресуспензируйте EHBDOs в 500 мкл ледяной PBS (4 ° C), закупорить вверх и вниз 5-10 раз. Сбор ресуспензированы EHBDO в матрице сжиженного подвал в 1,5 мл.
Примечание: Чтобы избежать нарушения organoids, отрезать дно 2-3 мм кончика P1000 и очень тщательно удалить супернатант.
Центрифуги EHBD organoids на 350 x g 5 мин тщательно удалить супернатант не нарушая органоид Пелле.
Добавьте 1 mL ледяной параформальдегида 4% (PFA) organoids и инкубировать organoids в 4%, PFA на ночь при 4° C. Удалите 4% PFA от organoids с помощью кончика P1000 после ночи инкубации.
Добавить 1000 мкл комнатной температуры PBS в трубку с organoids и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре (RT). Центрифуга трубку с organoids в PBS на 350 x g 5 мин повторить этот процесс еще два раза.
Удаление PBS и добавьте 1 мл 30% этанола organoids. Инкубируйте 5 мин на RT.
Центрифуга трубки на 350 x g 5 мин на RT. Remove 30% этанола. Добавить 1 мл 70% этанола и инкубировать в течение 5 мин на RT.
Центрифугировать на 350 x g для 5 минут удалить 70% этанола. Добавьте 1 mL 100% этанола и инкубировать в течение 5 мин на RT.
Примечание: Organoids может храниться в 100% этанола при комнатной температуре до 48 ч. перед дальнейшей обработкой.
Тепла образец обработки гель в микроволновую печь на 20 s или до тех пор, пока сжиженный. Добавьте 50 мкл образца обработки гель в трубку с organoids. Поместите трубки на льду, до тех пор, пока образец обработки гель затвердевает.
Удаление капля образца обработки гель с organoids из трубки и место между колодками синий Губка в кассету для дальнейшей обработки в ткани процессора. Использовать 15 минут для каждого шага в парафин embedder во время дальнейшей обработки...
Раздел organoids парафин врезанных в образец обработки гель на 4 µm. Продолжайте с применением иммуногистохимического окрашивания как описано¹⁶.

Результаты

Наш протокол описывает поколения organoids EHBD мыши, ткане- и взрослых стволовых клеток. После искусственного organoids, формирования кистозных структуры могут наблюдаться как 1 день после EHBD изоляции. Загрязнение с фибробластов не наблюдается обычно во время создания культуры...

Обсуждение

Эта работа описывает поколение 3-мерной модели мыши EHBD cholangiocytes organotypic. Важные шаги в EHBDO культуры поколения включают в себя тщательное EHBD рассечение во избежание заражения клеток поджелудочной железы, поддержание стерильных условий для предотвращения бактериального и грибкового зараж...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что они имеют не конкурирующие интересы.

Благодарности

Эта работа была поддержана американской ассоциации исследование печени заболевания Pinnacle премии (чтобы н.р.) и национальных институтов здравоохранения, национального института диабета и пищеварения и заболевания почек (награды Р30 DK34933 н.р., P01 DK062041 до J.L.M.). Мы благодарим д -р Рамон Ocadiz-Руис (Мичиганский университет) за его помощь в разработке этой методологии.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
L-WRN cell culture medium
Advanced DMEM/F12		Life Technologies	12634-010
Fetal Bovine Serum (FBS)	1%	Life Technologies	10437-028
Penicillin-Streptomycin	100 U/mL	Life Technologies	15140-122
Washing buffer
Phosphate Buffered Saline (PBS)	50 mL	Life Technologies	10010-023
Penicillin-Streptomycin	125 U/mL	Life Technologies	15140-122
Amphotericin B	6.25 µg/mL	Life Technologies	15290-018
Organoid culture medium
L-WRN Conditioned medium	1:1	ATCC	CRL-3276
Advanced DMEM/F12	1:1	Life Technologies	12634-010
Penicillin-Streptomycin	100 U/mL	Life Technologies	15140-122
N-Glutamine	10 µl/mL	Life Technologies	35050-061
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid, HEPES	10 mM	Life Technologies	15630-080
B27	10 µl/mL	Gibco	17504-044
N2	10 µl/mL	Gibco	17502-048
Organoid seeding medium
Organoid culture medium
Epidermal growth factor (EGF)	50 ng/mL	Invitrogen	PMG8041
Fibroblast growth factor-10 (FGF10)	100 ng/mL	PeproTech	100-26
Primary antibodies
Anti-Cytokeratin 19 (CK19) antibody, Rabbit	1:250	Abcam	ab53119
Sex-Determining Region Y-Box 9 (SOX9) antibody, Rabbit	1:200	Santa Cruz	sc-20095
Pancreatic Duodenal Homeobox 1 (PDX1) antibody, Rabbit	1:2000	DSRB	F109-D12
E-cadherin antibody, Goat	1:500	Santa Cruz	sc-31020
Acetylated α-tubulin antibody, Mouse	1:500	Sigma-Aldrich	T6793
Secondary antibodies
488 labeled anti-rabbit, Donkey IgG	1:1000	Invitrogen	A-21206
594 labeled anti-goat, Donkey IgG	1:1000	Invitrogen	A-11058
568 labeled anti-mouse, Goat IgG2b	1:500	Invitrogen	A-21144
TopFlash Wnt reporter assay
TopFlash HEK293 cell line		ATCC	CRL-1573
Luciferase Assay Kit		Biotium	30003-2
0.05% Trypsin-EDTA		Life Technologies	25300054
0.4% Trypan Blue Solution		Life Technologies	15250061
Additional materials and reagents
Basement matrix, phenol free Matrigel		CORNING	356237
Dissociation buffer, Accutase		Gibco	A1110501
Cell culture freezing medium, Recovery		Life Technologies	12648010
Cell strainer (70 µm, steriled)		Fisherbrand	22363548
Guanidinium thiocyanate-phenol RNA extraction, TRIzol		Invitrogen	15596026
Specimen processing gel, HistoGel		Thermo Fisher Scientific	HG-4000-012
Universal mycoplasma detection kit		ATCC	30-1012K
1.5 mL microcentrifuge tube		Fisherbrand	05-408-129
24 well plate		USA Scientific	CC7682-7524
50 mL conical centrifuge tube		Fisher scientific	14-432-22
Fluorescence microscope		Nikon	Eclipse E800
Inverted microscope		Biotium	30003-2
Necropsy tray		Fisherbrand	13-814-61