14NH4+/15NH4+ N2O로순차적변환을 통한 분석 에 따른 암모늄에 대한 질산염 감소의 잠재적 비율 측정

요약

^14NH₄+¹⁵NH₄⁺분석을 기반으로 잠재적 DNRA 속도를 결정하는 일련의 방법이 자세히 제공됩니다.⁺ NH₄⁺ 여러 단계를 통해 N₂O로 변환하고 쿼드러폴 가스 크로마토그래피 - 질량 분석법을 사용하여 분석된다.

초록

지상파에서 수생 생태계로 옮겨지는 지배적N종인 질산염(NO₃^3−)의운명을 이해하는 것의 중요성은 산업화 이후 글로벌 질소 하중이 급격히 증가했기 때문에 증가하고 있다. 암모늄 (DNRA)과 탈질화에 대한 실질암염 감소는 호흡을 위해 NO₃- NO^3를 사용하는 미생물 과정입니다. 탈질에 비해 DNRA 활동의 정량적 결정은 제한된 범위까지만 수행되었습니다. 이것은 NO_3에서DNRA의 중요성에 대한 이해가 충분하지 않은 것으로^{이어졌습니다 -} 변환 및이 프로세스의 조절 요인. 이 논문의 목적은 환경 샘플에서 잠재적 DNRA 속도를 측정하기 위한 자세한 절차를 제공하는 것입니다. 간단히 말해서, 잠재적 DNRA 속도는 15 N 라벨 암모늄⁽¹⁵NH₄⁺) 축적 ^속도15NO₃^- 추가 인큐베이션에서 계산 될 수있다. ¹⁵ 본 논문에 기재된 ^14NH₄⁺ 및 ¹⁵NH₄⁺ 농도의 결정은 다음 단계로 구성된다. 첫째, 샘플내의_NH4^+는 암모늄 염으로서 산성유리 필터에 추출및 갇혀 있다. 둘째, 갇힌 암모늄은 영출되어 NO_3로산화됩니다^- persulfate 산화를 통해. 셋째, NO₃^- N₂O 환원 효소 결핍 된 탈모를 통해 N₂O로 변환됩니다. 마지막으로, 변환된_N2O는 이전에 개발된 쿼드러폴 가스 크로마토그래피-질량 분광법 시스템을 사용하여 분석된다. 우리는 소금 습지 퇴적물에이 방법을 적용하고 제안 된 절차가 이전에 설명 된 방법에 비해 간단하고 빠른 결정을 허용한다는 것을 보여 줌, 자신의 잠재적 인 DNRA 속도를 계산했다.

서문

질소 비료의 인공 합성 및 광범위한 응용 프로그램은 크게 글로벌 질소 주기를 혼란. 산업 이전^1회이후 지상파에서 연안 시스템으로의 반응성 질소 전송이 두 배로 증가한 것으로 추정된다. 주어진 필드에 적용 된 비료의 상당 부분은 주로 NO₃^{- 2로,}강이나 지하수에 토양에서 멀리 세척된다. 이것은 식수 오염, 부영양화 및 저산소증의 형성과 같은 환경 문제를 일으키는 원인이 될 수 있습니다. NO₃^- 물 환경에서 생물학적 동화 및 다양한 미생물 경화 과정을 통해 생태계에서 제거되거나 유지됩니다. 탈질 및 anammox는 NO_3에대한 주요 미생물 제거 과정으로 알려져^{있습니다 -}. 탈옥은 NO_3의미생물 감소^-기체 N 제품 (NO, N₂O 및 N₂₎유기 물질과 같은 전자 기증자의 산화와 결합하여 위에서 언급 한 문제의 위험을 감소시킵니다. Anammox는 또한 NO_2에서N_2를 생산하고^- NH₄^+; 따라서 생태계에서 무기 N을 제거합니다. 반대로 DNRA는 생태계에서 N을 유지하기 위해 노력합니다. DNRA는 주로 발효 박테리아 또는 chemolithototrophic 박테리아에 의해 수행 되며 그들은 dissimilatory NO_3을감소 허용^- 생체 이용 및 덜 모바일 NH₄^+.

DNRA에 대한 연구는 주로 해양 또는 에스투아린 퇴적물과 물, 소금 또는 진부한 습지 토양 및 맹그로브 토양과 같은 해양 또는 에스투아린 생태계에서 수행되었습니다. 해안 또는 해양 생태계는 NO^,,₃- 지상 생태계에서^{,제거하기위한} 저수지로서 중요하며, 이전 연구에서 DNRA는 NO₃^,- 제거 (0-99%)^{,3,,4,,5,6,6,7,9,10,11,,912,,13,,14,15,,16, 16,,17,18을}매우 넓은 범위에 걸쳐 기여하는 것으로 나타났습니다. 또한,^{민물환경(19),}논토양^{20, 산림토양(21)}등 다양한 환경에서 DNRA의 존재가 입증되고 있다.²¹ 이러한 연구는 DNRA가 잠재적으로 NO_3에대한 탈결에 필적하는 것으로 나타났습니다^{동안 -} 제거, DNRA 활동을 측정하는 연구는 여전히 매우 제한되는 그 측정 탈질에 비해.

DNRA 속도는 분석 또는 수치 모델을 통한 데이터 분석과 함께 ^15개의N 라벨링 기술을 사용하여 평가되었습니다. DNRA 속도를 계산하는 하나의 분석 용액은 ¹⁵NO₃^-를 추가 한 후 NH₄⁺ 풀의 ¹⁵N 농축의 증가를 기반으로 - 트레이서로. ¹⁵ N-labeled NO₃^- 샘플에 첨가되고 배양되고, DNRA 속도는 NH₄^+의 농도 및 동위원소 비율 변화로부터 일정 기간 전후로 계산될 수 있다. 본 논문에서, DNRA 속도를 계산하는 데 필요한 NH₄₊⁺ 농도 및 동위원소 비율을 정량화하는 방법이 자세히 설명된다. 기본적으로, 여기에 보고된 방법은 이전에 보고된 여러 기술의^{조합으로, 22,,23,,24,,25,,26은} 일부 절차에 추가된 수정을 한다. 이 방법은 5개의 분대 절차의 시리즈로 구성됩니다: (1) 안정된 동위원소 추적기의 개정과 환경 샘플의 인큐베이션, ¹⁵₃⁻ NO₃⁻, (2) 수정과 함께 "확산 절차"를 사용하여₄NH₄⁺ 의 추출 및₄회수, (3) NH 4 ¹⁵⁺ 15 + 15 + 15 + 15 + 15 + 15 + 15 + 15 + 15 + 15₄⁺ 15 + 15 + 15 + 15 + 15 + 15 + 15 + 15 + 15 + 15 + 15 + 15 + 15 + 15 + 15 + 15 + 15 + DNR의⁻ 성분 절차로 구성됩니다. NO₃^- 및 ¹⁵NO₃^-(4) NO 3^{- 15}및 ¹⁵NO⁺ ₃₃- 수정 된 탈질법을 통해 N₂O 이소 토포머에, (5) 가스 크로마토그래피 - 질량 분광법 (GC / MS)을 사용하여 N₂O 이소토포머의 정량화. 다음 섹션에서는, 먼저, 프로시저(2) 및 (4)에 대한 준비가 설명되고, 그 후, 5개의 구성 요소 절차가 모두 상세히 설명된다.

프로토콜

1. 기체 NH_3를 정량적으로 포획하기 위한 PTFE 봉투 준비

1. 알루미늄 호일의 작은 시트 (약 300mm x 450mm 크기, 에탄올로 닦아)의 작은 시트에 폴리테 트라플루오로틸렌 (PTFE) 테이프 (폭 25mm)의 60mm 조각을 놓습니다.
2. 머플 로에서 450°C에서 유리 섬유 필터(직경 2.7 μm의 직경 10mm)를 450°C로 재처리합니다. 테이프의 긴 축의 중간점 위에 유리 섬유 필터를 조금 놓습니다(도1a).
3. GF/D 필터의 중앙에 0.9-mol/L H₂SO_4의 20 μL을 발견하고, 평면 형 스탬프 핀셋과 직선 핀셋의 두 개의 핀셋을 사용하여 PTFE 테이프를 즉시 접습니다. 다음 단계인 1.4-1.7 단계는 그림 1에 표시되며 신속하게 수행해야 합니다.
4. 도 1a에 표시된 점선에서 GF/D 필터 위에 PTFE 테이프를 뒤집어 도 1b에표시된 모양을 형성한다.
5. 접힌 다음 핀셋으로 가장자리를 단단히 눌러 양면을 밀봉하십시오(도1c). 너무 세게 누르지 말고 PTFE 테이프를 긁지 마십시오.
6. 핀셋으로 열린 끝을 접은 다음 핀셋으로 가장자리를 누릅니다(그림1d).
7. 핀셋(도1e)으로가장자리를 단단히 눌러 열린 끝을 밀봉합니다. 이 절차 중에 GF/D 필터를 눌러서는 안 됩니다.

2. 아산화질소 환원효소 결핍 성축제, 슈도모나스 클로로라피스 서브스프의 바이오매스 준비. 아우로파시엔 ATCC13985, 탈질제 방법에 대한

1. 슈도모나클로라피스 서브스프의 20% 글리세롤 육수를 aureofaciens 줄입니다. 플레이트를 2-3일 동안 25°C에서 배양합니다.
2. 최대 성장을 얻을 때까지 어둠 속에서 하루 동안 5 mL의 오토클레이브 TSB 배지 및 배양 (흔들림없이)을 포함하는 작은 시험관에 P. 클로로라피스의 단일 콜로니를 전송; 이것은 사전 문화로 사용됩니다.
3. 10mmol/L KNO 3^23로보충된 갓 준비된 오토클레이브 수정 TSB 1L을 함유한 실리콘 고무 스토퍼가 있는 1-L 병으로 전문화_3mL을전송한다. 25°C의 어두운 조건에서 교반자를 사용하여 교반하는 동안 병을 배양합니다. 8 시간 동안 재배 한 후 실리콘 고무 스토퍼를 나사 캡으로 교체하고 단단히 닫습니다. 하룻밤 동안 무산소증에서 재배를 계속하십시오.
4. 원심분리기는 바이오매스 펠릿을 얻기 위해 4°C에서 15분 동안 18,800 x g의 배양.
5. Dulbecco의 인산염 완충식식염(D-PBS(-), pH 7.5의 30mL로 포장된 바이오매스를 3번 세척하여 NO_3를완전히^{제거합니다.} 원심분리의 조건은 2.3단계와 동일합니다.
6. 세탁 후, 포장 된 바이오 매스를 30 mL의 D-PBS (-)로 다시 중단하십시오. 서스펜션의 1mL을 사용하여 OD_600을측정하여 세포 밀도를 결정한다. 파이펫 1 mL 알리쿼트는 45% 글리세롤의 0.8 mL를 함유한 멸균 극저온으로 남아 있다. 준비된 글리세롤 주식을 사용 전까지 -80°C에서 보존하십시오(섹션 6 참조).

3. 시료 퇴적물에서 산소, 아질산염 및 질산염 제거

1. 20mL 유리 바이알에 퇴적물의 3.0g(젖은 무게)을 계량하고 9.0mL의 표면수를 추가하여 이를 일시 중단합니다(슬러리 25%).
2. 바이알을 검은 색 부틸 고무 스토퍼(이온 교환물로 세척하고 오토클레이빙을 통해 살균)와 알루미늄 캡으로 물기를 밀봉합니다.
3. 서스펜션을 제거하고 헤드스페이스 공기를 Ar(>99.99%)으로 대체합니다. 0.6 L/min에서 20분 동안 매니폴드를 사용하십시오.
4. Ar 헤드스페이스 가스를 초순수(>99995%)로 교체 그는 90 s에 대한 진공 청소기와 30 s에 대한 그 충전하여. 이 절차를 네 번 반복합니다. 헤드스페이스 가스 압력을 1.5atm로 설정합니다.
5. 퇴적물 현탁액 및 헤드 스페이스 가스에서 남은 산소, 질산염 및 아질산염을 제거하기 위해 일정한 온도 셰이커를 사용하여 어두운 조건에서 150 rpm에서 흔들림으로 하룻밤 사이에 20 °C에서 바이알을 배양합니다.

4. DNRA 비율을 결정하기위한 시간 과정 실험

1. 헤드 스페이스 가스를 신선한 초순수로 교체하던 그는 3.5단계에서와 동일한 절차를 사용하지만 네 번의 반복없이 사용한다.
2. 가스가 단단한 주사기를 사용하여 부틸 고무 스토퍼를 통해 표 1에 따라 각 유리병에 라벨이 부착되고 라벨이 부착되지 않은 기판을 추가합니다. 공기 오염을 피하기 위해 헤드 스페이스의 압력으로 1.5 atm로 설정된 초순수 유한 유리 바이알에 이전에 준비된 기판 용액을 제거합니다. 사출 절차 중 공기의 임의의 양의 의도하지 않은 주입을 피하십시오.
3. 150 rpm에서 흔들면 20 °C에서 바이배큐어하십시오. 표 1에 따라 각 바이알에 기판을 추가하고 1시간, 3시간 및 5시간 동안 배양합니다. 잠복이 중단된 후 바이알의 퇴적물 정지를 다음 절차에 따라 4.4-4.9단계.
4. 각 유리병에서 알루미늄 캡과 부틸 고무 스토퍼를 제거합니다. 이어서, 퇴적물 현탁액에 KCl(4시간 동안 450°C)을 추가하여 퇴적물로부터 NH^4+의 회복을₄보장하기 위해 약 2 mol/L의 최종 농도까지 첨가한다. 부틸 고무 스토퍼와 알루미늄 클로저로 바이알을 닫습니다.
5. _NH4⁺추출하는 어두운 조건하에서 4 °C에서 1 50 rpm에서 퇴적물을 흔들어 .
6. 유리병에 있는 전체 퇴적물 현탁액을 50mL 플라스틱 원심분리기 튜브로 옮기고, 원심분리기는 4°C에서 10분 동안 10,000 x g로 옮긴다.
7. 갓 개봉한 10mL 일회용 주사기의 내부 벽을 헹구고, 갓 오픈한 일회용 셀룰로오스 아세테이트 멤브레인 필터(모공 크기 0.22 μm, 직경 25mm)에 부착합니다. 그런 다음 1mL의 상부로 멤브레인 필터를 헹구는 다음. 헹구는 주사기-필터 유닛을 20mL 와이드 입 폴리프로필렌(PP) 병에 놓습니다.
8. 20mL PP 병에 아세테이트 멤브레인 필터를 통해 나머지 상체를 필터링합니다. 추가 분석전까지 추출물 추출물을 -20°C에 저장합니다.

5. 확산 NH₄⁺ 2M H₂SO₄ PTFE 봉투의 GF / D 필터에 흡수 및 NH₄⁺ NO_3의persulfate 산화^-

1. 농도 그라데이션 0 μmol/L, 10 μmol/L, 40 μmol/L, 100 μmol/L, 200 μmol/L, 400 μmol/L, 500 μmol/L 및 500 μmol/L의 농도 그라데이션을 갖춘 ^14개의NH₄Cl의 표준 솔루션을 준비합니다. ^15N비율 분석을 위해 NH^4+의 총 농도를 200 μmol/L로 수정하고 100:0, 99:5:0.5, 99:1, 93:7, 90:10, 50:50 및 10:90 순 ¹⁴NH₄Cl 및 ¹⁵NH₄Cl 표준 솔루션으로 동위원소 비율을 준비한다.₄
2. MgO 30 mgO(4시간 동안 450°C에서 4시간)를 20mL 유리 바이알로 옮기고, PTFE 봉투를 바이알에 놓습니다.
3. MgO 및 PTFE 봉투를 포함하는 유리병에 샘플 또는 표준의 5mL를 전송하고 회색 부틸 고무 스토퍼로 즉시 닫습니다. 알루미늄 캡으로 밀봉하십시오. NH₄^+의 농도가 500 μmol /L을 초과 할 것으로 예상되는 경우 샘플을 500 μmol / L 이하로 희석하십시오.
4. 어두운 조건에서 4 °C에서 3 시간 동안 150 rpm에서 바이알을 흔들어.
5. 알루미늄 캡과 부틸 고무 스토퍼를 제거합니다. 포인트 엔드 핀셋을 사용하여 유리병에서 PTFE 봉투를 꺼내 봉투와 핀셋을 이온 교환 물로 완전히 헹구고 닦은 종이로 닦은 다음 봉투를 신선한 닦은 종이에 놓습니다.
6. 1.4-1.7 단계에서 수행되는 접이식의 정확한 역순으로 몇 개의 핀셋(평평한 끝과 포인트 엔드 핀셋 사용 모두 사용)으로 PTFE 봉투를 엽니다.
7. H₂SO_4가 흡수되지 않은 GF/D 필터의 주변 영역을 평평한 핀셋으로 잡고 PTFE-lined 캡을 사용하여 11mL 나사 캡 테스트 튜브로 전송합니다. 핀셋을 이온 교환물로 헹구고 닦아 종이로 닦아냅니다.
8. 나머지 봉투에 대해 5.5-5.7 단계를 반복합니다.
9. 각 테스트 튜브에 1mL의 이온 교환 물을 추가하고 스크류 캡을 닫고 실온에서 30 분 이상 흔들리지 않고 유지하여 GF / D 필터에서 NH₄⁺ 완전히 엘ute하십시오. 이 단계에서는 다음 단계(5.10 단계)를 병렬로 수행합니다.
10. 퍼설페이트 산화 용액(POR)^{시약(25,,26)을}준비한다.
    1. 저장할 수 없기 때문에 하루 동안 시료를 치료하는 데 필요한 정확한 양의 POR를 준비합니다.
    2. 50개의 시료를 치료하기 위해 POR를 준비하려면 100mL의 이온 교환수를 200mL 스크류 캡 병에 붓고 NaOH(질소 화합물 분석 등급), 붕산 3g,_K2S₂O_8(질소 및 인 분석 등급) 5g을 추가합니다. 각 시약을 추가한 직후 솔루션이 완전히 용해될 때까지 흔들어 줍니다.
    3. 필요한 경우, 화학 물질의 용해를 돕기 위해 따뜻한 물에 병을 담그십시오. 그러나, 주의는 NO_3의오염에 대해 지불해야한다^- 수돗물은 일반적으로 NO_3을포함하기 때문에^-.
11. 5.8 단계 후, 스크류 캡을 열고, 시험관에 POR 시약의 2mL을 추가하고, 다음 단계 동안 손실이나 오염을 방지하기 위해 나사 캡으로 튜브를 단단히 닫습니다.
12. 랙에 테스트 튜브를 서서 이중 층 알루미늄 호일로 감싸고 121 °C에서 1 시간 동안 자동 복제하십시오. 이 단계에서 튜브를 똑바로 세워 두고 오토클레이브를 마친 후 온도가 급격히 변하지 않도록 하십시오.

6. NO₃결정^- 쿼드러폴 GC / MS를 사용하여 디리피어 방법에 의해 NH₄⁺ 변환

1. 멸균 40-mmol/L 인산염 버퍼(pH 7.2)와 멸균 30mmol/L 포도당 100mL(20mmol/L 인산염 및 15-mmol/L 포도당; 최종)를 혼합합니다.
2. 300mL 에렌마이어 플라스크에 인산염 완충 포도당 용액의 200mL에 P. 클로로라피스의 글리세롤 스톡 1/7.2 부피를 추가하고 초순수 He(>99.995%)로 제거합니다. 1 시간 동안 스트림.
3. 각 5mL 바이알에 디리피어 서스펜션의 2.0 mL을 분배합니다. 유리병을 회색 부틸 고무 스토퍼와 알루미늄 클로저로 캡.
4. 헤드스페이스 공기를 3분 동안 진공 청소기로 교체하고 1분 동안 충전합니다. 의도하지 않은 공기 오염을 방지하기 위해 헤드스페이스 가스 양압을 1.3atm로 설정합니다.
5. 1mL 일회용 주사기를 사용하여 부틸 고무 스토퍼를 통해 샘플 또는 표준 1mL을 주입한다. 실제로 주입된 샘플의 정확한 양을 기록합니다.
6. 어두운 조건에서 25 °C에서 하룻밤 동안 바이알을 배양하십시오.
7. 6-mol/LL NaOH의 0.3mL을 주입하여 탈고를 중지하고 헤드스페이스 CO_2를흡수하며, 이는 CO 2 및_N2 O가 동일한 분자량을 가지고 있기 때문에 GC/MS에 의한 N₂₂O 분석을 심각하게 방해할 것이다.
8. 44 N₂O, ⁴⁵N₂O 및 46 N 2O의 양을 결정하여 변형된 사출^{포트(25)를}갖는 쿼드러폴 GC/MS를 이용하여 헤드스페이스 가스에서 ^46N2O의양을 결정한다. ⁴⁴₂ GC/MS 분석에 사용되는 작동 조건은 표 2에표시됩니다.

7. 데이터 분석

1. NH4 +의 공지된₄농도 인 14.NH₄^+와 총 ⁴⁴N 2 O^{+ 45}N₂O + ⁴⁶N₂O의 측정 된 신호 강도 사이의 선형 관계에서 NH ⁴+ 농도에 대한 교정 곡선을 도출한다. 알려진 원자%(즉, ^{15 N/14}N+ 15 N) 및 이전에 제공된^{방정식(27)을}사용하여 계산된 원자%사이의 선형 관계에서i.e¹⁴₂ ^15N함량에 대한 보정 곡선을 도출한다.¹⁵ NH 4 +의 15 N 비율을 곱하여₄^{+ 15 15}NH₄₄^{+의 농도를 계산합니다.}
2. 다른 곳에서 제공되는 방정식을 사용하여 잠재적 DNRA 속도를^{계산28,,29,,30}.

결과

이 논문에 제시된 대표적인 결과는 염습지 퇴적물의 ^15N추적 실험에서 유래하였다. 일본 미야기현 케센누마시 무네 지역에서 2011년 동일본 대지진의 여파로 샘플링된 소금 습지가 새로 만들어졌습니다. 2017년 9월, 하조 와 조간 구역의 두 곳에서 표면 퇴적물(0-3cm)이 수집되었습니다. 첫째, 수집 직후, 퇴적물을 4mm 메쉬를 통해 체질되어 식물 뿌리, 껍질 파편 및 잔해...

토론

DNRA 분석을 위한 NH₄^4+의 농도 및 동위원소 비율은 여러 가지 방법을 사용하여 정량화되었다. NH₄^+의 농도 및 동위원소 비율은 일반적으로 별도로 측정됩니다. NH₄₊⁺ 농도는 전형적으로 자동분석기^{4,10,,15,,,16,,17을}포함하는 색법 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
15N-KNO3	SHOKO SCIENCE	N15-0197
15N-NH4Cl	SHOKO SCIENCE	N15-0034
20 mL PP bottle	SANPLATEC	61-3210-18	Wide-mouth
Aluminum cap	Maruemu	1307-13	No. 20, with hole
Boric acid	Wako	021-02195
Centrifuge	HITACHI	Himac CR21G II
Deoxygenized Gas Pressure & Replace Injector	SANSIN INDUSTRIAL	IP-12
Disposable cellulose acetate membrane filter	ADVANTEC	25CS020AS	Pore size 0.22 µm, 25 mm in diameter
Disposable syringe	Termo	SS-10SZ	10 mL
Disposable syringe	Termo	SS-01T	1 mL
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (-)	NISSUI PHARMACEUTICAL	5913
Gastight syringe	VICI Valco Instruments	4075-15010	Series A-2, 100 µL
GC/MS	shimadzu	GCMS-QP2010ultra
GF/D	Whatman	1823-010	10 mm in diameter
Glass vial	Maruemu	0501-06	20 mL
Gray butyl rubber stopper	Maruemu	1306-03	No.20-S
H2SO4	Wako	192-04696	Guaranteed Reagent
K2S2O8	Wako	169-11891	Nitrogen and Phosphorus analysis grade
KCl	Wako	163-03545	Guaranteed Reagent
KNO3	Wako	160-04035	Guaranteed Reagent
NaOH	Wako	191-08625	Nitrogen compounds analysis grade
NH4Cl	Wako	017-02995	Guaranteed Reagent
Plastic centrifuge tube	ASONE	1-3500-22	50 mL, VIO-50BN
Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens	American Type Culture Collection (ATCC)	ATCC 13985	Freeze-dried, the type strain of Pseudomonas aureofaciens
PTFE sealing tape	Sigma-Aldrich	Z221880	25 mm in width
Reciprocating shaker	TAITEC	0000207-000	NR-10
Screw-cap test tube	IWAKI	84-0252	11 mL
PTFE-lined cap for test tube	IWAKI	84-0262
Tryptic Soy Broth	Difco Laboratories	211825