Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

وتقدم بالتفصيل سلسلة من الطرق لتحديد معدل DNRA المحتملة على أساس 14NH4+/15NH4+ التحليلات. NH4+ يتم تحويلها إلى N2O عبر عدة خطوات وتحليلها باستخدام الكروماتوغرافيا الغاز رباعية الروبول- قياس الطيف الشامل.

Abstract

11 - وقد أخذت أهمية فهم مصير النترات (NO3)،−وهي الأنواع N المهيمنة التي يتم نقلها من النظم الإيكولوجية الأرضية إلى النظم الإيكولوجية المائية، في التزايد لأن الأحمال العالمية من النيتروجين قد زادت بشكل كبير بعد التصنيع. إن الحد من النترات الدسيميلية إلى الأمونيوم (DNRA) و التخريب هما عمليتان ميكروبيتان تستخدمان NO3- للتنفس. ومقارنة بالحرمان من التسهّم، لم يتم تحديد كمي لنشاط الـ DNRA إلا بقدر محدود. وقد أدى ذلك إلى عدم كفاية فهم أهمية DNRA في التحولات رقم3والعوامل المنظمة لهذه العملية. والهدف من هذه الورقة هو توفير إجراء مفصل لقياس معدل DNRA المحتمل في العينات البيئية. وباختصار، يمكن حساب معدل DNRA المحتملة من 15N المسمى الأمونيوم(15NH4+) معدل تراكم في 15NO3- إضافة حضانة. 2 - يتألف تحديد التركيزات 14NH4+ و15NH4+ التركيزات الموصوفة في هذه الورقة من الخطوات التالية. أولاً، يتم استخراج NH4+ في العينة ومحاصرة على مرشح زجاجي حموضة كملح الأمونيوم. ثانياً، يتم اجساق الأمونيوم المحاصر ويتأكسد إلى NO3- عبر أكسدة persulfate. ثالثاً، يتم تحويل NO3- إلى N2O عبر denitrifier N2O. وأخيرا، يتم تحليل N2O المحولة باستخدام نظام كروماتوغرافيا الطيفي -الكتلة الغازية التي تم تطويرها سابقا. وقد طبقنا هذه الطريقة على رواسب الأهوار المالحة وحسبنا معدلاتها المحتملة للـ DNRA، مما يدل على أن الإجراءات المقترحة تسمح بتحديد بسيط وأكثر سرعة مقارنة بالطرق الموصوفة من قبل.

Introduction

وقد أدى التركيب الاصطناعي للأسمدة النيتروجينية وتطبيقه على نطاق واسع إلى إزعاج دورة النيتروجين العالمية إلى حد كبير. ويقدر أن نقل النيتروجين التفاعلي من النظم الأرضية إلى النظم الساحلية قد تضاعف منذ زمن ما قبل الثورة الصناعية1. ويُجرَّف جزء كبير من الأسمدة التي تُطبق على حقل معين من التربة إلى الأنهار أو المياه الجوفية، في المقام الأول باعتبارها لا3- 2. وهذا قد يسبب مشاكل بيئية مثل تلوث مياه الشرب، ومغذيات، وتشكيل نقص الأكسجة. NO3- في بيئات المياه يتم إزالتها من أو الاحتفاظ بها في النظام الإيكولوجي عن طريق الاستيعاب البيولوجي ومختلف العمليات الجرثومية. ومن المعروف أن الحرمان من التخريب و anammox هي عمليات إزالة الميكروبات الرئيسية ل NO3−. التكريب هو التخفيض الميكروبي لـ NO3- إلى المنتجات الغازية N (NO و N2O و N2) إلى جانب أكسدة مانح إلكترون، مثل المواد العضوية، مما يقلل من خطر المشاكل المذكورة أعلاه. Anammox تنتج أيضا N2 من NO2- وNH4+; لذلك، فإنه يزيل N غير العضوية من النظام الإيكولوجي. وعلى العكس من ذلك، تعمل الهيئة على الاحتفاظ بـ N في نظام إيكولوجي؛ ومن المسلم به عموما أن يتم تنفيذ DNRA في المقام الأول عن طريق البكتيريا التخمير أو البكتيريا chemolithoautotrophic وأنها تقلل من dissimilatory NO3- إلى التوافر الحيوي وأقل متنقلة NH4+.

وقد أجريت دراسات عن الأراضي المُصابة بالانساب في المقام الأول في النظم الإيكولوجية البحرية أو النظم الإيكولوجية لمصبات الأنهار، مثل رواسب المحيطات أو مصبات الأنهار والمياه، والملح أو تربة الأهوار الملوحة، وتربة المنغروف. النظم الإيكولوجية الساحلية أو البحرية مهمة كخزانات لإزالة NO3- من النظم الإيكولوجية الأرضية، وفي الدراسات السابقة فقد تبين أن DNRA تساهم على مدى مجموعة واسعة جدا من NO3- إزالة (0-99)3،4،5،6،7،8،10،,11،1210،,13،14،15،,16،18.18 وعلاوة على ذلك، وقد ثبت وجود DNRA في مجموعة واسعة من البيئات بما في ذلك بيئات المياه العذبة19، الأرز التربة20، والتربة الغابات21. في حين أظهرت هذه الدراسات أن DNRA يمكن أن تكون قابلة للمقارنة ل denitrification NO3- إزالة، والدراسات التي تقيس نشاط DNRA لا تزال محدودة جدا بالمقارنة مع تلك التي قياس الحرمان.

وقد تم تقييم معدل DNRA باستخدام 15تقنية وضع العلامات النية بالاقتران مع تحليل البيانات عن طريق النماذج التحليلية أو الرقمية. ويستند أحد الحلول التحليلية لحساب معدل DNRA على الزيادة في التخصيب 15N من N4+ تجمع بعد إضافة 15NO3- كمتتبع. 15 N-المسمى NO3- يضاف إلى عينة ومحتضنة، ويمكن بعد ذلك حساب معدل DNRA من التغيرات في نسبة التركيز والنظائر في NH4+ قبل وبعد فترة معينة من الزمن. وفي هذه الورقة، يرد وصف تفصيلي لطريقة لقياس درجة التركيز من NH4+ ونسبة النظائر، المطلوبة لحساب معدل DNRA. أساسا، الأسلوب المبلغ عنه هنا هو مزيج من عدة تقنيات ذكرت سابقا22،23،24،25،26 مع التعديلات المضافة إلى بعض الإجراءات. وتتألف هذه الطريقة من سلسلة من خمسة إجراءات المكون: (1) حضانة عينة بيئية مع تعديل جهاز تتبع النظائر المستقرة، 15NO3-،(2) استخراج واسترداد NH4+ باستخدام "إجراء نشر" مع تعديلات، (3) أكسدة persulfate من NH4+ في العينة، تتكون من السكان الأصليين NH4+ و 15NH4+ مشتقة من 15NO3- عن طريق نشاط DNRA ، إلى NO3- و 15NO3-، (4) التحول الميكروبي اللاحق NO3- و 15NO3- إلى N2O isotopomers عن طريق طريقة denitrifier المعدلة، و (5) القياس الكمي للISOTOPOMers N2O باستخدام الكروماتوغرافيا الغازية -قياس الطيف الشامل (GC/MS). في القسم التالي، أولاً، يتم وصف الإعداد للإجراءات (2) و (4) ثم، بعد ذلك، يتم وصف جميع الإجراءات المكونة الخمسة بالتفصيل.

Protocol

1- إعداد مظروف PTFE لالتقاط الغازية الغازية NH3

  1. ضع قطعة 60 مم من شريط البوليتيترافلورو (PTFE) (25 مم في العرض) على ورقة صغيرة من رقائق الألومنيوم (حوالي 300 مم × 450 ملم في الحجم، مسحت بالإيثانول).
  2. الرماد مرشح الألياف الزجاجية (10 ملم في القطر مع حجم المسام من 2.7 μm) في 450 درجة مئوية لمدة 4 ساعات في فرن الكعك. ضع تصفية الألياف الزجاجية قليلا فوق نقطة الوسط من محور أطول من الشريط (الشكل 1a).
  3. بقعة 20 ميكرولتر من 0.9-مول/ ل H2SO4 على مركز مرشح GF / D، وعلى الفور أضعاف الشريط PTFE باستخدام اثنين من ملاقط: ملاقط ختم مسطحة النهاية والملاقط مباشرة. الخطوات التالية، الخطوات 1.4-1.7، تظهر في الشكل 1 وينبغي أن تتم بسرعة.
  4. قم بقلب شريط PTFE على مرشح GF/D عند الخط المنقط الموضح في الشكل 1a لتشكيل الشكل الموضح في الشكل 1b.
  5. ختم كلا الجانبين عن طريق للطي ثم الضغط بإحكام على الحافة مع ملاقط (الشكل 1c). لا تضغط بشدة، ولا تخدش شريط PTFE.
  6. أضعاف نهاية مفتوحة مع ملاقط، ثم اضغط على الحافة مع ملاقط (الشكل 1d).
  7. ختم نهاية مفتوحة عن طريق الضغط بإحكام على الحافة مع ملاقط (الشكل 1e). يجب عدم الضغط على عامل تصفية GF/D أثناء هذا الإجراء.

2. إعداد الكتلة الحيوية من أكسيد النيتروز احمرار denitrifier نقص، Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens ATCC13985، لطريقة denitrifier

  1. خط 20٪ الغليسيرول مخزون من Pseudomonas الكلورو افيز subsp. aureofaciens ATCC13985 على 1/4 قوة مرق الصويا تريبتون (TSB) لوحات أجار. احتضان لوحات في 25 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام.
  2. نقل مستعمرة الفردي من P. chlororaphis إلى أنبوب اختبار صغير يحتوي على 5 مل من tsb autoclaved المتوسطة والثقافة الهوائية (دون اهتزاز) ليوم واحد في 25 درجة مئوية في الظلام حتى الحصول على أقصى قدر من النمو; وسوف تستخدم هذه الثقافة قبل.
  3. نقل 3 مل من الزراعة المسبقة إلى زجاجة 1-L مع سدادة المطاط السيليكون تحتوي على 1 لتر من أعدت حديثا tSB المعدلة مع 10 ملمول / L KNO323. احتضان الزجاجة أثناء التحريض باستخدام مُحرك في ظروف مظلمة عند درجة حرارة 25 درجة مئوية. بعد زراعة لمدة 8 ساعة، استبدال سدادة المطاط السيليكون مع قبعة المسمار وإغلاق بإحكام. مواصلة زراعة في أنوكسيا بين عشية وضحاها.
  4. جهاز طرد مركزي في ثقافة 18800 س ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية للحصول على الكريات الكتلة الحيوية.
  5. غسل الكتلة الحيوية معبأة ثلاث مرات مع 30 مل من محلول ملحي Dulbecco الفوسفات المخزنة (D-PBS (-)، وhH 7.5)، للقضاء تماما على NO3−. شروط الطرد المركزي هي نفسها كما هو الحال في الخطوة 2.3.
  6. بعد الغسيل، وإعادة تعليق الكتلة الحيوية معبأة مع 30 مل من برنامج تلفزيوني D(-). استخدام 1 مل من نظام التعليق لتحديد كثافة الخلية عن طريق قياس OD600. Pipette 1 مل aliquots من تعليق المتبقية في cryة العقيمة التي تحتوي على 0.8 مل من 45٪ الجلسرين. الحفاظ على المخزونات الجلسرين المعدة عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام (انظر القسم 6).

3- التخلص من الأكسجين والنتريت والنترات من الرواسب العينية

  1. تزن 3.0 غرام (الوزن الرطب) من الرواسب في قارورة زجاجية 20 مل وإضافة 9.0 مل من المياه السطحية لتعليقه (25٪ ث / ث الطين).
  2. ختم القارورة مع سدادة المطاط بوتيل أسود (غسلها مع المياه تبادل الأيونات وتعقيمها عن طريق autoclaving) وقبعة الألومنيوم.
  3. تطهير التعليق واستبدال الهواء بمساحة الرأس مع ع (> 99.99٪ ٪ من 10000000000000000000000000000000000000000000000 في 0.6 لتر / دقيقة لمدة 20 دقيقة باستخدام متعددة.
  4. استبدال غاز ع بغاز فائق النقاء (> 99.99995٪ ) انه عن طريق كنس لمدة 90 ق وشحن انه لمدة 30 ق. كرر هذا الإجراء أربع مرات. تعيين ضغط الغاز على مساحة الرأس إلى 1.5 atm.
  5. احتضان القنينات في 20 درجة مئوية بين عشية وضحاها مع اهتزاز في 150 دورة في الدقيقة في ظل ظروف مظلمة باستخدام شاكر درجة الحرارة الثابتة للقضاء على الأوكسجين المتبقية، والنترات، والنتريت في تعليق الرواسب وغاز مساحة الرأس.

4. تجربة دورة زمنية لتحديد معدل DNRA

  1. استبدال الغاز بمساحة الرأس مع الطازجة فائقة نقية انه باستخدام نفس الإجراء كما هو الحال في الخطوة 3.5 ولكن من دون التكرار الأربعة.
  2. إضافة ركائز المسمى وغير المسمى إلى كل قارورة وفقا للجدول 1 من خلال سدادة المطاط بوتيل باستخدام حقنة الغازية. تطهير الحلول الركيزة المعدة مسبقا في قارورة الزجاج الحجم الكافي باستخدام فائقة نقية He مع الضغط من headspace تعيين إلى 1.5 أجهزة الصراف الآلي لتجنب تلوث الهواء. تجنب الحقن غير المتعمد لأي كمية من الهواء أثناء إجراءات الحقن.
  3. قنينات احتضان في 20 درجة مئوية مع اهتزاز في 150 دورة في الدقيقة. إضافة ركائز لكل قارورة وفقا للجدول 1 واحتضان لمدة 1 ساعة، 3 ح، و 5 ح. بعد وقف الحضانة، اخضاع تعليق الرواسب في القوارير للإجراءات التالية: الخطوات 4-4-4-9.
  4. إزالة غطاء الألومنيوم وقفة المطاط بوتيل من كل قارورة. ثم يضاف KCl (الرماد عند 450 درجة مئوية لمدة 4 ساعات) إلى تعليق الرواسب حتى تركيز نهائي يبلغ حوالي 2 مول/لتر لضمان استعادة NH4+ من الرواسب. أغلق القنينات مع سدادة مطاطية بوتيل وإغلاق الألومنيوم.
  5. هز الرواسب عند 150 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية في ظروف مظلمة لاستخراج NH4+.
  6. نقل كامل تعليق الرواسب في القارورة إلى أنبوب الطرد المركزي البلاستيك 50 مل، والطرد المركزي في 10،000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية.
  7. شطف الجدار الداخلي من حقنة مفتوحة حديثا 10 مل المتاح، وإرفاقه إلى فتح حديثا القابل للتصرف السليلوز خلات مرشح (المسام حجم 0.22 ميكرومتر، 25 ملم في القطر). ثم شطف مرشح الغشاء مع 1 مل من افرا. ضع وحدة المحاقن المشطفة على زجاجة بولي بروبلين واسعة الفم 20 مل.
  8. تصفية عظمى المتبقية من خلال مرشح غشاء خلات في زجاجة PP 20 مل. تخزين مقتطفات مقتطفات في -20 درجة مئوية حتى مزيد من التحليل.

5. التقاط نشر NH4+ في 2M H2SO4 استيعابها إلى GF / D مرشح في المغلف PTFE وأكسدة persulfate من NH4+ إلى NO3-

  1. إعداد حلول قياسية من 14NH4Cl مع تدرجات تركيز 0 ميكرومول /لتر، 10 ميكرومول/لتر، 40 ميكرومول/لتر، 100 ميكرومول/لتر، 200 ميكرومول/لتر، 400 ميكرومول/لتر، 500 ميكرومول/لتر. بالنسبة لتحليل نسبة 15N، قم بإصلاح التركيز الإجمالي للNH4+ إلى 200 ميكرومول/لتر، ثم أعد نسب النظائر من 100:0، 99.5:0.5, 99:1, 93:7, 90:10, 50:50, و 10:90 مع نقية 14NH4Cl و 15NH4حلول كل القياسية.
  2. نقل 30 ملغ من MgO (الرماد في 450 درجة مئوية لمدة 4 ساعات) إلى قارورة زجاجية 20 مل، ووضع المغلف PTFE في القارورة.
  3. نقل 5 مل من عينة أو معيار في القارورة التي تحتوي على MgO ومغلف PTFE، وعلى الفور إغلاق مع سدادة المطاط بوتيل الرمادي. ختم مع غطاء الألومنيوم. إذا كان من المتوقع أن يتجاوز تركيز NH4+ 500 ميكرومول/لتر، قم بتخفيف العينة إلى أقل من 500 ميكرومول/لتر.
  4. هز القنينات عند 150 دورة في الدقيقة لمدة 3 ساعات عند 4 درجات مئوية في ظل ظروف مظلمة.
  5. إزالة غطاء الألومنيوم وقفة المطاط بوتيل. خذ مظروف PTFE من القارورة باستخدام ملاقط نقطة النهاية ، وشطف المغلف والملاقط بالماء تبادل الأيونات تمامًا ، وقم بمسحها بورق مسح ، ثم ضع المغلف على ورق مسح جديد.
  6. افتح مظروف PTFE مع اثنين من ملاقط (استخدام كل من الملاقط مسطحة ونقطة النهاية مستحسن) في الترتيب العكسي الدقيق للطي الذي تم تنفيذه في الخطوات 1.4-1.7.
  7. عقد المنطقة الطرفية من مرشح GF / D، حيث من المفترض H2SO4 أن تكون غير مُسَحَلة، مع ملاقط مسطحة، ونقلها إلى أنبوب اختبار غطاء المسمار 11-mL مع غطاء مبطن PTFE. شطف ملاقط مع المياه تبادل الأيونات، ومسحها مع ورقة المسح.
  8. كرر الخطوات من 5.5 إلى 5.7 للمغلفات المتبقية.
  9. إضافة 1 مل من المياه تبادل الأيونات إلى كل من أنابيب الاختبار، وإغلاق غطاء المسمار، والحفاظ عليه دون أن تهتز لمدة 30 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة ل elute تماما وNH4+ من مرشح GF / D. أثناء هذه الخطوة، تنفيذ الخطوة التالية (الخطوة 5.10) في نفس الوقت.
  10. إعداد محلول persulfate المؤدّد (POR) الكاشف25,26.
    1. لأنه لا يمكن تخزينها، وإعداد المبلغ الدقيق من POR اللازمة لعلاج يوم واحد من العينات.
    2. لإعداد POR لعلاج 50 عينة، صب 100 مل من المياه تبادل الأيونات في زجاجة 200 مل برغي غطاء إضافة 1.52 غرام من NaOH (النيتروجين مجمع تحليل الصف)، 3 غرام من حمض البوريك، و 5 غرام من K2S2O8 (النيتروجين والفوسفور الصف التحليل) في هذا النظام. مباشرة بعد إضافة كل كاشف، يهز الحل حتى يتم حله تماما.
    3. إذا لزم الأمر، نقع زجاجة في الماء الدافئ للمساعدة في حل المواد الكيميائية; ومع ذلك، ينبغي إيلاء الاهتمام فيما يتعلق بتلويث NO3- لأن مياه الصنبور تحتوي عادة على NO3−.
  11. بعد الخطوة 5.8، افتح الغطاء المسماري، إضافة 2 مل من كاشف POR إلى أنبوب الاختبار، وإغلاق الأنبوب بإحكام مع غطاء المسمار لمنع أي فقدان أو تلوث خلال الخطوات التالية.
  12. الوقوف على أنابيب الاختبار على رف، والتفاف عليها في رقائق الألومنيوم مزدوج الطبقات، وأتواصق بها لمدة 1 ساعة في 121 درجة مئوية. الحفاظ على أنابيب في وضع مستقيم خلال هذه الخطوة وتجنب التغيرات السريعة في درجة الحرارة بعد الانتهاء من autoclaving.

6. تحديد NO3- تحويلها من NH4+ بواسطة طريقة denitrifier باستخدام QUADrupole GC / MS

  1. مزيج 100 مل من معقمة 40-mmol/ L الفوسفات العازلة (pH 7.2) و 100 مل من معقمة 30-مليمول/ ل الجلوكوز aseptically (20-mmol/L الفوسفات و 15-mmol/L الجلوكوز; النهائي).
  2. إضافة 1/7.2 حجم من مخزون الجلسرين من P. chlororaphis إلى 200 مل من محلول الجلوكوز الفوسفات في قارورة 300 مل Erlenmeyer، وتطهير مع فائقة نقية هي (> 99.995٪) تيار ل 1 ساعة.
  3. الاستغناء 2.0 مل من تعليق denitrifier في كل قارورة 5-مل. اِقْل القنينات مع سدادة مطاطية من نوع بوتيل رمادي وإغلاق الألومنيوم.
  4. استبدال الهواء بمساحة الرأس مع فائقة نقية هو عن طريق كنس لمدة 3 دقائق وشحن انه لمدة 1 دقيقة. تعيين الضغط الموجب للغاز على مساحة الرأس إلى 1.3 atm لتجنب تلوث الهواء غير مقصود.
  5. حقن 1 مل من عينة أو معيار من خلال سدادة المطاط بوتيل باستخدام حقنة 1 مل المتاح. لاحظ الكمية الدقيقة للعينة التي تم حقنها بالفعل.
  6. احتضان القنينات بين عشية وضحاها في 25 درجة مئوية في ظل ظروف مظلمة.
  7. حقن 0.3 مل من 6-مول / ليرة لبنانية Naة لوقف الحرمان وامتصاص القذف CO2, والتي سوف خلاف ذلك الإخلال بشكل خطير N2تحليل O من قبل GC / MS CO2 و N2O لها نفس الوزن الجزيئي.
  8. تحديد كميات 44N2O، 45N2O، و 46N2O في غاز مساحة الرأس باستخدام QUADrupole GC/MS مع منفذ حقن معدل25. يتم عرض ظروف التشغيل المستخدمة لتحليل GC/MS في الجدول 2.

7 - تحليل البيانات

  1. اشتقاق منحنى المعايرة ل NH4+ التركيز من العلاقة الخطية بين التركيز المعروف من 14NH4+ وكثافات إشارة قياس من مجموع المنتجة 44N2O + 45N2O + 46N2O. اشتقاق منحنى المعايرة للمحتوى 15N من العلاقة الخطية بين الذرة المعروفة٪(أي،. 15N /14N +15N) والذرة المحسوبة باستخدام معادلة المقدمة سابقا27. حساب تركيز 15ن4+ عن طريق ضرب مجموع NH4+ في نسبة 15N من N4+.
  2. حساب معدل DNRA المحتملة باستخدام المعادلات المقدمة في أماكن أخرى28,29,30.

النتائج

وقد استمدت النتائج التمثيلية المعروضة في هذه الورقة من 15تجربة تتبع ن لرواسب الأهوار المالحة. تم إنشاء المستنقعات المالحة التي تم أخذ عينات منها حديثًا في أعقاب زلزال شرق اليابان الكبير عام 2011 في منطقة مون بمدينة كيسن نوما في محافظة مياجي، اليابان. وفي أيلول/سبتمبر ...

Discussion

وقد تم تحديد نسبة تركيز ونظائر NH4+ لتحليل DNRA كمياً باستخدام عدة طرق. وتقاس عموماً بشكل منفصل تركيزات ونسب النظائر من NH4++ بشكل منفصل. يتم عادة قياسالتركيز NH+ 4باستخدام أساليب قياس الألوان بما في ذلك autoanalyzer4،10،

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

نشكر ناوتو تاناكا على المساعدة في جمع البيانات وتطوير البروتوكول. تم دعم جمع العينات من قبل JSPS KAKENHI رقم المنحة 17K15286.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
15N-KNO3SHOKO SCIENCEN15-0197
15N-NH4ClSHOKO SCIENCEN15-0034
20 mL PP bottleSANPLATEC61-3210-18Wide-mouth
Aluminum capMaruemu1307-13No. 20, with hole
Boric acidWako021-02195
CentrifugeHITACHIHimac CR21G II
Deoxygenized Gas Pressure & Replace InjectorSANSIN INDUSTRIALIP-12
Disposable cellulose acetate membrane filterADVANTEC25CS020ASPore size 0.22 µm, 25 mm in diameter
Disposable syringeTermoSS-10SZ10 mL
Disposable syringeTermoSS-01T1 mL
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (-)NISSUI PHARMACEUTICAL5913
Gastight syringeVICI Valco Instruments4075-15010Series A-2, 100 µL
GC/MSshimadzuGCMS-QP2010ultra
GF/DWhatman1823-01010 mm in diameter
Glass vialMaruemu0501-0620 mL
Gray butyl rubber stopperMaruemu1306-03No.20-S
H2SO4Wako192-04696Guaranteed Reagent
K2S2O8Wako169-11891Nitrogen and Phosphorus analysis grade
KClWako163-03545Guaranteed Reagent
KNO3Wako160-04035Guaranteed Reagent
NaOHWako191-08625Nitrogen compounds analysis grade
NH4ClWako017-02995Guaranteed Reagent
Plastic centrifuge tubeASONE1-3500-2250 mL, VIO-50BN
Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciensAmerican Type Culture Collection (ATCC)ATCC 13985Freeze-dried, the type strain of Pseudomonas aureofaciens
PTFE sealing tapeSigma-AldrichZ22188025 mm in width
Reciprocating shakerTAITEC0000207-000NR-10
Screw-cap test tubeIWAKI84-025211 mL
PTFE-lined cap for test tubeIWAKI84-0262
Tryptic Soy BrothDifco Laboratories211825

References

  1. Gruber, N., Galloway, J. N. An Earth-system perspective of the global nitrogen cycle. Nature. 451 (7176), 293-296 (2008).
  2. Galloway, J. N., et al. The Nitrogen Cascade. Bioscience. 53 (4), 341-356 (2003).
  3. Rysgaard, S., Risgaard-Petersen, N., Sloth, N. P., Caumette, P., Castel, J., Herbert, R. Nitrification, denitrification, and nitrate ammonification in sediments of two coastal lagoons in Southern France. Coastal Lagoon Eutrophication and Anaerobic Processes (C.L.E.AN.). Developments in Hydrobiology. 117, 133-141 (1996).
  4. Christensen, P. B., Rysgaard, S., Sloth, N. P., Dalsgaard, T., Schwærter, S. Sediment mineralization, nutrient fluxes, denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonium in an estuarine fjord with sea cage trout farms. Aquatic Microbial Ecology. 21, 73-84 (2000).
  5. Tobias, C. R., Anderson, I. C., Canuel, E. A., Macko, S. A. Nitrogen cycling through a fringing marsh-aquifer ecotone. Marine Ecology Progress Series. 210, 25-39 (2001).
  6. An, S. M., Gardner, W. S. Dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) as a nitrogen link, versus denitrification as a sink in a shallow estuary (Laguna Madre/Baffin Bay, Texas). Marine Ecology Progress Series. 237, 41-50 (2002).
  7. Gardner, W. S., et al. Nitrogen fixation and dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) support nitrogen dynamics in Texas estuaries. Limnology & Oceanography. 51 (1), 558-568 (2006).
  8. Preisler, A., et al. Biological and chemical sulfide oxidation in a Beggiatoa inhabited marine sediment. The ISME Journal. 1 (4), 341-353 (2007).
  9. Gardner, W. S., McCarthy, M. J. Nitrogen dynamics at the sediment-water interface in shallow, sub-tropical Florida Bay: why denitrification efficiency may decrease with increased eutrophication. Biogeochemistry. 95 (2-3), 185-198 (2009).
  10. Dong, L. F., et al. Changes in benthic denitrification, nitrate ammonification, and anammox process rates and nitrate and nitrite reductase gene abundances along an estuarine nutrient gradient (the Colne estuary, United Kingdom). Applied and Environmental Microbiology. 75 (10), 3171-3179 (2009).
  11. Koop-Jakobsen, K., Giblin, A. E. The effect of increased nitrate loading on nitrate reduction via denitrification and DNRA in salt marsh sediments. Limnology & Oceanography. 55 (2), 789-802 (2010).
  12. Dong, L. F., et al. Dissimilatory reduction of nitrate to ammonium, not denitrification or anammox, dominates benthic nitrate reduction in tropical estuaries. Limnology & Oceanography. 56 (1), 279-291 (2011).
  13. Fernandes, S. O., Bonin, P. C., Michotey, V. D., Garcia, N., LokaBharathi, P. A. Nitrogen-limited mangrove ecosystems conserve N through dissimilatory nitrate reduction to ammonium. Scientific Reports. 2, 419 (2012).
  14. Behrendt, A., de Beer, D., Stief, P. Vertical activity distribution of dissimilatory nitrate reduction in coastal marine sediments. Biogeosciences. 10 (11), 7509-7523 (2013).
  15. Song, G. D., Liu, S. M., Marchant, H., Kuypers, M. M. M., Lavik, G. Anammox denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonium in the East China Sea sediment. Biogeosciences. 10 (11), 6851-6864 (2013).
  16. Yin, G., Hou, L., Liu, M., Liu, Z., Gardner, W. S. A novel membrane inlet mass spectrometer method to measure 15NH4+15+ for isotope-enrichment experiments in aquatic ecosystems. Environmental Science & Technology. 48 (16), 9555-9562 (2014).
  17. Zheng, Y., et al. Tidal pumping facilitates dissimilatory nitrate reduction in intertidal marshes. Scientific Reports. 6, 21338 (2016).
  18. Bu, C., et al. Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium in the Yellow River Estuary: Rates, Abundance, and Community Diversity. Scientific Reports. 7, 6830 (2017).
  19. Scott, J. T., McCarthy, M. J., Gardner, W. S., Doyle, R. D. Denitrification, dissimilatory nitrate reduction to ammonium, and nitrogen fixation along a nitrate concentration gradient in a created freshwater wetland. Biogeochemistry. 87 (1), 99-111 (2008).
  20. Shan, J., et al. Dissimilatory Nitrate Reduction Processes in Typical Chinese Paddy Soils: Rates, Relative Contributions, and Influencing Factors. Environmental Science & Technology. 50 (18), 9972-9980 (2016).
  21. Silver, W. L., Herman, D. J., Firestone, M. K. Dissimilatory nitrate reduction to ammonium in upland tropical forest soils. Ecology. 82 (9), 2410-2416 (2001).
  22. Holmes, R. M., McClelland, J. W., Sigman, D. M., Fry, B., Peterson, B. J. Measuring 15N–NH4+ in marine, estuarine and fresh waters: An adaption of the ammonia diffusion method for samples with low ammonium concentrations. Marine Chemistry. 60 (3-4), 235-243 (1998).
  23. Sigman, D. M., et al. A bacterial method for the nitrogen isotopic analysis of nitrate in seawater and freshwater. Analytical Chemistry. 73 (17), 4145-4153 (2001).
  24. Weigand, M. A., Foriel, J., Barnett, B., Oleynik, S., Sigman, D. M. Updates to instrumentation and protocols for isotopic analysis of nitrate by the denitrifier method. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 30 (12), 1365-1383 (2016).
  25. Isobe, K., et al. Analytical techniques for quantifying 15N/14N of nitrate, nitrite, total dissolved nitrogen and ammonium in environmental samples using a gas chromatograph equipped with a quadrupole mass spectrometer. Microbes and Environments. 26 (1), 46-53 (2011).
  26. Miyajima, T., Tanaka, Y., Koile, Y. Determining 15N enrichment of dissolved organic nitrogen in environmental waters by gas chromatography/negative-ion chemical ionization mass spectrometry. Limnology and Oceanography. 3 (3), 164-173 (2005).
  27. Stevens, R. J., Laughlin, R. J., Burns, L. C., Arah, J. R. M., Hood, R. C. Measuring the contributions of nitrification and denitrification to the flux of nitrous oxide from soil. Soil Biology and Biochemistry. 29 (2), 139-151 (1997).
  28. Porubsky, W. P., Velasquez, L. E., Joye, S. B. Nutrient-replete benthic microalgae as a source of dissolved organic carbon to coastal waters. Estuaries and Coasts. 31 (5), 860-876 (2008).
  29. Huygens, D., et al. Mechanisms for retention of bioavailable nitrogen in volcanic rainforest soils. Nature Geoscience. 1 (8), 543-548 (2008).
  30. Rutting, T., Boeckx, P., Muller, C., Klemedtsson, L. Assessment of the importance of dissimilatory nitrate reduction to ammonium for the terrestrial nitrogen cycle. Biogeosciences. 8 (7), 1779-1791 (2011).
  31. Song, B., Lisa, J. A., Tobias, C. R. Linking DNRA community structure and activity in a shallow lagoonal estuarine system. Frontiers in Microbiology. 5, 460 (2014).
  32. Cheng, L., et al. Dissimilatory nitrate reduction processes in sediments of urban river networks: Spatiotemporal variations and environmental implications. Environmental Pollution. 219, 545-554 (2016).
  33. Lisa, J. A., Song, B., Tobias, C. R., Hines, D. E. Genetic and biogeochemical investigation of sedimentary nitrogen cycling communities responding to tidal and seasonal dynamics in Cape Fear River Estuary. Estuarine, Coastal and Shelf Science. 167, A313-A323 (2015).
  34. Deng, F. Y., et al. Dissimilatory nitrate reduction processes and associated contribution to nitrogen removal in sediments of the Yangtze Estuary. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 120 (8), 1521-1531 (2015).
  35. Tiedje, J. M., Zehnder, A. J. B. . Biology of Anaerobic Microorganisms. , 179-244 (1988).
  36. Tiedje, J. M., Sexstone, A. J., Myrold, D. D., Robinson, J. A. Denitrification: ecological niches, competition and survival. Antonie van Leeuwenhoek. 48, 569-583 (1982).
  37. Hardison, A. K., Algar, C. K., Giblin, A. E., Rich, J. J. Influence of organic carbon and nitrate loading on partitioning between dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) and N2 production. Geochimica et Cosmochimica Acta. , 164 (2015).
  38. Sigman, D. M., et al. Natural abundance-level measurement of the nitrogen isotopic composition of oceanic nitrate: an adaptation of the ammonia diffusion method. Marine Chemistry. 57 (3-4), 227-242 (1997).
  39. Risgaard-Petersen, N., Rysgaard, S., Revsbech, N. P. Combined microdiffusion-hypobromite oxidation method for determining nitrogen-15 isotope in ammonium. Soil Science Society of America Journal. 59 (4), (1995).
  40. Gardner, W. S., Bootsma, H. A., Evans, C., John, P. A. S. Improved chromatographic analysis of 15N:14N ratios in ammonium or nitrate for isotope addition experiments. Marine Chemistry. 48 (3-4), 271-282 (1995).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

164 DNRA 15N persulfate GC MS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved