بالبالكامل الإنسان القائم علي الورم مصفوفة في ثلاثه الابعاد كروي الغزو الفحص

Summary

البيئة المجهرية للورم جزء أساسي من نمو السرطان والغزو. لمحاكاة تقدم السرطان ، هناك حاجه إلى مصفوفة بشريه ذات صله بيولوجيا. يقدم هذا البروتوكول تحسينا لاختبار الغزو كروي ثلاثي الابعاد في المختبر من خلال تطبيق مصفوفة قائمه علي الورم العضلي البشري. ويقدم البروتوكول أيضا تحليلا للغزو الخلوي القائم علي الحاسوب.

Abstract

ويشيع استخدام الاختبارات القائمة علي ثقافة الخلية ثنائيه الابعاد في أبحاث السرطان في المختبر. ومع ذلك ، فانها تفتقر إلى العديد من العناصر الاساسيه التي تشكل البيئة المجهرية الورم. للحصول علي نتائج أكثر موثوقيه في المختبر ، تم إدخال عده اختبارات لثقافة الخلايا ثلاثية الابعاد (3D). تسمح هذه الاختبارات للخلايا السرطانية بالتفاعل مع المصفوفة خارج الخلية. يؤثر هذا التفاعل علي سلوك الخلية ، مثل الانتشار والغزو ، بالاضافه إلى شكل الخلية. بالاضافه إلى ذلك ، يمكن لهذا التفاعل ان يحفز أو يقمع التعبير عن العديد من الجزيئات الموالية والمضادة للورم. تم تطوير كروي الغزو لتوفير طريقه مناسبه 3D في المختبر لدراسة غزو الخلايا السرطانية. وفي الوقت الراهن ، تستخدم المصفوفات المشتقة من الحيوانية ، مثل المصفوفة المشتقة من ساركوما الفئران (MSDM) والنوع الأول من الكولاجين من ذيل الجرذان ، في اختبارات الغزو الكروي. مع الأخذ بعين الاعتبار الاختلافات بين البيئة المجهرية للورم البشري والمصفوفات المشتقة من الحيوانية ، تم تطوير مصفوفة مشتقه من الورم العضلي البشري (HMDM) من نسيج الورم العضلي الحميد للرحم. وقد تبين ان HMDM يدفع الهجرة وغزو خلايا سرطان أفضل من MSDM. وقد وفر هذا البروتوكول فحصا بسيطا وقابلا للتكرار وموثوقا به لكروي القائم علي الورم البشري ثلاثي الابعاد باستخدام مصفوفة HMDM/الفايبين. كما يتضمن تعليمات مفصله حول التصوير والتحليل. ينمو الخزان في لوحه المرفقات المنخفضة الشكل U داخل مصفوفة HMDM/الفايبين وتغزو من خلالها. الغزو يتم بشكل يومي ، يقاس ، وتحليلها باستخدام ilastik وفيجي ImageJ البرمجيات. وقد تم إثبات منصة الفحص باستخدام خطوط خلايا سرطان الخلايا الحرشفية الاساسيه والمنتشرة في الحنجرة البشرية. ومع ذلك ، فان البروتوكول مناسب أيضا لخطوط الخلايا السرطانية الصلبة الأخرى.

Introduction

وقد ساهمت الدراسات التقليدية ثنائيه الابعاد (2D) ثقافة الخلية إلى حد كبير في أبحاث السرطان. حاليا, الباحثون يتحولون أكثر نحو ثلاثي الابعاد (3D) اختبارات ثقافة الخلية لتقليد أفضل في ظروف الجسم الحيوي¹. تعكس ثقافة الخلايا السرطانية ثلاثية الابعاد بشكل أدق البيئة المجهرية السرطانية المعقدة من حيث تفاعلات خلايا الخلية ومصفوفات الخلايا ، وملفات تعريف التعبير الجيني ، وحساسية الدواء ، وإشارات نشاط المسار^2،3.

وتستخدم عده نماذج الثقافة خليه 3d في أبحاث السرطان مثل الورم الانسجه الشرح ، والورم علي رقاقه ، والورم متعدد الخلايا خزان^3،4. وتستخدم الآن علي نطاق واسع خزان الورم متعدد الخلايا, كما انها تحاكي العديد من الميزات في الظروف الفيفو في الأورام البشرية^1,5. عندما القطر كروي أكبر من 500 μm, هو يتلقى حتى [هيبوكسيك] مناطق ومركز نخريه, يمثل لذلك ال في [فيفو] ورم حاله².

كثير اصطناعية ([ا. غ.]., [بوليديميثيلسلاكسين]) وحيوانيه-يستنتج ([ا. غ.], جرذ ذيل نوع [اي] كولاجين و فاره [ساركوما]-يستنتج مصفوفة, [متريجل], يشار إلى بما ان [مسدم]) طورت مصفوفات ل 3d خليه ثقافة اختبارات^{3,6 7,8}. حتى الآن ، اي من المصفوفات المتاحة تجاريا قد نشات من انسجه الورم البشري. ولذلك ، فانها تفتقر إلى ميزات البيئة المجهرية الورم البشري ، والتي لها تاثيرات كبيره علي عمليات غزو الخلايا السرطانية⁸.

يتم استخراج myogel (مصفوفة البشرية المشتقة ، المشار اليها باسم HMDM) من الرحم البشري الورم العضلي الانسجه⁹. وقد تبين ان محتوي البروتين من HMDM يختلف كثيرا عن ذلك من MSDM. في الواقع ، 66 ٪ من بروتينات HMDM تختلف عن البروتينات MSDM. من ناحية أخرى, بعض البروتينات, مثل laminin, نوع IV الكولاجين, هيباران كبريتات بروتينيه, nidogen, وعامل نمو البشرة, موجودة في كل من المصفوفات¹⁰. فضلا عن ذلك, يختلف الفاره من الإنسان في انزيم [كنتنتس], مع أناس يتلقى 78 اقل [بروتياسات] من فيران¹¹.

وقد استخدمت فيبين علي نطاق واسع وحدها أو في تركيبه مع غيرها من المواد كماده سقالة¹². في اختبارات ثقافة الخلية ثلاثية الابعاد ، يتم الجمع بين الفيبرينوجين البشرية المتوفرة تجاريا والخلايا الليفية لتشكيل هيدروجيل الليبرين¹².

يصف هذا بروتوكول تحسين من ال سابقا يقدم [ثري د] ورم كروي غزوه فحص⁷. يطبق هذا البروتوكول الجديد مصفوفة مشتقه من الورم البشري بدلا من مصفوفة الورم المشتقة من الفاره. كما انه ينطوي علي تقنيات التصوير والتحليل باستخدام ilastik وفيجي ImageJ البرمجيات. ويمكن استخدام هذا البروتوكول لكروي مقايسة عده خطوط الخلايا السرطانية الصلبة المختلفة. ويقدم أداه ذات الصلة بيولوجيا لتطوير العلاجات المضادة للسرطان الرواية ودراسة اثار جزيئات محدده علي غزو الخلايا السرطانية.

Protocol

1. توليد خزان الورم متعدد الخلايا

ملاحظه: يتم إظهار البروتوكول هنا مع خطوط الخلايا UT-SCC-42A و-42A ولكن يمكن أيضا تطبيقها باستخدام خطوط الخلايا الأخرى.

1. تغسل الخلايا UT-SCC-42A و-42A مع 6 مل من الفوسفات-المحلول الملحي المخزنة ، أضافه 0.05 ٪ تريبسين-أدتا (3 مل ل 75 سم² قارورة) ، ووضع قارورة في الحاضنة ثقافة الخلية (37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO₂، 95 ٪ الرطوبة) لمده 2-5 دقيقه.
2. تاكد من فصل الخلايا تحت المجهر. ثم أضافه كامله دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (dmem) وسائل الاعلام (dmem + 10 ٪ الجنين البقري المصل ، 100 U/ml البنسلين ، 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين ، 250 ng/ml الامفوتيريسن B ، 0.4 ميكروغرام/مل هيدروكورتيزون ، و 50 ميكروغرام/مل حمض الاسكوربيك) لتحييد الانزيم (6 مل ل 75 سم ² قارورة) ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
   ملاحظه: حدد متوسط ثقافة الخلية التي تناسب الخلايا التي يتم دراستها.
3. الطرد المركزي تعليق الخلية في 200 x g لمده 5 دقائق.
4. أزاله ماده طافي وتعليق بيليه الخلية في 2-5 مل من dmem كامله.
5. عد الخلايا وتمييع تعليق الخلية مع DMEM كامله للتركيز النهائي من 20,000 خلايا/مل.
   ملاحظه: يجب تحديد عدد الخلايا الأمثل لكل سطر خليه.
6. الاستغناء عن 50 μL من تعليق الخلية في كل مرفق منخفضه جدا 96-بئر الجولة أسفل لوحه جيدا للتركيز النهائي للخلايا 1,000 في البئر.
7. نقل لوحه إلى حاضنه ثقافة الخلية (37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO₂، 95 ٪ الرطوبة). بعد أربعه أيام ، بصريا تاكيد تكوين كروي الورم مع المجهر المقلوب والمضي قدما في الفحص. تاكد من وجود كروي واحد فقط لكل بئر.
   ملاحظه: يختلف الوقت الذي يتم اتخاذه لتشكيل كروي بين خطوط الخلايا المختلفة.

2. كروي ثلاثي الابعاد الاجتياح الفحص

ملاحظه: اعداد حل 2x لأنه سيتم تخفيف الهلام 1:1 عندما تضاف إلى الآبار.

1. ذوبان hmdm علي الجليد و الفيبرينوجين حل الأسهم في حمام المياه الحفاظ علي 37 درجه مئوية. لا تزعج الفيبرينوجين حتى انها تماما solubilized ولا تضع الحل علي الجليد. سيحدث هطول الامطار.
2. تخلط معا الحجم المناسب لكل كاشف: 1 ملغ/مل HMDM (التركيز النهائي: 0.5 ملغ/مل) ، 0.6 U/ml المستوي (التركيز النهائي: 0.3 U/mL) ، 66.6 mg/mL الابروتينين (التركيز النهائي: 33.3 ميكروغرام/مل) ، و 1 ملغ/مل فيبرينوجين (التركيز النهائي: 0.5 mg/mL ).
   ملاحظه: أضافه الفيبرينوجين فقط قبل الاستغناء عن الخليط في الآبار والعمل بسرعة. فانه سيتم تشكيل هلام في بضع دقائق. عالج قليلا من الآبار في كل مره.
3. أضافه 50 μL من هلام في كل بئر. توجيه غيض نحو الجدار داخل البئر والأنابيب ببطء. تجنب فقاعات الهواء (باستخدام تقنيه التنضيد العكسي) وليس محاولة لنقل كروي من وسط البئر.
4. العودة لوحه مره أخرى إلى الخلية ثقافة الحاضنة والسماح لل HMDM/الفايبين مصفوفة ليصلب لمده 30 دقيقه ، وأضافه بلطف 100 μL من DMEM كامله في كل بئر علي راس هلام.

3-التصوير

1. صوره الخزان يوميا باستخدام مجهر الضوء المقلوب. بدلا من ذلك ، استخدم أنظمه التصوير التلقائي.

4. صوره التجزئة مع Ilastik

1. افتح ilastik وحدد سير عمل تصنيف البكسل (الشكل1ا). فانه يصنف البيكسلات استنادا إلى التعليقات التوضيحية التي ادلي بها المستخدم. حفظ المشروع ilastik (.ilp) إلى الكمبيوتر.
2. أضافه صور للتحليلات. انقر فوق إدخال البيانات وأضافه جديد ثم اختر الصور (الشكل 1ب).
3. لتحديد الميزة ، انقر فوق تحديد الميزة وحدد الميزات (الشكل 1C ، المستطيل الأحمر).
   ملاحظه: يجب ان تتطابق الميزات المحددة تقريبا مع الخصائص المرئية التي تفصل الكائنات من الخلفية ، سيتم استخدامها لتدريب المصنف.
   1. حدد الميزات بالنقر فوق المربعات. ستتحول المربعات المحددة إلى اللون الأخضر (الشكل 1C، المستطيل الأزرق).
      ملاحظه: هنا يمكن للمستخدم تحديد من عده أنواع الميزات المختلفة والمقاييس. يجب تحديد اللون/الكثافة لفصل الكائنات استنادا إلى اللون أو السطوع. يجب تحديد الحافة لفصل الكائنات استنادا إلى السطوع أو تدرجات ألوان. الملمس هو ميزه هامه إذا كانت الكائنات في الصورة لها مظهر التكوينية الخاصة. لهذا الفحص ، يتم استخدام اللون/الكثافة (سيغما 0) والحافة (سيغما 6).
4. للتدريب ، انقر فوق التدريب وفي قسم التدريب هناك نوعان من التسميات: التسمية 1 والتسمية 2 (الشكل 1D ، المستطيل الأحمر). إذا كان هناك تسميه واحده فقط ، أضافه تسميه جديده عن طريق الضغط علي أضافه تسميه (الشكل 1D ، مستطيل ازرق).
   1. وضع علامة علي الخلفية مع واحده من التسميات (الشكل 1d، اصفر) والخلايا مع التسمية الأخرى (الشكل1د، الأزرق).
   2. تدريب البرنامج لأول 10 ٪ من الصور. اختر الصورة التالية من العرض الحالي.
   3. بعد وضع علامة علي الخلايا والخلفية (من الصورة الاولي) ، اضغط علي التحديث المباشر (الشكل 1D، المستطيل الأرجواني).
      ملاحظه: مع الصورة التالية ، سيقوم ilastik تلقائيا باجراء التحليل وفقا للصور السابقة.
5. بعد الانتهاء من التدريب وتحليل ilastik جميع الصور ، انقر فوق التنبؤ التصدير. اختيار تجزئه بسيطه من المصدر ؛ لا تختار الاحتمالات أو اي شيء آخر ( الشكل1ه).
6. اختر تنسيق ملف الإخراج المطلوب من اختيار تصدير إعدادات الصورة. .. في قسم التنبؤ بالتصدير (الشكل1ه). تصدير نتائج وضع العلامات بالنقر فوق تصدير الكل (الشكل 1و). سيتم تصدير الملفات إلى نفس المجلد مع الصور الاصليه.
   ملاحظه: في هذه التجربة ، يتم استخدام تنسيق h5.

5. تحليل المنطقة مع فيجي ImageJ

1. اعداد المقياس
   1. فتح الصورة الاصليه مع شريط مقياس في فيجي ImageJ (الشكل 2ا). تاكد من ان الصورة لها نفس حجم وبعد الصور التي تم تحليلها. استخدم أداه تحديد الخط لرسم خط من طول معروف (الشكل2ب).
      ملاحظه: يتم تنفيذ هذا البروتوكول باستخدام فيجي ImageJ 1.51 (64-bit) و ilastik-1-3-2 rc.
   2. انقر فوق تحليل وتعيين مقياس (الشكل2ج). تعيين المسافة المعروفة في حقل المسافة المعروفة وتعيين الوحدة المناسبة وانقر فوق العمومية ( الشكل 2D).
2. تثبيت الماكرو
   1. إذا لم يتم تثبيت المكون المساعد ilastik ، اتبع الخطوات التالية: انقر فوق تعليمات، تحديث.... في النافذة المفتوحة Imagej محدث، انقر فوق أداره تحديث المواقع. في النافذة المفتوحة أداره تحديث المواقع، انقر فوق التالي إلى ilastik ثم انقر فوق إغلاق. ثم انقر فوق تطبيق التغييرات في النافذة imagej محدث. يمكن ان تستغرق هذه العملية بعض الوقت. ستكون النافذة التالية معلومات مع النص الذي تم تحديثه بنجاح. انقر فوق موافق وأعاده تشغيل imagej.
   2. انقر فوق الإضافات ، وحدات الماكرو، وتثبيت (الشكل3ا). ثم اختر الملف .ijm العداد (راجع معلومات اضافيه) ثم انقر فوق فتح.
      ملاحظه: تمت كتابه الماكرو خصيصا لقياس المنطقة. يجب تثبيت الماكرو في كل مره يتم فيها فتح البرنامج.
3. تحليل المنطقة
   1. تحليل الصور عند تثبيت جميع الإضافات. انقر فوق الإضافات ومرر لأسفل إلى ilastik (الشكل 3ج). اختر استيراد HDF5، اختر الملف بتنسيق h5 ، انقر فوق فتح وتحميل وتطبيق لوط (الشكل 3ج ، د).
   2. اضغط علي الزر a من لوحه المفاتيح (الماكرو) ستظهر المنطقة في اطار الملخص كمساحة إجماليه (الشكل3E).

النتائج

أربعه أيام بعد UT-SCC-42B (المنتشرة الحنجرة SCC خط الخلية) زرع الخلايا ، والمصفوفة (HMDM/فيبين ، MSDM ، أو الكولاجين) أضيفت علي الخزان المشكلة (اليوم 0) وتم رصد الغزو لمده ثلاثه أيام. تم الحصول علي الصور هنا يوميا باستخدام المجهر المقلوب (الشكل 4).

وبمجرد تضمينها ، بدات الخلايا في مصفوفة HMDM/الفايبين في الغزو بسرعة بعد يوم واحد وامتدت إلى المصفوفة (الشكل 4ا). الخلايا في MSDM لم تغزو في المصفوفة المحيطة بها ، بدلا من ذلك تشكيل هيكل غير متناظرة (الشكل 4ب). من ناحية أخرى ، غزت الخلايا في الكولاجين قليلا ، ولكن نظرا لانكماش مصفوفة كان التحليل صعبا (الشكل 4ج). وفي بعض ابار الكولاجين ، اختفي الخزان حتى بعد ثلاثه أيام (الشكل 4ج).

ويبين الشكل 5 التقدير الكمي للغزو الخلوي في هmdm/فيبين من خط الخلية الاوليه scc الحنجرة UT-Scc-42a وخط الخلية المنتشرة المقابلة UT-Scc-42a. يظهر الفيديو (الفيلم 1) الماخوذ باستخدام نظام تحليل الخلايا الحية لكروي hmdm/الفايبين حركه الخلايا SCC داخل المصفوفة حيث تشكل خيوط متبوعه بالخلايا الأخرى.

الشكل 1 : تجزئه الصورة. الخطوات المحددة لتقسيم الصورة باستخدام ilastik. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2 : اعداد المقياس. الخطوات المحددة لاعداد المقياس باستخدام فيجي ImageJ. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3 تحليل الغزو باستخدام ImageJ.: الخطوات المحددة لتحليل الصور باستخدام فيجي ImageJ. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4 : UT-SCC-42B غزو الخلية في ثلاثه مصفوفات مختلفه. الصور التمثيلية للغزو الخلية SCC في خزان 3D. وأعقب الغزو لمده ثلاثه أيام ، وأخذت الصور يوميا باستخدام المجهر المقلوب. (ا) hmdm/الفايبين ، (ب) msdm ، (ج) الكولاجين. العمود الأخير يمثل توضيحا للغزو اليوم 3. شريط مقياس = 200 μm. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5 : القياس الكمي للغزو الخلية SCC في HMDM/الفيبين. تم تحليل الحنجرة الابتدائية UT-42A والمقابلة المنتشرة الحنجرة UT-SCC-42A الاجتياح خط الخلية باستخدام ilastik وفيجي ImageJ البرمجيات. وتمثل النتائج متوسط الانحراف المعياري لثلاث تجارب مستقله ، كل في ثلاثي النسخ. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الفيديو 1: SCC خليه الحركة داخل HMDM/الفيبين لمده ثلاثه أيام. يرجى النقر هنا لمشاهده هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل.)

Discussion

توفر الطريقة المعروضة الفحص القائم علي الورم البشري ثلاثي الابعاد لتقييم غزو الخلايا السرطانية داخل مصفوفة الورم المجهري البشري. يمكن قياس غزو الخلايا السرطانية بسهوله عن طريق التصوير اليومي مع المجهر القياسي وباستخدام برنامج تحليل الصور. ويوضح الأسلوب غزو الخلايا بدلا من مجرد الانتشار.

وعلي عكس MSDM ، لا تتطلب مصفوفة HMDM/الفيبين اي تحكم في درجه الحرارة. هذا الأسلوب هو سهله لأداء ، ولا سيما دون الحاجة إلى نقل خزان من لوحه واحده إلى أخرى. هو يتلقى فقط واحده حساسة تقنيا خطوه, الاضافه من [فيبرينوجن] إلى المصفوفة. وبما ان الفيبرينوجين يبدا بالجل بعد بضع دقائق ، فان أضافه الفيبرينوجين يتطلب القيام بالتغليف القوي وعلاج عدد قليل من الآبار في وقت واحد. هناك أيضا خطر من إزعاج الكروي ونقله من موقعه مركزيه في ال [أو-شبد] بئر ان يتم [بيستينغ] في [هيغ-برسور] طريقه. ويمكن ان يؤدي خلع الكروي إلى تعقيد التصوير وفي نهاية المطاف إلى التحليل.

يمكن تعديل الفحص عن طريق تغيير تركيز HMDM أو الفيبرينوجين. الخلايا يمكن أيضا ان تكون ثابته وملطخه للدراسات الجزيئية اللاحقة. علي الرغم من ان هذه الطريقة يمكن تعديلها إلى نموذج مؤتمتة بالبالكامل ، فانه يمكن أيضا ان تنفذ مع المجهر العادي واثنين من البرمجيات المفتوحة المصدر ، مع عدم الحاجة إلى معدات مكلفه.

بالمقارنة مع اختبارات 3D المستندة إلى MSDM التقليدية ، يمكن عرض هذا الفحص أفضل خصائص غزو الخلية. خزان نمت في الطابق السفلي غشاء التي تحتوي علي مصفوفة الغنية بالlaminin ، مثل MSDM ، قد يكون أكثر انتشارا من الخلايا السرطانية من الغزو الفعلي ، مما يجعلها غير صالحه لاختبارات الغزو في عده خطوط الخلايا السرطانية نظرا لقدرتها الغازية المنخفضة. آخر المصفوفة المستخدمة بشكل متكرر ، نوع I الكولاجين ، يميل إلى تقليص من حواف خلال زراعه 3D ، والذي يؤثر علي توطين كروي والتصوير من الآبار. بالاضافه إلى ذلك ، فان الاختلافات بين الخصائص الغازية المتاصله لأكثر (HSC) واقل (SCC-25) خطوط الخلايا سرطان اللسان العدوانية قد ثبت باستخدام الإنسان الأورام المجهرية نماذج محاكاة (أقراص myoma وشكله القابل للذوبان مصفوفة)^10،13.

الفحص هو أيضا أكثر اخلاقيه من استخدام MSDM منذ يتم استخراج HMDM من بقايا المواد من الورم العضلي البشري. حاليا ، hmdm هو المنتج الوحيد المتاح البشرية المستمدة من الورم الذي يبدو ان تكون مناسبه لكثير من السرطان المرتبطة في اختبارات المختبر^8،10. وفي المستقبل ، يمكن استبدال المصفوفات المشتقة من الانسجه الحيوانية بمصفوفات بشريه قائمه علي الأورام للحد من الحاجة إلى التضحية بالماشية لإنتاج المصفوفات.

استبدال الاختبارات الثقافة الخلية 2D مع أساليب 3D يوفر معلومات أكثر دقه عن سلوك الخلايا السرطانية. حاليا ، هناك العديد من النماذج ثلاثية الابعاد والمصفوفات التجارية ، ولكن ، للأسف ، لا شيء مناسب لجميع خطوط الخلايا السرطانية. يجب علي الباحثين اختيار مصفوفة الأكثر ملاءمة لمقايسة خاصه بهم. المطابقة المثلي لمقايسة والمصفوفة يمكن ان تكون صعبه ، ولكن يمكن ان تزيد بشكل كبير من موثوقيه النتائج.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B solution	Merck	A2942
Aprotinin from bovine lung	Merck	A6279	Measure the protein concentration before use.
Ascorbic acid	Applichem	A1052
BioLite Cell Culture Treated Flasks	Thermo Scientific	130190
DMEM/F-12	Gibco by Life Technologies	31330-038
DS-Fi2 Digital Camera	Nikon Instruments
DS-U3 Digital Camera Controller	Nikon Instruments
Eclipse TS100 Inverted Microscope	Nikon Instruments
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco by Life Technologies	10270106	Heat inactivate for 30 min at 56 °C in waterbath before use.
Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human Plasma	Merck	341578	Solubility: 25 mg/ml in H2O. Warm the H2O and the fibrinogen to 37 °C prior to dissolution. Do not disturb until the fibrinogen is completely solubilized. Stock solutions stored at -70 °C should be thawed in a water bath maintained at 37 °C.
Fiji ImageJ 1.51 image processing program	Freeware, NIH
Hydrocortisone	Merck	H0888
Ilastik software for image classification and segmentation	Freeware
IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis System	Essen BioScience
Myogel	Lab made
Penicillin-Streptomycin	Gibco by Life Technologies	15140-122
Phosphate buffered saline (PBS)	Lab made
Scepter 2.0 Cell Counter	Merck	PHCC20040
Scepter Cell Counter Sensors, 60 µm	Merck	PHCC60050
Thrombin from human plasma	Merck	T6884-100UN
Trypsin-EDTA (0.5%) 10x, no phenol red	Gibco by Life Technologies	15400054
Ultra-Low Attachment 96-Well Plate	Corning	7007
UT-SCC-42A and UT-SCC-42-B cell lines			The cell lines were established at the Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Turku University Hospital (Turku, Finland).