Generation von Organellen von Maus extrahepatische Gallenwege

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung einer Maus extrahepatische Gallenwege 3-dimensionale organoide Systems. Diese biliären Organellen können in Kultur Cholangiocyte Biologie gepflegt werden. Biliären Organellen express Marker der Stammvater und biliären Zellen und polarisierten epithelialen Zellen zusammengesetzt sind.

Zusammenfassung

Cholangiopathies, die extrahepatische Gallengänge (EHBDs) beeinflussen, gehören biliären Atresie, Primär sklerosierende Cholangitis und Gallengangskarzinom. Sie haben keine effektive therapeutische Optionen. Werkzeuge, um EHBD zu studieren, sind sehr begrenzt. Unser Ziel war es, eine Organ-spezifischen, vielseitig, Erwachsenen Stammzellen abgeleitet, präklinische Cholangiocyte Modell zu entwickeln, die leicht vom Wildtyp und gentechnisch veränderter Mäuse generiert werden können. So berichten wir über die neuartige Technik der Entwicklung eines EHBD organoide (EHBDO) Kultur von Erwachsenen Maus EHBDs. Das Modell ist kostengünstig, leicht analysiert werden, und hat mehrere downstream-Anwendungen. Im einzelnen beschreiben wir die Methodik der Maus EHBD Isolation und einzelne Zelle Dissoziation, organoide Kultur Einleitung, Fortpflanzung, und langfristige Wartung und Lagerung. Dieses Manuskript beschreibt auch EHBDO Verarbeitung für Immunohistochemistry, Fluoreszenz-Mikroskopie und mRNA Fülle Quantifizierung durch Echtzeit-quantitative reverse Transkription Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR). Dieses Protokoll hat deutliche Vorteile neben der Produktion von EHBD-spezifische Organellen. Die Verwendung eines konditionierten Mediums aus L-WRN Zellen reduziert deutlich die Kosten für dieses Modell. Die Verwendung der Maus EHBDs bietet fast unbegrenzte Gewebe für Kultur-Generation, im Gegensatz zu menschlichem Gewebe. Generierte Maus EHBDOs enthalten eine reine Bevölkerung von Epithelzellen mit Markern der endodermische Stammvater und differenzierte biliären Zellen. Kultivierte Organellen homogene Morphologie durch mehrere Gänge zu erhalten und nach längerer für langfristige Lagerung in flüssigem Stickstoff gewonnen werden können. Das Modell ermöglicht die Untersuchung der Gallenwege Stammvater Zellproliferation, pharmakologisch manipuliert werden und kann aus gentechnisch veränderter Mäuse generiert werden. Zukünftige Studien werden benötigt zur Optimierung der Kulturbedingungen um Effizienzsteigerung Beschichtung, funktionale Zelle Reife und direkten Zell-Differenzierung zu bewerten. Entwicklung von Kokulturen Modellen und einer mehr biologisch neutral extrazelluläre Matrix sind ebenfalls wünschenswert.

Einleitung

Cholangiopathies sind unheilbare chronische progressive Störungen, die biliären Zellen in Intra- und extrahepatische Gallenwege Kanäle (EHBDs)¹betreffen. Einige Cholangiopathies, wie primäre sklerosierende Cholangitis, Gallengangskarzinom und biliären Atresie Choledochal Zysten betreffen überwiegend EHBDs. Entwicklung von Therapien für Cholangiopathies ist durch die begrenzte Verfügbarkeit von präklinischen Modellen eingeschränkt. Darüber hinaus früheren Studien konzentrierten sich auf Cholangiopathies zusammengefasst: Leber, Intra- und EHBDs. Allerdings Intra- und EHBDs haben einen ausgeprägten embryonalen Ursprung, und gilt somit als unterschiedliche molekulare Pathologien. Intrahepatischen Gallenwege entwickeln sich aus den intrahepatischen duktalen Platten und der kranialen Teil der hepatischen Divertikel, ganze EHBDs zu entwickeln, aus dem kaudalen Teil des hepatischen Divertikel². Sie verlassen sich auch auf verschiedene Vorläuferzellen Zelle Fächer für Erwachsene Homöostase, einschließlich Kanäle von Hering in intrahepatischen Gallenwege und Peribiliary Drüsen im EHBDs^2,3. Verwendung von Tiermodellen für präklinische Studien wird durch Kosten begrenzt und aus ethischen Gründen minimiert werden. Reduktionistische, reproduzierbare, Zeit und Kosten sparende in-vitro-Modelle sind daher sehr wünschenswert.

Die meisten frühere Studien von Cholangiopathies verwendete normale Maus oder Ratte Krebs Modelle oder menschlichen Gallengangskarzinom Zelllinien aus intra- und EHBDs^4,5,6,7. Aber diese sind Modelle der transformierten Zellen und nicht normal Cholangiocyte Biologie Homöostase oder in einem gesunden Zustand rekapitulieren. Jüngste Fortschritte in der Entwicklung von organotypischen Kultur Modellen ermöglichte die Entwicklung von 3-dimensionalen Strukturen aus verschiedenen Gewebetypen, einschließlich Artischockenblättern Gewebe, obwohl nicht normale Maus EHBDs^{8,9, 10}. Diese "Orgel-ähnlichen" Strukturen abzielen, primäre Gewebe imitiert und in eine künstliche Nische Unterstützung Selbsterneuerung der Organ-spezifischen Stamm/Stammvater Zellen¹¹angebaut.

"Organoide" ist ein breiter Begriff, der meisten allgemein beschreibt 3-dimensionale Gewebemodelle Stammzellen abgeleitet. Organellen können aus umprogrammiert pluripotenten generiert werden Stammzellen vertreten durch embryonale Stammzellen und induzierte pluripotente Stammzellen. Sie können auch aus adulten Stammzellen organspezifischen¹²generiert werden. Einige Cholangiocyte organoide Modelle wurden in früheren Studien vorgeschlagen. So, Organellen, die von menschlicher pluripotenter Stammzellen abgeleitet wurden berichteten^7,9,13 und sind wertvoll, Zeit effiziente Tools, die für die gleichzeitige Erzeugung von verschiedenen Zelltypen ermöglicht. Diese pluripotenten Stammzelle-derived Organellen spiegeln jedoch nicht vollständig die Struktur und Funktionalität der primären adult EHBD Cholangiocytes.

Organellen von adulten Stammzellen des menschlichen⁹ abgeleitet und feline¹⁰ Leber wurden auch vorgeschlagen. Feline Modelle sind nicht weit verbreitet und haben begrenzte Tool Rüstzeug zu Studienzwecken. Darüber hinaus können diese Leber abgeleitet adulten Stem Cell-derived Organellen nicht extrahepatische Cholangiocytes aber eher intrahepatischen Cholangiocytes modellieren.

EHBD organoide Generation wurde von menschlichen normal EHBDs¹⁴ und Maus EHBD Gallengangskarzinom¹⁵berichtet. Allerdings Zugang zu menschlichen EHBD Gewebe ist äußerst begrenzt, und Organellen, abgeleitet von einer genetischen Mausmodell Gallengangskarzinom¹⁵ repräsentieren nicht gesund Cholangiocyte Biologie an der Homöostase und genetisch veränderten Zellen abgeleitet sind.

Um die Grenzen der pluripotenten Stammzelle - und Leber-derived Cholangiocyte organoide Modelle und des eingeschränkten Zugangs zu menschlichem Gewebe benötigt in präklinischen Modellen zu begegnen, haben wir ein EHBD organoide Mausmodell (Abbildung 1A) entwickelt. Dieses Manuskript beschreibt die Entwicklung einer Technik für Maus EHBD-abgeleitete Organellen von Erwachsenen Gewebe. Diese EHBD Organellen benannt EHBDOs werden in-vitro-Instrument für die Untersuchung der Mechanismen, die EHBDs Cholangiocyte Homöostase und Krankheit Prozesse, z. B. Cholangiopathies.

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Protokoll

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der University of Michigan genehmigt.

1. Vorbereitung der Ausrüstung und Materialien für die Maus EHBD Isolierung

1. Bereiten Sie seeding Medium und waschen Puffer (Table of Materials) in 50 mL konische Röhrchen vor und halten sie bei 4 ° C oder auf Eis bis zur Verwendung.
2. Richten Sie eine OP-Tisch (Abb. 1 b). Bereiten Sie sterilisierte chirurgische Instrumenten (Abbildung 1).
3. Legen Sie eine sterile 24-Well-Platte im 37 ° C Gewebekultur Inkubator, es Vorwärmen.
4. Legen Sie eine aliquote Keller Matrix auf Eis. Verwenden Sie Keller Matrix nur, wenn es vollständig verflüssigt ist.

2. EHBD Isolation und biliären organoide Kultur

1. Isolation und Vorbereitung einer einzelnen Zelle Aussetzung der Maus EHBD
   1. Einschläfern Sie Erwachsenen Mäuse (älter als 2 Monate) nach den institutionellen Richtlinien. Platzieren Sie den Mauszeiger in Rückenlage. Öffnen der Bauchhöhle mit einer Mittellinie Ansatz aus- und Einfahren der Leber auf das Zwerchfell.
   2. Der Gallengang befindet sich unmittelbar unterhalb der Leber Hilum durch leichtes Ziehen der proximale Duodenum mit einer Gefäßklemme zu identifizieren. Das umliegende Gewebe mit einer Skalpellklinge trennen Sie EHBD. Halten Sie das proximale Ende der Choledochus mit Zangen, distal oberhalb der Stelle mit den Zwölffingerdarm zu sezieren Sie, dann sezieren Sie das proximale Ende des Kanals aus der Leber (Abbildung 1). Legen Sie sofort isolierte EHBD (Abbildung 1E) in kalten Waschpuffer.
   3. Entfernen Sie die EHBD aus dem Puffer waschen und in 0,5 mm-Abschnitte mit einem sterilen Skalpellklinge Blatt vor den Mund. Legen Sie das Gewebe auf einer Glasplatte auf dem Eis während des Verfahrens (Abbildung 1 b).
   4. Legen Sie die EHBD Abschnitte in ein Röhrchen mit 500 µL des Puffers Dissoziation. 20 min bei 37 ° c inkubieren Neutralisieren Sie die Dissoziation Puffer durch Zugabe von 500 µL eiskalte Zellkulturmedium.
   5. Genannte die Zellsuspension nach oben und unten durch 18 G und 20 G Nadeln, jeweils 20 Mal voran. Filtern Sie die Zellsuspension durch ein 70 µm Zelle Sieb und sammeln Sie der Durchfluss in einem 50 mL-Tube.
      Hinweis: Pre-Zustand das Sieb mit 500 µL steriler Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) vor der Filterung, um den Durchgang von der Zellsuspension zu erleichtern.
2. Aufbau EHBD Organellen
   1. Zentrifuge die Durchströmung von Schritt 2.1.5 bei 300 X g für 5 min bei 4 ° C.
   2. Entfernen Sie vorsichtig den überstand. Die Zellen in 1 mL eiskaltes sterile PBS aufzuwirbeln. Übertragen Sie die Wiederfreisetzung in eine neue 1,5 mL Tube. Wiederholen Sie Schritt 2.2.1.
   3. Entfernen Sie nach Zentrifugation vorsichtig den Überstand aus gewaschenen Zellen am unteren Rohr gesammelt. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 120 µL des verflüssigten eiskalten Keller Matrix durch nach oben und unten mit P200 Tipps pipettieren.
      Hinweis: Zelle Pellet Wiederfreisetzung im Keller Matrix hat auf Eis-Bad durchgeführt werden.
   4. Platte 40 µL der Zelle Wiederfreisetzung im Keller-Matrix in die Mitte eines Brunnens in eine vorgewärmte 24-Well-Platte.
      Hinweis: Vermeiden Sie Absaugen von Luft beim Bearbeiten von Keller-Matrix, um Blasenbildung zu vermeiden.
   5. Die Platte mit Zellen im Keller Matrix in den 37 ° C Gewebekultur Inkubator für 15 Minuten oder bis Keller Matrix verfestigt Nukleinsäuretablette zurück. Fügen Sie 600 µL des Mediums Aussaat in jede Vertiefung (Table of Materials) bis zu 37 ° C erwärmt. Die Platte in der Gewebekultur Inkubator 37 ° C zurück.
   6. Ersetzen Sie die Aussaat Medium mit 600 µL des Kulturmediums frische organoide in 3 Tagen und danach alle 3 Tage. Organoide Wachstum mit einem inversen Mikroskop zu überwachen. Verwendung Organellen für eine nachgeschaltete Anwendung oder Split alle 7 bis 9 Tage vor der Anhäufung von Schutt und organoide Zusammenbruch Intraluminal eingehalten werden (Abbildung 2A).

3. EHBD organoide Passage und Lagerung

1. Durchgang von EHBD Organellen 1:3 bis 1:4 alle 7 bis 9 Tage
   1. Entfernen Sie das Medium aus dem Brunnen und fügen Sie 400 µL eiskaltem PBS hinzu. Aufschwemmen der Organellen durch sanft Pipettieren das Gemisch nach oben und unten 10 Mal in den Brunnen. Übertragen Sie die Mischung auf eine 1,5 mL-Tube.
   2. Passage der Mischung durch eine 25 G Nadel 4 Mal um die Organellen zu distanzieren. Zentrifugieren Sie die Mischung bei 400 X g für 4 min bei 4 ° C.
   3. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und Aufschwemmen der Zellen im Keller Matrix (1:3 bis 1:4) für die weitere Kultivierung (Schritt 2.2.4.) oder Waschen der Zellen mit Eis kaltem PBS zur Weiterverarbeitung.
      Hinweis: 250-300 Zellen sind in der Regel in der 24-Well-Platte für downstream-Anwendungen beschichtet. Plattieren Effizienz kann durch Hellfeld Mikroskopieren mit einem inversen Mikroskop am Tag 3-5 Nach Passagierung durch das zählen der Organellen und berechnen ihre Prozent aus anfänglichen Zellzahl ausgewertet werden. mRNA kann von EHBDOs waschen mit PBS-Puffer über das standard-Protokoll über Guanidinium-Thiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktion isoliert werden.
2. Langzeitlagerung von EHBD Organellen
   1. Entfernen Sie das Medium aus dem Brunnen und waschen Sie die Organellen mit Raumtemperatur PBS. PBS aus dem Brunnen zu entfernen, ohne zu stören den Keller Matrix Tropfen.
   2. Fügen Sie 500 µL eiskalte Zelle Einfrieren Medium zum Brunnen. Sanft Aufschwemmen der Organellen in verflüssigtem Keller Matrix und Zelle Einfrieren Medium und übertragen Sie die Mischung in kryogenen Fläschchen.
   3. Speichern Sie den Fläschchen bei-80 ° C für 48 h Transfer die Fläschchen mit einem Stickstofftank für die langfristige Lagerung in einer Dampfphase.

4. EHBD organoide Pprocessing für die Einbettung von Paraffin

1. Die EHBDOs in 500 µL eiskaltem PBS (4 ° C) durch pipettieren und ab 5 bis 10 Mal aufzuwirbeln. Sammeln Sie resuspendierte EHBDO in verflüssigtem Keller Matrix in eine 1,5 mL-Tube.
   Hinweis: Um zu vermeiden, brechen Organellen, unten ca. 2-3 mm ein P1000-Tip abgeschnitten und den Überstand vorsichtig zu entfernen.
2. Zentrifuge EHBD Organellen bei 350 X g für 5 min. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand ohne störende organoide Pellet.
3. Die Organellen 1 mL eiskaltes 4 % Paraformaldehyd (PFA) hinzu und inkubieren die Organellen in 4 % PFA über Nacht bei 4° c Entfernen Sie die 4 % PFA von Organellen, die mit einer P1000-Spitze nach der Inkubation über Nacht.
4. Das Rohr mit der Organellen 1000 µL der Raumtemperatur PBS hinzufügen und 5 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren. Zentrifugieren Sie dem Rohr mit Organellen mit PBS-Puffer bei 350 X g für 5 min. Wiederholen dieses Prozesses zwei weitere Male.
5. Entfernen Sie PBS zu und fügen Sie 1 mL 30 % Ethanol zu den Organellen. 5 min bei RT inkubieren
6. Zentrifugieren Sie das Rohr auf 350 X g für 5 min bei RT. Entfernen Sie 30 % Ethanol. 1 mL 70 % igem Ethanol zugeben und 5 min bei RT inkubieren
7. Entmischen bei 350 X g für 5 min. entfernen 70 % Ethanol. Fügen Sie 1 mL 100 % Ethanol und 5 min bei RT inkubieren
   Hinweis: Organellen können in 100 % igem Ethanol bei Raumtemperatur für bis zu 48 h vor der Weiterverarbeitung aufzubewahren.
8. Erhitzen Sie Probe Verarbeitung Gel in einer Mikrowelle für 20 s oder bis verflüssigt. Fügen Sie 50 µL der Probe Verarbeitung Gel in das Rohr mit Organellen. Legen Sie das Rohr auf Eis, bis die Probe Verarbeitung Gel verfestigt wird.
9. Entfernen Sie die Tropfen der Probe Verarbeitung Gel mit Organellen aus der Tube und zwischen die blauen Schaumstoffpatrone in einer Kassette zur Weiterverarbeitung in der Gewebe-Prozessor. Verwenden Sie 15 Minuten für jeden Schritt im Paraffin-Embedder, bei der Weiterverarbeitung...
10. Abschnitt Paraffin-eingebetteten Organellen in Probe Verarbeitung gel bei 4 µm. fortfahren mit immunhistochemischen Färbung als zuvor beschriebenen¹⁶.

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Ergebnisse

Unser Protokoll beschreibt die Generation der Maus EHBD Organellen, die gewebespezifische und Erwachsenen Stammzellen abgeleitet sind. Nachdem die Organellen kultiviert werden, kann eine zystische Struktur Formation bereits 1 Tag nach der EHBD Isolation beobachtet werden. Kontamination mit Fibroblasten wird in der Regel nicht während Kultur Generation beobachtet. EHBDO Beschichtung Effizienz beträgt ca. 2 % Wenn Sie isoliert von Neugeborenen oder Erwachsenen (älter als 2 Monate) Mäuse...

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Diskussion

Diese Arbeit beschreibt die Generation eine organotypischen 3-dimensionales Modell der Maus EHBD Cholangiocytes. Wichtige Schritte zur EHBDO Kultur Generation gehören sorgfältige EHBD Dissektion zur Vermeidung von Bauchspeicheldrüse Zelle Kontamination, Wartung von sterilen Bedingungen gegen Bakterien- und Pilzinfektionen Kontamination und sorgfältige Manipulation nach der Zentrifugierung zu vermeiden die Verlust von Zellmaterial. Eine enge Einhaltung der beschriebenen Temperaturbedingungen ist erforderlich. Es gibt ...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
L-WRN cell culture medium
Advanced DMEM/F12		Life Technologies	12634-010
Fetal Bovine Serum (FBS)	1%	Life Technologies	10437-028
Penicillin-Streptomycin	100 U/mL	Life Technologies	15140-122
Washing buffer
Phosphate Buffered Saline (PBS)	50 mL	Life Technologies	10010-023
Penicillin-Streptomycin	125 U/mL	Life Technologies	15140-122
Amphotericin B	6.25 µg/mL	Life Technologies	15290-018
Organoid culture medium
L-WRN Conditioned medium	1:1	ATCC	CRL-3276
Advanced DMEM/F12	1:1	Life Technologies	12634-010
Penicillin-Streptomycin	100 U/mL	Life Technologies	15140-122
N-Glutamine	10 µl/mL	Life Technologies	35050-061
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid, HEPES	10 mM	Life Technologies	15630-080
B27	10 µl/mL	Gibco	17504-044
N2	10 µl/mL	Gibco	17502-048
Organoid seeding medium
Organoid culture medium
Epidermal growth factor (EGF)	50 ng/mL	Invitrogen	PMG8041
Fibroblast growth factor-10 (FGF10)	100 ng/mL	PeproTech	100-26
Primary antibodies
Anti-Cytokeratin 19 (CK19) antibody, Rabbit	1:250	Abcam	ab53119
Sex-Determining Region Y-Box 9 (SOX9) antibody, Rabbit	1:200	Santa Cruz	sc-20095
Pancreatic Duodenal Homeobox 1 (PDX1) antibody, Rabbit	1:2000	DSRB	F109-D12
E-cadherin antibody, Goat	1:500	Santa Cruz	sc-31020
Acetylated α-tubulin antibody, Mouse	1:500	Sigma-Aldrich	T6793
Secondary antibodies
488 labeled anti-rabbit, Donkey IgG	1:1000	Invitrogen	A-21206
594 labeled anti-goat, Donkey IgG	1:1000	Invitrogen	A-11058
568 labeled anti-mouse, Goat IgG2b	1:500	Invitrogen	A-21144
TopFlash Wnt reporter assay
TopFlash HEK293 cell line		ATCC	CRL-1573
Luciferase Assay Kit		Biotium	30003-2
0.05% Trypsin-EDTA		Life Technologies	25300054
0.4% Trypan Blue Solution		Life Technologies	15250061
Additional materials and reagents
Basement matrix, phenol free Matrigel		CORNING	356237
Dissociation buffer, Accutase		Gibco	A1110501
Cell culture freezing medium, Recovery		Life Technologies	12648010
Cell strainer (70 µm, steriled)		Fisherbrand	22363548
Guanidinium thiocyanate-phenol RNA extraction, TRIzol		Invitrogen	15596026
Specimen processing gel, HistoGel		Thermo Fisher Scientific	HG-4000-012
Universal mycoplasma detection kit		ATCC	30-1012K
1.5 mL microcentrifuge tube		Fisherbrand	05-408-129
24 well plate		USA Scientific	CC7682-7524
50 mL conical centrifuge tube		Fisher scientific	14-432-22
Fluorescence microscope		Nikon	Eclipse E800
Inverted microscope		Biotium	30003-2
Necropsy tray		Fisherbrand	13-814-61