Misurazione dei tassi potenziali di riduzione del nitrato dissimiliva all'ammonio sulla base di 14NH4/15NH4- Analisi tramite conversione sequenziale in N2O

Riepilogo

Viene fornita in dettaglio una serie di metodi per determinare il tasso potenziale di DNRA basato⁺ su ¹⁴NH₄^/15NH_{4. L'NH 4}^viene convertito in N₂O attraverso diversi passaggi e analizzato utilizzando la cromatografia a gas quadrupole- spettrometria di massa.

Abstract

L'importanza di comprendere il destino del nitrato (NO₃^-), che è la specie dominante N trasferita dagli ecosistemi terrestri a quello acquatico, è aumentata perché i carichi globali di azoto sono aumentati drammaticamente dopo l'industrializzazione. La riduzione del nitrato dissimile all'ammonio (DNRA) e la denitrificazione sono entrambi processi microbici che utilizzano NO₃^per la respirazione. Rispetto alla denitrificazione, le determinazioni quantitative dell'attività dell'ANRA sono state effettuate solo in misura limitata. Ciò ha portato a una comprensione insufficiente dell'importanza del DNRA nelle trasformazioni NO₃⁻ e dei fattori di regolazione di questo processo. L'obiettivo di questo documento è quello di fornire una procedura dettagliata per la misurazione del potenziale tasso di DNRA nei campioni ambientali. In breve, il tasso potenziale di DNRA può essere calcolato a partire dal tasso di accumulo di ammonio ¹⁵N -¹⁵NH₄^-in ¹⁵NO₃^- incubazione aggiunta. La determinazione delle concentrazioni ¹⁴NH₄^{e 15}NH₄ , descritte in questo documento, comprende le seguenti fasi. In primo luogo,_{l'NH 4}^nel campione viene estratto e intrappolato su un filtro di vetro acidificato come sale di ammonio. In secondo luogo, l'ammonio intrappolato viene elizzato e ossidato a NO₃^- tramite ossidazione persulfata. In terzo luogo, il NO₃^- viene convertito in N₂O tramite un denitrifier N₂O. Infine, il N₂O convertito viene analizzato utilizzando un sistema di spettrometria di gas quadrupolo-massa precedentemente sviluppato. Abbiamo applicato questo metodo ai sedimenti delle paludi salate e calcolato i loro potenziali tassi di DNRA, dimostrando che le procedure proposte consentono una determinazione semplice e più rapida rispetto ai metodi descritti in precedenza.

Introduzione

La sintesi artificiale del fertilizzante azotato e la sua applicazione diffusa hanno notevolmente perturbato il ciclo globale dell'azoto. Si stima che il trasferimento di azoto reattivo dai sistemi terrestri ai sistemi costieri sia raddoppiato dai tempi preindustriali¹. Una porzione significativa di fertilizzanti applicati a un determinato campo viene lavata via dal suolo ai fiumi o alle acque sotterranee, principalmente come NO₃^{- 2}. Ciò può causare problemi ambientali come l'inquinamento dell'acqua potabile, l'eutrofazione e la formazione di ipossia. NO₃^- in ambienti idrici viene rimosso o mantenuto nell'ecosistema tramite assimilazione biologica e vari processi dissimilivi microbici. Denitrificazione e anammox sono noti per essere i principali processi di rimozione microbica per NO₃^. La denitrificazione è la riduzione microbica di NO₃^- a prodotti gassosi N (NO, N₂O e N₂) accoppiata con l'ossidazione di un donatore di elettroni, come le sostanze organiche, riducendo così il rischio dei problemi di cui sopra. Anammox produce anche N₂ da NO₂^e NH₄^; pertanto, rimuove n inorganico da un ecosistema. Al contrario, DNRA lavora per mantenere N in un ecosistema; è generalmente accettato che il DNRA sia eseguito principalmente da batteri fermentanti o chemiolithoautotrofici e che riducano la dissimiltoria NO₃^- a NH₄biodisponibile e meno mobile .⁺

Studi sul DNRA sono stati condotti principalmente in ecosistemi marini o estuari, come sedimenti oceanici o estuari e acqua, sale o terreno paludoso sal brasato e suolo di mangrovie. Gli ecosistemi costieri o marini sono importanti in quanto i serbatoi per la rimozione^del NO₃dagli ecosistemi terrestri, e in studi precedenti DNRA ha dimostrato di contribuire su una gamma molto ampia di NO₃-^rimozione (0-99%)^{3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18}. Inoltre, l'esistenza di DNRA è stata dimostrata in una vasta gamma di ambienti tra cui ambienti^{d'acqua dolce 19}, risaie²⁰e terreni^{forestali 21}. Mentre questi studi hanno dimostrato che il DNRA è potenzialmente paragonabile alla denitrificazione per la rimozione di NO_3,⁻ gli studi che misurano l'attività del DNRA sono ancora molto limitati rispetto a quelli che misurano la denitrificazione.

Il tasso DNRA è stato valutato utilizzando ¹⁵tecniche di etichettatura N in combinazione con l'analisi dei dati tramite modelli analitici o numerici. Una soluzione analitica per calcolare il tasso di DNRA si basa sull'aumento ^{dell'arricchimento 15}N del pool NH₄^dopo l'aggiunta ^{di 15}NO₃^- come tracciante. ^{15 anni} Il N-labeled NO₃^- viene aggiunto a un campione e incubato, e il tasso DNRA può quindi essere calcolato in base alle variazioni del rapporto di concentrazione e isotopo in NH₄^- prima e dopo un certo periodo di tempo. In questo documento, viene descritto in dettaglio un metodo per quantificare_{la concentrazione NH 4}⁺ e il rapporto isotopi, necessari per calcolare il tasso DNRA. Fondamentalmente, il metodo riportato qui è una combinazione di diverse tecniche precedentemente riportate^{22,23,24,25,26} con modifiche aggiunte ad alcune procedure. Il metodo è costituito da una serie di cinque procedure componenti: (1) l'incubazione di un campione ambientale con la modifica di un tracciante isotopo stabile, ¹⁵NO₃^,(2) l'estrazione e il recupero di NH₄⁺ , utilizzando una "procedura di diffusione" con modifiche, (3) persulfare l'ossidazione di NH₄- nel campione, costituito da indigeni NH₄^{e 15}NH₄^- derivati ^{da 15}NO₃^- tramite attività DNRA, in NO₃^{- e 15}NO₃^,(4) successiva trasformazione microbica di NO₃^{− e 3 15}NO₃^- a N₂O isotopomers tramite il metodo denitrifier modificato, e (5) la quantificazione degli isotopomi N₂O utilizzando la cromatografia gassosa-spettrometria di massa (GC/MS).⁺ Nella sezione seguente, in primo luogo, viene descritta la preparazione per le procedure (2) e (4) e successivamente, tutte e cinque le procedure dei componenti sono descritte in dettaglio.

Protocollo

1. Preparazione di una busta PTFE per la cattura quantitativa di NH_{3 gassosa}

1. Posizionare un pezzo di nastro di politetrafluoroetilene (PTFE) (25 mm di larghezza) su un piccolo foglio di lamina di alluminio (circa 300 mm x 450 mm di dimensione, pulito con etanolo).
2. Applicare un filtro in fibra di vetro (10 mm di diametro con una dimensione di poro di 2,7 m) a 450 gradi centigradi per 4 h in un forno a muffolo. Posizionare il filtro in fibra di vetro un po 'sopra il punto medio dell'asse più lungo del nastro (Figura 1a).
3. Individuare 20 L di 0,9-mol/L H₂SO₄ al centro di un filtro GF/D e piegare immediatamente il nastro PTFE utilizzando due pinzette: pinzette a stampa piatta e pinzette a fine retta. I passaggi seguenti, i passaggi 1.4–1.7, sono illustrati nella Figura 1 e devono essere condotti rapidamente.
4. Capovolgere il nastro PTFE sul filtro GF/D sulla linea tratteggiata illustrata nella figura 1a per formare la forma illustrata nella Figura 1b.
5. Sigillare entrambi i lati piegando e quindi premendo saldamente il bordo con le pinzette (Figura 1c). Non premere troppo forte e non graffiare il nastro PTFE.
6. Piegare l'estremità aperta con le pinzette, quindi premere il bordo con le pinzette (Figura 1d).
7. Sigillare l'estremità aperta premendo strettamente il bordo con le pinzette (Figura 1e). Il filtro GF/D non deve essere premuto durante questa procedura.

2. Preparare la biomassa di un denitrifier carente di ossido di azoto, Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens ATCC13985, per il metodo del denitrifier

1. Streak un 20% di glicerolo stock di Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens ATCC13985 su 1/4 forza di brodo di soia prova (TSB) piastre di agar. Incubare le piastre a 25 gradi centigradi per 2-3 giorni.
2. Trasferire una colonia singola di P. chlororaphis in una piccola provetta contenente 5 mL di mezzo TSB autoclaved e coltura aerobicamente (senza agitare) per un giorno a 25 gradi centigradi al buio fino ad ottenere la massima crescita; questo verrà utilizzato come precultura.
3. Trasferire 3 mL della precoltura in una bottiglia da 1 L con un tappo di gomma di silicio contenente 1 L di TSB modificato autoclaved appena preparato integrato con 10 mmol/L KNO₃²³. Incubare la bottiglia mentre si agita utilizzando un agitatore in condizioni scure a 25 gradi centigradi. Dopo aver coltivato per 8 h, sostituire il tappo di gomma di silicio con un tappo a vite e chiudere saldamente. Continuare la coltivazione in anossia durante la notte.
4. Centrifugare la coltura a 18.800 x g per 15 min a 4 gradi centigradi per ottenere pellet di biomassa.
5. Lavare la biomassa confezionata tre volte con 30 mL della salina tamponata di fosfato di Dulbecco (D-PBS(-), pH 7.5), per eliminare completamente il NO₃^. Le condizioni della centrifugazione sono le stesse del punto 2.3.
6. Dopo il lavaggio, sospendere nuovamente la biomassa imballata con 30 mL di D-PBS (-). Utilizzare 1 mL della sospensione per determinare la densità delle cellule misurando OD₆₀₀. Pipette 1 mL aliquots della sospensione rimanente in criovials sterili contenenti 0,8 mL del 45% glicerolo. Conservare le scorte di glicerolo preparate a 80 gradi centigradi fino all'uso (c'è la sezione 6).

3. Eliminazione di ossigeno, nitrito e nitrato dal sedimento del campione

1. Pesare 3,0 g (peso umido) di sedimenti in una fiala di vetro da 20 mL e aggiungere 9,0 mL di acqua di superficie per sospenderlo (25% w/w liquame).
2. Sigillare la fiala con un tappo di gomma butile nero (lavato con acqua scambiata agli ioni e sterilizzato tramite autoclaving) e un tappo di alluminio.
3. Eliminare la sospensione e sostituire l'aria headspace con Ar (>99,99%) a 0,6 L/min per 20 min utilizzando un collettore.
4. Sostituire il gas headspace Ar con ultra-puro (>99.99995%) Egli aspirando per 90 s e caricando Lui per 30 s. Ripetere questa procedura quattro volte. Impostare la pressione del gas headspace su 1,5 atm.
5. Incubare le fiale a 20 gradi centigradi durante la notte con tremori a 150 giri/min in condizioni di buio utilizzando uno shaker a temperatura costante per eliminare l'ossigeno, il nitrato e il nitrito rimanenti nelle sospensioni dei sedimenti e nel gas headspace.

4. Esperimento del corso di tempo per determinare il tasso di DNRA

1. Sostituire il gas headspace con fresco ultra-puro Egli utilizzando la stessa procedura come al punto 3.5, ma senza le quattro ripetizioni.
2. Aggiungere substrati etichettati e non etichettati a ciascuna fiala secondo la tabella 1 attraverso il tappo di gomma butile utilizzando una siringa gastight. Eliminare le soluzioni di substrato precedentemente preparate in fiale di vetro di dimensioni adeguate utilizzando l'acqua ultra-pura He con la pressione dello spazio della testa impostata su 1,5 atm per evitare la contaminazione dell'aria. Evitare l'iniezione involontaria di qualsiasi quantità di aria durante le procedure di iniezione.
3. Incubare fiale a 20 gradi centigradi con agitazione a 150 rpm. Aggiungere i substrati a ciascuna fiala secondo la tabella 1 e incubare per 1 h, 3 h e 5 h. Dopo l'arresto dell'incubazione, sottopone la sospensione dei sedimenti nelle fiale alle seguenti procedure: punti 4.4–4.9.
4. Rimuovere il tappo di alluminio e il tappo di gomma butile da ogni fiala. Quindi, aggiungere KCl (cenere a 450 gradi centigradi per 4 h) alla sospensione dei sedimenti fino a una concentrazione finale di circa 2 mol/L per garantire il recupero di NH₄^- dal sedimento. Chiudere le fiale con un tappo di gomma butile e una chiusura in alluminio.
5. Agitare il sedimento a 150 giri/min per 1 h a 4 gradi centigradi in condizioni scure per estrarre l'NH₄⁺.
6. Trasferire l'intera sospensione dei sedimenti nella fiala in un tubo di centrifuga di plastica da 50 mL e la centrifuga a 10.000 x g per 10 min a 4 gradi centigradi.
7. Sciacquare la parete interna di una siringa usa e getta da 10 mL appena aperta e attaccarla a un filtro a membrana in acetato di cellulosa usa e getta appena aperto (dimensione pore 0,22 m, 25 mm di diametro). Quindi, sciacquare il filtro a membrana con 1 mL di supernante. Posizionare l'unità di filtro della siringa sciacquata su una bottiglia di polipropilene a bocca larga (PP) da 20 mL.
8. Filtrare il supernatant rimanente attraverso un filtro a membrana acetato nella bottiglia PP da 20 mL. Conservare gli estratti estratti a 20 gradi centigradi fino a ulteriori analisi.

5. Catturare NH_{4 diffuso}^- in 2M H₂SO₄ assorbito al filtro GF/D nella busta PTFE e l'ossidazione persulfata di NH₄⁺ - a NO₃⁻

1. Preparare soluzioni standard ^{di 14}NH₄Cl con gradienti di concentrazione di 0 mol/L, 10 mol/L, 40 mol/L, 100 mol/L, 200 mol/L, 400 zmol/L e 500 mol/L. Per ^{l'analisi del rapporto 15}N, fissare la concentrazione totale di NH₄⁺ - a 200 mol/L e preparare i rapporti isotopi di 100:0, 99.5:0.5, 99:1, 93:7, 90:10, 50:50 e 10:90 con ^{puro 14 NH}₄Cl e ¹⁵NH₄Cl soluzioni standard.
2. Trasferire 30 mg di MgO (cenere a 450 gradi centigradi per 4 h) in una fiala di vetro da 20 mL e inserire la busta PTFE nella fiala.
3. Trasferire 5 mL di un campione o di uno standard nella fiala contenente l'MgO e la busta PTFE e chiudere immediatamente con un tappo di gomma grigio butile. Sigillare con un tappo di alluminio. Se si prevede che la concentrazione di NH₄⁺ s.l.a. superi i 500 mol/L, diluire il campione al di sotto di 500 mol/L.
4. Agitare le fiale a 150 giri/min per 3 h a 4 gradi centigradi in condizioni di buio.
5. Rimuovere il tappo di alluminio e il tappo di gomma butile. Togliere la busta PTFE dalla fiala utilizzando una pinzetta a punta, sciacquare accuratamente la busta e le pinzette con acqua scambiata agli ioni, asciugarle con una carta da asciugatura, quindi mettere la busta su una carta da asciugatura fresca.
6. Aprire la busta PTFE con un paio di pinzette (si consiglia l'uso di entrambe le pinzette a fine piatta e puntate) nell'ordine esatto inverso della piegatura eseguita nei passaggi 1.4–1.7.
7. Tenere l'area periferica del filtro GF/D, dove l'H₂SO₄ dovrebbe essere non assorbito, con le pinzette piatte, e trasferirlo in una provetta a vite da 11 mL con un tappo ptFE- foderato. Sciacquare le pinzette con acqua scambiata agli ioni e pulirle con carta da pulire.
8. Ripetere i passaggi da 5.5 a 5.7 per le buste rimanenti.
9. Aggiungere 1 mL di acqua scambiata a ioni a ciascuna delle provette, chiudere il tappo della vite e mantenerlo senza agitare per almeno 30 min a temperatura ambiente per esentare completamente l'NH₄^dal filtro GF/D. Durante questo passaggio, eseguire il passaggio successivo (passaggio 5.10) in parallelo.
10. Preparare il reagente 25 ,^,26.²⁵
    1. Poiché non può essere conservato, preparare l'esatta quantità di POR necessaria per il trattamento di un singolo giorno di campioni.
    2. Per preparare il POR per il trattamento di 50 campioni, versare 100 mL di acqua scambiata agli ioni in una bottiglia di tappo a vite da 200 mL e aggiungere 1,52 g di NaOH (grado di analisi composta da azoto), 3 g di acido borico e 5 g di K₂S₂O₈ (grado di analisi dell'azoto e del fosforo) in questo ordine. Immediatamente dopo aver aggiunto ogni reagente, agitare la soluzione fino a quando non è completamente disciolto.
    3. Se necessario, immergere la bottiglia in acqua tiepida per aiutare la dissoluzione delle sostanze chimiche; tuttavia, si dovrebbe prestare attenzione per quanto riguarda la contaminazione di NO₃^{- perché l'acqua} del rubinetto normalmente contiene NO₃^.
11. Dopo il punto 5.8, aprire il tappo a vite, aggiungere 2 mL del reagente POR alla provetta e chiudere il tubo con un tappo a vite per evitare perdite o contaminazioni durante le seguenti fasi.
12. Resistere alle provette su un rack, avvolgerle in un foglio di alluminio a doppio strato e autoclave per 1 h a 121 gradi centigradi. Mantenere i tubi in posizione eretta durante questa fase ed evitare rapidi cambiamenti di temperatura dopo aver terminato l'autoclaving.

6. Determinazione del NO₃^, convertito da NH_4,⁺ mediante il metodo del denitrifier mediante quadrupole GC/MS

1. Mescolare 100 mL di tampone sterile di fosfato 40-mmol/L (pH 7.2) e 100 mL di glucosio sterile da 30 mmol/L asepticamente (20-mmol/L fosfato e glucosio 15-mmol/L; finale).
2. Aggiungere un volume di 1/7,2 di stock di glicerolo di P. chlororaphis a 200 mL della soluzione di glucosio tamponato al fosfato in una fiaschetta Erlenmeyer da 300 mL ed epurare con un egli ultra puro (>99,995%) flusso per 1 h.
3. Erogare 2,0 mL della sospensione del denitrifier in ogni fiala da 5 mL. Tappa le fiale con un tappo di gomma butile grigio e una chiusura in alluminio.
4. Sostituire l'aria headspace con l'acqua ultra-pura He aspirando per 3 minuti e caricando l'He per 1 min. Impostare la pressione positiva del gas headspace su 1,3 atm per evitare la contaminazione involontaria dell'aria.
5. Iniettare 1 mL di un campione o di uno standard attraverso il tappo di gomma butile utilizzando una siringa usa e getta da 1 mL. Si noti l'esatta quantità del campione effettivamente iniettato.
6. Incubare le fiale durante la notte a 25 gradi centigradi in condizioni di buio.
7. Iniettare 0,3 mL di 6-mol/LL NaOH per fermare la denitrificazione e assorbire lo spazio headspace CO₂, che altrimenti disturberà seriamente l'analisi N₂O di GC/MS perché CO₂ e N₂O hanno lo stesso peso molecolare.
8. Determinare le quantità ^{di 44}N₂O, ⁴⁵N₂O e ⁴⁶N₂O nel gas headspace utilizzando quadrupole GC/MS con una porta di iniezione^{modificata 25}. Le condizioni operative utilizzate per l'analisi GC/MS sono illustrate nella tabella 2.

7. Analisi dei dati

1. Derivare la curva di taratura per l'NH₄^- concentrazione dalla relazione lineare tra la concentrazione nota ^{di 14}NH₄^e l'intensità del segnale misurato del totale ^{prodotto 44}N₂O ^{- 45}N₂O ⁴⁶N₂O. Derivare la curva di calibrazione per il ^{contenuto di 15}N dalla relazione linearetra l'atomo noto%( cioè, ¹⁵N /¹⁴N^{, 15}N) e l'atomo calcolato% utilizzando un'equazione^{fornita in precedenza 27}. Calcolare la concentrazione di ¹⁵NH₄^, moltiplicando il totale NH₄^per il ^{rapporto 15}N di NH₄^.
2. Calcolare il tasso di DNRA potenziale utilizzando equazioni fornite altrove^28,29,30.

Risultati

I risultati rappresentativi presentati in questo documento sono stati ricavati ^{da 15 esperimenti}di N-tracing di sedimenti di paludi salate. La palude salata campiova è stata appena creata all'indomani del terremoto del 2011 nel Grande Giappone orientale nella zona di Moune della città di Kesen-numa nella prefettura di Miyagi, in Giappone. Nel settembre 2017, i sedimenti superficiali (0-3 cm) sono stati raccolti in due siti nelle zone subtidale e intertidale. In primo luogo, s...

Discussione

Il rapporto di concentrazione e isotopo di NH₄^per l'analisi DNRA è stato quantificato utilizzando diversi metodi. Le concentrazioni e i rapporti isotopi di NH₄^sono generalmente misurati separatamente. La concentrazione NH₄^è in genere misurata utilizzando metodi colorimetrici tra cui un autoanalyzer^4,10,15,16,

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
15N-KNO3	SHOKO SCIENCE	N15-0197
15N-NH4Cl	SHOKO SCIENCE	N15-0034
20 mL PP bottle	SANPLATEC	61-3210-18	Wide-mouth
Aluminum cap	Maruemu	1307-13	No. 20, with hole
Boric acid	Wako	021-02195
Centrifuge	HITACHI	Himac CR21G II
Deoxygenized Gas Pressure & Replace Injector	SANSIN INDUSTRIAL	IP-12
Disposable cellulose acetate membrane filter	ADVANTEC	25CS020AS	Pore size 0.22 µm, 25 mm in diameter
Disposable syringe	Termo	SS-10SZ	10 mL
Disposable syringe	Termo	SS-01T	1 mL
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (-)	NISSUI PHARMACEUTICAL	5913
Gastight syringe	VICI Valco Instruments	4075-15010	Series A-2, 100 µL
GC/MS	shimadzu	GCMS-QP2010ultra
GF/D	Whatman	1823-010	10 mm in diameter
Glass vial	Maruemu	0501-06	20 mL
Gray butyl rubber stopper	Maruemu	1306-03	No.20-S
H2SO4	Wako	192-04696	Guaranteed Reagent
K2S2O8	Wako	169-11891	Nitrogen and Phosphorus analysis grade
KCl	Wako	163-03545	Guaranteed Reagent
KNO3	Wako	160-04035	Guaranteed Reagent
NaOH	Wako	191-08625	Nitrogen compounds analysis grade
NH4Cl	Wako	017-02995	Guaranteed Reagent
Plastic centrifuge tube	ASONE	1-3500-22	50 mL, VIO-50BN
Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens	American Type Culture Collection (ATCC)	ATCC 13985	Freeze-dried, the type strain of Pseudomonas aureofaciens
PTFE sealing tape	Sigma-Aldrich	Z221880	25 mm in width
Reciprocating shaker	TAITEC	0000207-000	NR-10
Screw-cap test tube	IWAKI	84-0252	11 mL
PTFE-lined cap for test tube	IWAKI	84-0262
Tryptic Soy Broth	Difco Laboratories	211825