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要約

144NH4+/15 1415NH4++分析に基づいて潜在的なDNRA率を決定する一連の方法が詳細に提供される。+NH4++は、数ステップでN2Oに変換され、四重極ガスクロマトグラフィー-質量分析を用いて分析されます。

要約

地球から水生生態系に移されたN種の主3−な窒素である硝酸塩の運命を理解することの重要性は、工業化後に世界的な窒素負荷が劇的に増加したため、増加しています。アンモニウム(DNRA)への不シミラトリー硝酸塩の減少および脱窒は、両方ともNO3を使用する微生物プロセスである - 呼吸のために。脱窒と比較して、DNRA活性の定量的決定は限られた範囲でのみ行われてきた。これはNO3変換におけるDNRAの重要性とこのプロセスの調節要因の理解を十分にするに至った。本稿の目的は、環境試料中の潜在的なDNRA率の測定に関する詳細な手順を提供することにある。簡単に言えば、潜在的なDNRA率は、15NO3の15N標識アンモニウム(15NH4+)蓄積率から計算することができる-インキュベーションを加えた。4本論文に記載した14NH4+及び4+15NH4+濃度の判定は、以下の工程から構成される。4 まず、試料中のNH4++を抽出し、アンモニウム塩として酸性化ガラスフィルターに捕閉する。第二に、閉じ込められたアンモニウムは溶出し、過硫酸酸化を介してNO3に酸化される。第三に、NO3−はN2 O還元性デミターゼ欠乏樹を介してN2Oに変換される。2最後に、変換されたN2Oを、以前に開発した四極性ガスクロマトグラフィー質量分析システムを用いて分析する。この方法を塩沼堆積物に適用し、その潜在的なDNRA率を計算し、提案された手順が前述の方法と比較して簡単かつ迅速な決定を可能にすることを実証した。

概要

窒素肥料の人工合成とその広く普及した用途は、世界の窒素サイクルを大きく乱しています。陸上から沿岸システムへの反応性窒素の移動は、工業前の時代1から倍増していると推定される。特定の分野に適用される肥料のかなりの部分は、主にNO3- 2として、土壌から河川や地下水に洗い流されます。これは、飲料水汚染、富栄養化、低酸素症の形成などの環境問題を引き起こす可能性があります。NO3-水環境では、生物学的同化および様々な微生物の崩壊プロセスを介して生態系から除去または保持されます。脱窒とアナモックスはNO 3の主要な微生物除去プロセスであることが知られている3-.脱窒はNO3の微生物還元−ガスN製品(NO、N2O、N2)2と有機物などの電子2ドナーの酸化と相まって、上記の問題のリスクを低減する。アナモックスはまた、NO2からN2を生成する -とNH4+;したがって、生態系から無機Nを除去します。逆に、DNRAは生態系の中でNを保持するために働きます。DNRAは、主に発酵細菌またはケモリトオート栄養菌によって行われ、それらが不シミシ素性NO3を減少させることが一般的に受け入れられている- 生体利用可能で少ない移動式NH4+.

DNRAに関する研究は、海洋または河口堆積物や水、塩または汽水湿原土壌、マングローブ土壌などの海洋または河口生態系で主に行われてきた。沿岸生態系または海洋生態系は、陸上生態系からNO,12,,,3-除去のための貯水池として重要であり、以前の研究ではDNRAは、NO3-除去(0-99%)3、4、5、6、7、8、9、10、11、16、13、14、15、16、18の非常に広い範囲にわたって貢献することが示4,5,6,716,1715,13,14,,10,118,9されています。3,また、DNRAの存在は、淡水環境19、水田土20、林土21など幅広い環境で実証されている。これらの研究は、DNRAがNO3-−除去の脱窒に匹敵する可能性があることを示しているが、DNRA活性を測定する研究は、脱窒を測定するものに比べて依然として非常に限られている。

DNRAレートは、解析モデルまたは数値モデルを使用したデータ解析と組み合わせて、15のNラベル技術を使用して評価されています。DNRAレートを計算する1つの分析ソリューションは、トレーサーとして15NO3を追加した後のNH4++プールの15N濃縮の増加に基づいています。15NラベルNO3-サンプルに添加され、インキュベートされ、DNRA率は、一定期間の前後にNH4++の濃度および同位体比の変化から計算することができます。本論文では、DNRA率の計算に必要なNH4++濃度と同位体比を定量化する方法について詳しく説明する。基本的に、ここで報告される方法は、いくつかの手順に追加された修正を加えたいくつかの以前に報告されたテクニック22、23、24、25、2624,25,26の組み合わせです。22,23この方法は、一連の5つの成分手順で構成される:(1)安定同位体トレーサーの修正による環境試料のインキュベーション3、15NO3−、(2)NH4の4抽出と回収を改変した「拡散手順」を用いて、(3)試料中のNH4++過硫酸酸化、 先住民族のNH34+および15NH4++からなるDNRA活性を介して、NO3-および15NO3−、(4)その後の微生物変換NO33-−および15NO3-−修飾された樹木化法を介したN2Oアイソトポマー、および(5)ガスクロマトグラフィーを用いたN2Oイソトポマーの定量化(GC/MS/MS/GCrome)以降のセクションでは、まず、手順(2)と(4)の準備について説明し、次に、5つのコンポーネントの手順をすべて詳細に説明します。

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プロトコル

1. 気体NH3を定量的に捕捉するためのPTFEエンベロープの調製

  1. 60mmのポリテトラフルオロエチレン(PTFE)テープ(幅25mm)を小さなアルミニウム箔(約300mm x 450mmの大きさ、エタノールで拭く)に貼ります。
  2. 450 °Cで450°Cで4時間、マフレ炉でガラス繊維フィルター(直径10mm、直径2.7μm)をアッシュします。ガラス繊維フィルターをテープの長軸の中間点の少し上に置きます(図1a)。
  3. GF/Dフィルターの中央に0.9モル/L H 2 SO4のスポット20μLを、平坦なスタンプピンセットとストレートエンドピンセットの2つのピンセットを使用してPTFEテープを直ちに折りたたみます。次の手順(手順1.4~1.7)は図1に示されており、迅速に実行する必要があります。
  4. 図 1aに示す点線で PTFE テープを GF/D フィルターの上に反転して、図 1bに示す形状を形成します。
  5. ピンセットで両端を折り、しっかりと押し付けてシールします(図1c)。あまり強く押さないで、PTFE テープを傷つけないでください。
  6. ピンセットで開いた端を折り、ピンセットでエッジを押します(図1d)。
  7. ピンセットで端をしっかりと押して開いた端を密封します(図1e)。この手順では、GF/D フィルタを押す必要はありません。

2. 亜酸化還元分解剤欠損デニトリファイアのバイオマスを調製する, シュードモナスクロロラフィス サブスプ. アウレオファシエンス ATCC13985, 脱窒法用

  1. 1/4強度トリプトン大豆ブロス(TSB)寒天プレートに シュードモナスクロロラフィス サブsp. アウレオファシエンス ATCC13985の20%グリセロールストックをストリーク。プレートを25°Cで2~3日間インキュベートします。
  2. P.クロロラフィスのシングルコロニーを、最大の成長を得るまで暗闇の中で25°Cで1日、5mLのオートクレーブTSB培地および培養物を含む小さな試験管に移す。これは、プレカルチャーとして使用されます。
  3. 前培養の3 mLを、10 mmol/L KNO323を補充して作りたてのオートクレーブ改変TSBの1 Lを含むシリコンゴム栓を備えた1-Lボトルに移す。25°Cの暗い条件下で撹拌しながらボトルをインキュベートします。 8時間栽培した後、シリコンゴム栓をスクリューキャップに交換し、しっかりと閉じます。一晩無酸素で栽培を続ける。
  4. 4°Cで15分間18,800xgの培養物を遠心分離し、バイオマスペレットを得た。 g
  5. 詰まったバイオマスを30 mLのダルベッコリン緩衝生理(D-PBS(-)、pH 7.5)で3回洗浄し、NO3を完全に排除します。遠心分離の条件は、ステップ2.3と同じです。
  6. 洗浄後、パックしたバイオマスを30mLのD-PBS(-)で再び中断します。1 mLの懸濁液を使用して、OD600を測定して細胞密度を決定する。ピペット1 mLの残りの懸濁液のアリコートは、45%グリセロールの0.8 mLを含む無菌性クリオビアルにする。準備したグリセロールストックを使用するまで−80°Cで保存します(セクション6を参照)。

3. 試料堆積物からの酸素、亜硝酸塩、硝酸塩の除去

  1. 20 mLガラスバイアルに3.0g(湿潤重量)の堆積物を計量し、9.0mLの表面水を加え、吊り下げ(25%w/wスラリー)
  2. バイアルを黒いブチルゴムストッパー(イオン交換水で洗浄し、オートクレーブ処理で滅菌)とアルミニウムキャップでシールします。
  3. サスペンションをパージし、ヘッドスペースの空域を Ar (>99.99%)マニホールドを使用して20分間0.6 L/分で。
  4. Arヘッドスペースガスを超純粋(>99.99995%)に交換する彼は90 sのために掃除機をかけ、30 sのために彼を充電することによって。この手順を 4 回繰り返します。ヘッドスペースガス圧力を1.5気圧に設定します。
  5. 一定温度シェーカーを使用して暗い条件下で150rpmで振ると、一晩で20°Cでバイアルをインキュベートし、沈込懸濁液とヘッドスペースガス中の残りの酸素、硝酸塩、亜硝酸塩を除去します。

4. DNRA率を決定するための時間経過実験

  1. ステップ3.5と同じ手順を使用して、ヘッドスペースガスを新鮮な超純粋な彼と交換しますが、4つの繰り返しは必要ではありません。
  2. ガスタイトシリンジを使用してブチルゴムストッパーを通して 表1 に従って各バイアルにラベル付けされた非標識基板を追加します。空気汚染を避けるためにヘッドスペースの圧力を1.5気圧に設定した超純粋なHeを使用して、十分なサイズのガラスバイアルで以前に準備した基板ソリューションをパージします。注入のプロシージャの間に空気の任意の量の意図しない注入を避けてください。
  3. 20°Cでバイアルを150rpmで振るインキュベートする。 表1 に記載の各バイアルに基板を加え、1時間、3時間、5時間インキュベートする。インキュベーションが停止した後、バイアルの堆積物懸濁液を次の手順に従います: ステップ 4.4- 4.9.
  4. 各バイアルからアルミニウムキャップとブチルゴムストッパーを取り外します。次に、沈込懸濁液にKCl(450°Cで4時間)を加え、堆積物から約2モル/Lの最終濃度まで添加し、堆積物からのNH4++の回収を確実にする。ブチルゴムストッパーとアルミニウム閉鎖でバイアルを閉じます。
  5. 暗い条件下で4°Cで150rpmで沈み物を振ってNH4++を抽出する。
  6. バイアルの全堆積物懸濁液を50mLプラスチック遠心管に移し、遠心分離機を10,000 x g で4°Cで10分間移動します。
  7. 開けたばかりの10mLの使い捨てシリンジの内壁をすすいで、開けたばかりの使い捨てセルロースアセテート膜フィルター(孔径0.22μm、直径25mm)に取り付けます。次に、1 mLの上清で膜フィルターをすすいでください。すすいでの注射器フィルターユニットを20 mL幅の口ポリプロピレン(PP)ボトルに置きます。
  8. 残りの上清を、20 mL PPボトルにアセテート膜フィルターでフィルターします。抽出抽出物は、さらに分析されるまで−20°Cで保存してください。

5. 2M H2SO4で拡散 NH4+を PTFE エンベロープの GF/D フィルターに吸収し、NH4+から NO3に過硫酸酸化をキャプチャする -

  1. 濃度勾配0 μmol/L、10 μmol/L、40 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L、500 μmol/L の濃度勾配を備えた14NH4Clの標準ソリューションを準備します。15N比分析では、NH4+~200μmol/Lの全濃度を固定し、100:0、99.5:0.5、99:1、93:7、90:10、50:50、および10:90の純粋な14NH 4 Clおよび15NH4Cl標準溶液の同位体比を調製します。44
  2. MgO(4時間450°Cでアッシュ)の30mgを20mLガラスバイアルに移し、PTFEエンベロープをバイアルに入れます。
  3. サンプルまたは標準の5 mLをMgOおよびPTFEエンベロープを含むバイアルに移し、すぐに灰色のブチルゴム栓で閉じる。アルミキャップ付きシール。NH4++の濃度が500μmol/Lを超えると予想される場合は、サンプルを500μmol/L以下に希釈します。
  4. 暗い条件下で4°Cで3時間150rpmでバイアルを振ります。
  5. アルミニウムキャップとブチルゴム栓を取り外します。ポイントエンドのピンセットを使用してバイアルからPTFEエンベロープを取り出し、封筒とピンセットをイオン交換水で十分に洗い流し、拭き取った紙で拭き取り、新鮮な拭き取り紙の上に封筒を置きます。
  6. ステップ 1.4 ~ 1.7 で実行される折りたたみの正確な逆の順序で、2、3 個のピンセットで PTFE エンベロープを開きます (フラットエンドピンセットとポイントエンド ピンセットの両方の使用をお勧めします)。
  7. H2SO4 が吸収されないはずの GF/D フィルターの周辺領域をフラット エンドピンセットで保持し、PTFE 裏地付きキャップ付きの 11 mL スクリュー キャップ試験管に移します。ピンセットをイオン交換水ですすいで、拭き取った紙で拭きます。
  8. 残りのエンベロープについて、手順 5.5 ~ 5.7 を繰り返します。
  9. 各試験管に1mLのイオン交換水を加え、スクリューキャップを閉じ、室温で少なくとも30分間振らずに維持し、GF/DフィルターからNH4+を 完全に溶出させます。このステップの間に、次のステップ (ステップ 5.10) を並行して実行します。
  10. 過硫酸酸化溶液(POR)試薬25,26,26を調製する。
    1. 保存できないため、1日分のサンプルの処理に必要な正確な量の POR を用意してください。
    2. PORを調製して50サンプルを処理するには、イオン交換水100mLを200mLスクリューキャップボトルに注ぎ、1.52gのNaOH(窒素化合物分析グレード)、ホウ酸3g、K2S2O8(窒素および2リン分析8グレード)を5g加えます。2各試薬を添加した直後に、溶液が完全に溶解するまで振ります。
    3. 必要に応じて、薬品の溶解を助けるために、ぬるま湯にボトルを浸します。しかし、水道水は通常NO 3が含まれているので、NO3の汚染に関3して注意が払われるべきです-.
  11. ステップ5.8の後、ネジキャップを開き、試験管にPOR試薬の2mLを加え、スクリューキャップでチューブをしっかりと閉じて、以下の手順で損失や汚染を防ぎます。
  12. 試験管をラックに置き、二重層アルミニウム箔で包み、121°Cで1時間オートクレーブします。 このステップの間に直立した位置に管を保ち、オートクレーブを終えた後の温度の急速な変化を避ける。

6.− 4重極GC/MSを用いたデニトリフィエ法によりNH4++から変換されたNO3の決定

  1. 滅菌40-mmol/Lリン酸緩衝液(pH 7.2)の100 mLと無菌30-mmol/Lグルコースの100 mLを無菌(20-mmol/Lリン酸および15-mmol/Lグルコース;最終)混合する。
  2. P. クロロラフィス のグリセロールストックの1/7.2容量を300mLのエルレンマイヤーフラスコのリン酸緩衝グルコース溶液の200mLに加え、超純粋なHe(>99.995%)でパージする1 時間のストリーム。
  3. 各5 mL バイアルに歯硝化懸濁液の 2.0 mL を分配します。バイアルにグレーのブチルゴムストッパーとアルミニウムクロージャーをキャップします。
  4. ヘッドスペースの空気を超純粋な彼に置き換えるには、3分間真空を行い、1分間Heを充電します。意図しない空気汚染を避けるために、ヘッドスペースガスの正圧を1.3気圧に設定します。
  5. 1 mL の使い捨てシリンジを使用して、ブチルゴムストッパーを通してサンプルまたは標準の 1 mL を注入します。実際に注入されたサンプルの正確な量に注意してください。
  6. 暗い条件下で25°Cで一晩バイアルをインキュベートします。
  7. 0.3 mLの6-mol/LL NaOHを注入して脱窒を阻止し、ヘッドスペースCO2を吸収し、CO2とN2Oは同じ分子量を有するためGC/MSによる2N2O分析を深刻に妨害する。2
  8. 4重極のGC/MSを使用してヘッドスペースガス内の44N2O、45N2O、および46 442 45N2Oの量を決定し、注入ポート25を修正した。GC/MS 分析に使用される動作条件を表2に示します。

7. データ分析

  1. .NH4++濃度の校正曲線を、既知の濃度14NH4+と、44 N2O+45+ 45N2O+462N2Oの測定信号強度と46の間の線形関係から導出し、既知の原子%(すなわち、15 44N/14N+ 15N)と計算された式27を15用いて算出された27%合計NH4++を15N比で掛けることで15NH4+の15濃度4+を4算出する。
  2. 他の場所で提供される方程式を使用して潜在的なDNRA率を計算します28,,29,,30.

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結果

本論文で発表された代表的な結果は、塩沼堆積物の 15のN-トレーシング実験から導出された。サンプリングされた塩沼は、2011年の東日本大震災の後、宮城県気仙沼市のMoune地区で新たに作られました。2017年9月、亜潮帯と潮間帯の2つの場所で、表面堆積物(0~3cm)が採取されました。まず、採取直後に、堆積物を4mmメッシュでふるいに入れ、植物の根、貝殻の破?...

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ディスカッション

DNRA分析のためのNH4++の濃度および同位体比は、いくつかの方法を用いて定量した。NH4++の濃度と同位体比は、一般に個別に測定される。NH4+濃度は、通常、オートアナライザ4、10、15、16、1710,15,16を含む色分け法を17使用して測定されます。<...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

田中直人氏のデータ収集とプロトコルの開発に感謝します。サンプルのコレクションは、JSPS KAKENHIグラント番号17K15286によってサポートされました。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
15N-KNO3SHOKO SCIENCEN15-0197
15N-NH4ClSHOKO SCIENCEN15-0034
20 mL PP bottleSANPLATEC61-3210-18Wide-mouth
Aluminum capMaruemu1307-13No. 20, with hole
Boric acidWako021-02195
CentrifugeHITACHIHimac CR21G II
Deoxygenized Gas Pressure & Replace InjectorSANSIN INDUSTRIALIP-12
Disposable cellulose acetate membrane filterADVANTEC25CS020ASPore size 0.22 µm, 25 mm in diameter
Disposable syringeTermoSS-10SZ10 mL
Disposable syringeTermoSS-01T1 mL
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (-)NISSUI PHARMACEUTICAL5913
Gastight syringeVICI Valco Instruments4075-15010Series A-2, 100 µL
GC/MSshimadzuGCMS-QP2010ultra
GF/DWhatman1823-01010 mm in diameter
Glass vialMaruemu0501-0620 mL
Gray butyl rubber stopperMaruemu1306-03No.20-S
H2SO4Wako192-04696Guaranteed Reagent
K2S2O8Wako169-11891Nitrogen and Phosphorus analysis grade
KClWako163-03545Guaranteed Reagent
KNO3Wako160-04035Guaranteed Reagent
NaOHWako191-08625Nitrogen compounds analysis grade
NH4ClWako017-02995Guaranteed Reagent
Plastic centrifuge tubeASONE1-3500-2250 mL, VIO-50BN
Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciensAmerican Type Culture Collection (ATCC)ATCC 13985Freeze-dried, the type strain of Pseudomonas aureofaciens
PTFE sealing tapeSigma-AldrichZ22188025 mm in width
Reciprocating shakerTAITEC0000207-000NR-10
Screw-cap test tubeIWAKI84-025211 mL
PTFE-lined cap for test tubeIWAKI84-0262
Tryptic Soy BrothDifco Laboratories211825

参考文献

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