Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نحن نصف طريقتين لتقييم نفاذية الأوعية الدموية العابرة المرتبطة بالورم المجهري من ورم وظيفة المدخل (TMEM) وintravasation الخلايا السرطانية باستخدام الحقن الوريدي من الوزن الجزيئي العالي (155 kDa) dextran في الفئران. وتشمل الأساليب التصوير داخل الحيوية في الحيوانات الحية وتحليل الأنسجة الثابتة باستخدام الفلورة المناعية.

Abstract

السبب الأكثر شيوعا للوفيات المرتبطة بالسرطان هو الانبثاث، وهي عملية تتطلب نشر الخلايا السرطانية من الورم الأساسي إلى المواقع الثانوية. في الآونة الأخيرة، أنشأنا أن نشر الخلايا السرطانية في سرطان الثدي الأولي وفي المواقع النقيلية في الرئة لا يحدث إلا عند المداخل تسمى الورم MicroEnvironment من الانبثاث (TMEM). TMEM رقم المدخل هو التكهن لتكرار بعيد من المرض النقيلي في مرضى سرطان الثدي. وتتكون مداخل TMEM من خلية السرطان التي تعبر عن البروتين التنظيمية الأكتين مينا في اتصال مباشر مع الضامة المحيطة بالأوعية الدموية، proangiogenic الذي يعبر عن مستويات عالية من TIE2 وVEGF، حيث ترتبط كل من هذه الخلايا بإحكام إلى الدم خلية بطانة السفينة. يمكن للخلايا السرطانية أن تُدخل من خلال مداخل TMEM بسبب نفاذية الأوعية الدموية العابرة التي ينظمها النشاط المشترك للماكروفيج المرتبط بـ TMEM وخلية السرطان التي تعبر عن الشرق الأوسط وشمال أفريقيا والمرتبطة بـ TMEM. في هذه المخطوطة، نقوم بوصف طريقتين لتقييم نفاذية الأوعية الدموية العابرة التي يتم الاستفادة منها بوساطة TMEM: التصوير داخل الحيوية ومناعة الأنسجة الثابتة. وعلى الرغم من أن كلا الأسلوبين لهما مزاياهما وعيوبه، فإن الجمع بين الاثنين قد يوفر التحليلات الأكثر اكتمالاً لنفاذية الأوعية الدموية التي تتوسط فيها هذه الطريقة، فضلاً عن المتطلبات البيئية الدقيقة لوظيفة TMEM. وبما أن العملية النقيلية في سرطان الثدي، وربما أنواع أخرى من السرطان، تنطوي على نشر الخلايا السرطانية عبر مداخل TMEM، فمن الضروري استخدام أساليب راسخة لتحليل نشاط مدخل TMEM. توفر الطريقتان الموصوفتان هنا نهجاً شاملاً لتحليل نشاط مدخل TMEM، سواء في الحيوانات الساذجة أو المعالجة الدوائية، والتي لها أهمية قصوى في التجارب السابقة للإكلينيكي للعوامل التي تمنع الخلايا السرطانية النشر عن طريق TMEM.

Introduction

وقد كشفت التطورات الأخيرة في فهمنا للورم الانبثاث السرطاني أن الانتقال الظهاري إلى mesenchymal (EMT) وتحريض التجمعات الفرعية الخلايا السرطانية المهاجرة / الغازية ليست، في حد ذاتها، كافية لنشر الهيماتوجينية 1.في الواقع، كان يعتقد سابقا أن الخلايا السرطانية المنتشرة intravasate من خلال كامل البطانة المرتبطة بالسرطان كما يتميز الورم neovasculature في كثير من الأحيان من قبل انخفاض تغطية pericyte، وعلى هذا النحو، هو نفاذية للغاية و غير مستقر2،3،4. على الرغم من أن الإيحاء الشديد للوظائف المعيبة داخل الورم، فإن تعديلات الأوعية الدموية أثناء التسرطن لا توفر دليلاً في حد ذاته على أن الخلايا السرطانية يمكن أن تخترق الأوعية الدموية بسهولة وبطريقة غير منضبطة. الرؤى من دراسات التصوير داخل الحيوية (IVI)، التي يتم فيها تمييز الخلايا السرطانية بشكل فلورسنت وتسمية الأوعية الدموية عن طريق الحقن الوريدي لتحقيقات الفلورسنت (مثل dextran أو نقاط الكم)، تبين أنه في حين أن الأوعية الورمية هي بشكل موحد نفاذية إلى انخفاض الوزن الجزيئي dextrans (على سبيل المثال 70 كيلوD)، وارتفاع الوزن الجزيئي dextrans (155 kD) والخلايا السرطانية يمكن عبور البطانة فقط في المواقع المتخصصة من intravasation التي تقع بشكل تفضيلي في نقطة فرع الأوعية الدموية5، 6 , 7.أظهرت التحليلات المناعية الكيميائية (IHC) باستخدام النماذج الحيوانية والمواد البشرية المشتقة من المرضى أن هذه المواقع هي "المداخل" التي تتخصص في تنظيم نفاذية الأوعية الدموية، محليا وعابرا، وتوفير نافذة قصيرة من فرصة للخلايا السرطانية المهاجرة / الغازية لدخول الدورة الدموية. وتسمى هذه المداخل "الورم microenvironment من الانبثاث" أو "TMEM"، ومن المتوقع تماما، كثافتها يرتبط مع زيادة خطر الإصابة بمرض النقيلي في مرضى سرطان الثدي8،9، 10.

يتكون كل مدخل TMEM من ثلاثة أنواع متميزة من الخلايا: الضامة المحيطة بالأوعية الدموية، وخلية الورم الإفراط في التعبير عن الثدييات البروتين الأكتين التنظيمية تمكين (مينا)، وخلية بطانة الرحم، وكلها في اتصال جسدي مباشر مع بعضها البعض1، 5،9،10،11،12،13. الحدث الرئيسي لوظيفة TMEM كمدخل intravasation هو الإفراج المحلي من عامل النمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF) على السفينة الكامنة من قبل الضامة المحيطة الوعائية14. VEGF يمكن تعطيل تقاطعات متجانسة بين الخلايا البطانية15،16،17،18،19، وهي ظاهرة تؤدي إلى تسرب الأوعية الدموية عابرة ، أيضا المعروفة باسم "انفجار" نفاذية كما هو موضح في دراسات IVI 5. وقد ثبت أن الضامة TMEM للتعبير عن مستقبلات كيناز التيروزين TIE2، وهو مطلوب لوظيفة TMEM بوساطة VEGF وتحيةمن هذه الضامة إلى محراب ما قبل الأوعية الدموية 5،20،21 , 22.بالإضافة إلى تنظيم نشر الخلايا السرطانية وورم خبيث، وقد ثبت TIE2+ الضامة لتكون المنظمين المركزيين للورم الوعائي21،22،23، 24،25،26،27،28،29،30،31. على هذا النحو، TIE2+ الضامة تمثل مكونا حاسما من البيئة الدقيقة الورم والمنظم الرئيسي للشلال النقيلي.

لتحسين تصور نفاذية الأوعية الدموية التي يتم التوصل إليها بوساطة TMEM (أي "الانفجار")، من المهم جداً تمييزها عن الأساليب الأخرى لنفاذية الأوعية الدموية التي لا ترتبط بإنحلال تقاطعات الخلايا الخلوية البطانية. في البطانة سليمة (واحد الذي لا تتعطل تقاطعات ضيق ة وملتزمة)، وهناك ثلاثة أنواع رئيسية من نفاذية الأوعية الدموية: (أ) بينوسيتوسيل، والتي قد، أو قد لا، أن يقترن بتبديل المواد التي تم تناولها. (ب) نقل المواد عن طريق الفينستري البطانية؛ (ج) نقل المواد عبر المسار شبه الخلوي، الذي تنظمه تقاطعات ضيقة بطانةالرحم 15،16،17،18،19،32 , 33 , 34.على الرغم من إلغاء الضوابط التنظيمية في العديد من الأورام، وقد وصفت وسائط المذكورة أعلاه من نفاذية الأوعية الدموية في الغالب في سياق علم وظائف الأعضاء الأنسجة الطبيعية والتوازن، والتطرف منها هي الأنسجة مع نفاذية محدودة ( على سبيل المثال، حاجز الدم في الدماغ، حاجز الخصية في الدم)، أو نفاذية وفيرة (على سبيل المثال، الشعيرات الدموية المنفوية للجهاز الكبيبي الكلى)34،35،36،37.

باستخدام التصوير متعدد الأبعاد والتنظير المجهري المتعدد الفلورة المناعية، يمكننا التمييز بين نفاذية الأوعية الدموية بوساطة TMEM ("الانفجار") وغيرها من طرق نفاذية الأوعية الدموية في أورام الثدي. لتحقيق ذلك، نقوم بإجراء حقن ة واحدة عن طريق الوريد من وزن جزيئي عالي، مسبار مسمى بفلورسنت في الفئران. ويمكن بعد ذلك التقاط أحداث الانفجار التلقائي باستخدام التصوير داخل الحيوية في الفئران الحية. أو بدلا ً من ذلك، يمكن قياس التجاوز من التحقيق عن طريق دراسات التعريب المشترك مع الأوعية الدموية (على سبيل المثال CD31+ أو Endomucin+) ومداخل TMEM باستخدام الفحص المجهري الفلورة المناعية. وتصف البروتوكولات المعروضة هنا كلا الأسلوبين اللذين يمكن استخدامهما إما بصورة مستقلة أو بالاقتران مع بعضهما البعض.

Protocol

ويجب إجراء جميع التجارب التي تستخدم الحيوانات الحية وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح المتعلقة بالاستخدام الحيواني والرعاية. تم تنفيذ الإجراءات الموضحة في هذه الدراسة وفقا للوائح المعاهد الوطنية للصحة فيما يتعلق برعاية واستخدام الحيوانات التجريبية وبموافقة كلية ألبرت أينشتاين للطب والعناية بالحيوان واستخدامه اللجنة (IACUC).

1- تقييم "نفاذية الانفجار" باستخدام التصوير الحيواني الحي

  1. زرع أورام الثدي السينجينية في المضيفين الماوس مع الضامة الفلورسنت
    1. توليد قطع من أنسجة الورم مناسبة للزرع.
      1. توليد الأورام الفلورية المسمى في نماذج السرطان الثدي الماوس عن طريق عبور عفوية، autochthonous، هندسيا وراثيا الماوس الثدي السرطان نموذج MMTV-PyMT الفئران مع الفئران المعدلة وراثيا التعبير عن الصحفيين الفلورسنت38، 39 [على سبيل المثال، بروتين الفلورسنت الأخضر المعزز (EGFP)، بروتين الفلورسنت السماوي المعزز (ECFP)، أو Dendra2].
      2. السماح للفئران MMTV-PyMT مع الأورام وصفت الفلورسنت أن تنمو إلى حجم لا يزيد عن 2 سم (ما يقرب من 10-12 أسابيع من العمر).
      3. قتل الفئران التي تحمل MMTV-PyMT الورم عن طريق وضعها في غرفة مع 5٪ isoflurane حتى 30 ثانية بعد توقف جميع التنفس.
      4. إجراء خلع عنق الرحم.
      5. إزالة الشعر من بطن الماوس القتل الرحيم باستخدام كريم مزيل الشعر الموضعية.
      6. ضع طبق بيتري مع DMEM/F12 خلية الثقافة المتوسطة على الجليد.
      7. وضع الماوس وطبق بيتري على الجليد في غطاء محرك السيارة الدخان.
      8. تطهير بطن الفأر مع الكحول الإيثيلي بنسبة 70٪.
      9. باستخدام قفازات معقمة والأدوات الجراحية (مقص معقم، ملقط، وشفرة) إزالة الأورام ووضعها في طبق بيتري.
      10. قطع الورم إلى قطع صغيرة (~ 2 مم × 2 مم × 2 مم في الحجم)، وتجاهل أي أجزاء نخرية، في حين أنها في طبق بيتري.
    2. زرع قطع الورم في المضيفين المتلقي.
      1. رفع الفئران مع الضامة التي تحمل علامة الفلورسنت والمهندسة وراثيا، على سبيل المثال، MacGreen40 أو MacBlue 41 الفئران (Csf1r-GAL4VP16/UAS-ECFP)
      2. السماح للفئران FVB مع الضامة المسمى الفلورسنت أن تنمو إلى سن ~ 4-6 أسابيع).
      3. تخدير الفئران FVB مع الضامة وصفت الفلورسنت في غرفة باستخدام 5٪ isoflurane مع الأكسجين كغاز الناقل.
      4. خفض التخدير إلى ~ 3٪ isoflurane وتطبيق مرهم العيون على عيون الماوس لمنع التجفيف.
      5. إزالة الشعر من أكثر من الغدة الثديية 4 من الماوس.
      6. تنظيف الجلد مع البيتادين. من المهم الحفاظ على الظروف المعقمة في جميع أنحاء بقية الإجراء. وهذا يشمل استخدام أجهزة معقمة والكواشف.
      7. جعل شق صغير ~ 2-3 ملم فقط أقل من الحلمةال1.
      8. تشريح حتى يتم الكشف عن وسادة الدهون الثديية.
      9. خذ قطعة ورم من طبق بيتري ومعطف في مصفوفة خارج الخلية الاصطناعية.
      10. زرع الأورام تحت وسادة الدهون الثديية 4.
      11. أغلق الشق باستخدام لاصق سيانوكريلات.
      12. مراقبة الحيوان باستمرار حتى يتعافى تماما من التخدير وقادرعلى الحفاظ على recumbency القص. أيضا، لا تعود الحيوان إلى الشركة من الحيوانات الأخرى حتى الشفاء الكامل.
      13. لتقليل العدوى، أضف 1 مل من 100 ملغم/مل مضاد ًا حيويًا إنروفلوكساسين إلى زجاجة مياه الشرب الخاصة بالحيوان (8 أونصة سائلة).
      14. السماح للأورام بالنمو حتى ملموس (~ 5 ملم؛ ~ 4 أسابيع).
      15. اعتمادا على التجربة، وتخصيص الفئران في مجموعات العلاج، وأداء العلاجات المقابلة، إذا كان ذلك ممكنا.
  2. إعداد التصوير داخل الحيوية
    1. قم بتشغيل ليزر الفوتون المجهر وأجهزة الكشف.
    2. تشغيل مربع التدفئة والحرارة المسبقة مرحلة المجهر س-Y.
    3. ضع المرحلة المخصصة إدراج42 في مرحلة س-س.
  3. إعداد نافذة التصوير
    1. قبل إعداد للتصوير، الأوتوكلاف إطار نافذة التصوير الدائري حسب الطلب42.
    2. استخدام ماصة أو حقنة الأنسولين لوضع طبقة رقيقة من لاصق سيانواكريلات إلى إطار النافذة ولصق في مكان 8 ملم زجاج غطاء دائري.
      ملاحظة: 1) من المهم تجنب الحصول على بقايا على فتحة واضحة من الزجاج الغطاء. 2) من المهم التمسك الزجاج غطاء لإطار النافذة على الأقل 1 ساعة قبل استخدامها للتصوير.
    3. مسح بعناية تنظيف أي cyanoacrylate الزائدة على فتحة واضحة من الزجاج غطاء باستخدام مسح مختبر مبللة مع كمية صغيرة من الأسيتون.
  4. إعداد قسطرة الوريد الذيل لإدارة السوائل والأصباغ الفلورية أثناء التصوير
    1. قطع قطعة 30 سم من أنابيب البولي ايثيلين لبناء قسطرة الوريد الذيل.
    2. فصل جزء إبرة من إبرة 30 G من تفتق Luer لها عن طريق الانحناء بلطف الإبرة ذهابا وإيابا حتى يكسر.
      ملاحظة: يجب أن تعقد الإبرة على مقربة من تفتق Luer وليس طرف إبرة. ويمكن تنفيذ ذلك مع كماشة أو ملقط لفهم الإبرة من أجل منع إصابة عصا إبرة.
    3. أدخل نهاية حادة من الإبرة في نهاية واحدة من أنابيب البولي ايثيلين.
    4. إدراج نهاية حادة من إبرة أخرى 30 G، والحفاظ على تفتق Luer المرفقة، إلى الطرف الآخر من الأنابيب.
    5. ملء حقنة 1 سم مكعب مع الفوسفات المخزنة المالحة، وإرفاقه إلى تفتق لور من القسطرة تجميعها، ومسح قسطرة الوريد الذيل التأكد من عدم وجود فقاعات الهواء في النظام.
    6. لوضع العلامات الوعائية، ملء حقنة 1 سم مكعب مع 100 ميكرولتر من 10 ملغ / كغ 155 كدا dextran-tetramethylrhodamine (TMR) أو نقاط الكم.
  5. إعداد الماوس للتصوير
    1. تخدير الماوس في قفص تحت (~ 1 قدم أدناه) مصباح حراري باستخدام 4٪ -5٪ isoflurane مختلطة مع الأكسجين 100٪ تعيين إلى تدفق 1.5-2 L لكل دقيقة.
    2. تشغيل مصباح الحرارة على منطقة العمل الجراحية. هذه الخطوة حاسمة للحفاظ على درجة حرارة الجسم الفسيولوجية الأساسية للماوس أثناء الجراحة.
    3. ضع الماوس تحت مصباح الحرارة وخفض التخدير إلى 2٪ -3٪ لمدة الجراحة.
      ملاحظة: تأكد من الحفاظ على مصباح الحرارة على مسافة آمنة (~ 1 قدم) بعيدا عن الماوس لتجنب ارتفاع درجة الحرارة.
    4. وضع مرهم العيون على عيون الماوس لمنع تجفيف العينين والعمى.
    5. اختبار أن يتم التخدير الماوس عن طريق إجراء اختبار قرصة اصبع القدم. إذا انسحب الحيوان، وزيادة جرعة من isoflurane بنسبة 1٪ وإعادة اختبار في 1-2 دقيقة.
    6. أدخل قسطرة الوريد الذيل في أكثر نقطة بعدية على الذيل ممكن.
    7. تثبيت قسطرة الوريد الذيل إلى الذيل مع قطعة صغيرة من شريط المختبر الذي يلتف حول الذيل والعصي على الإبرة لضمان أنها لا تحصل على خلعها.
    8. حقن 50 ميكرولتر لكل ساعة من PBS من خلال قسطرة الوريد الذيل لتوفير ترطيب كاف. من المهم تجنب حقن الكثير من السوائل (لا يزيد عن 200 ميكرولتر لكل ساعة) أو أي فقاعات في القسطرة لأن هذا يمكن أن يكون مميتا ً للماوس.
    9. إزالة الشعر على البطن على الغدد الثديية 4 و 5 ال باستخدام كريم مزيل الشعر.
    10. تنظيف الجلد مع البيتادين والسماح للبشرة لتجف.
    11. قم بعمل شق خط الوسط الطولي الذي يبدأ على الفور متفوقة على الأعضاء التناسلية وحمل الشق حتى مستوى الجانب العلوي من الغدة الثديية الرابعة.
    12. حمل الشق عرضية إلى الجانب متفوقة من الغدة الثديية 4. من الأهمية بمكان تجنب المساس بإمدادات الدم في هذه المرحلة.
    13. تشريح وسادة الدهون الثديية قبالة العاقب خلق رفرف الأنسجة باستخدام ملقط معقمة ومقص.
      ملاحظة: التصوير رفرف الجلد عرضة للآثار الحركة كبيرة وجفاف الأنسجة. يتم تجنب هذه، كما هو موضح سابقا43،44، عن طريق تثبيت قطعة صلبة من المطاط وراء إلى الجانب الجلد من رفرف (لتشديد الأنسجة الرخوة وعزلها عن بقية الجسم) ومن ثم وضع الورم في التصوير الضحلة نافذة للحفاظ على الترطيب. هذا أمر بالغ الأهمية للتصوير مستقرة كما الورم والأنسجة المحيطة بها في هذا الإعداد متوافقة جدا.
    14. استقرار رفرف الجلد عن طريق تثبيت (مع الغراء سيانواكريلات) قطعة صغيرة من المطاط جامدة قياس 2 سم × 2 سم إلى الجانب الجلد من رفرف. يجب أن يكون الورم في وسط المنطقة التي يتم تثبيتها من قبل المطاط.
    15. الحفاظ على الأنسجة المكشوفة رطب مع قطرات من PBS.
    16. تطبيق فيلم صغير من cyanoacrylate على الحافة الخارجية من إطار نافذة التصوير حسب الطلب.
    17. تطبيق قطرة صغيرة من PBS (~ 10-20 درجة مئوية) إلى وسط الزجاج الغطاء.
    18. تجفيف الأنسجة رفرف المحيطة مع مسح المختبر. من المهم التأكد من أن السيانوكريلات على إطار النافذة لا يأتي في اتصال مع PBS على الزجاج، وهذا يمكن أن يسبب cyanoacrylate لبوليمر وتعيين قبل الأوان.
    19. تثبيت نافذة التصوير الصغيرة إلى رفرف الأنسجة مع الورم في وسط الفتحة واضحة.
    20. إزالة مربع التدفئة من المرحلة.
    21. نقل القسطرة الوريد والوريد التخدير إلى مرحلة المجهر. توخي الحذر الشديد لضمان عدم سقوط قسطرة الوريد الذيل.
    22. وضع الماوس على خشبة المسرح في موقف عرضة.
    23. ضع مخروط الأنف من الأيسوفلوران على الوضعية لضمان الحفاظ على التخدير.
    24. أدخل الإطار في البئر على لوحة مرحلة س-س المخصصة.
    25. وضع مربع التدفئة مرة أخرى على خشبة المسرح للحفاظ على درجة الحرارة الفسيولوجية.
    26. مراقبة العلامات الحيوية للحيواني عن طريق إرفاق مسبار مقياس التأكسج النبضي عبر مستشعر المشبك إلى الكفو الخلفي.
    27. انخفاض ببطء isoflurane إلى 0.5٪ -1٪ للحفاظ على تدفق الدم الكافي وتجنب أكثر من التخدير الماوس.
  6. التصوير داخل الحيوية
    ملاحظة: تم إجراء التصوير الذي نصفه في هذا القسم على مجهر متعدد الفوتونات متعدد الفوتونات متعدد الفوتونات تم وصفه مسبقًا5و39و45. باختصار، يتم استخدام ليزر femtosecond لتوليد 90 فيمتوثانية ضوء الليزر النبضي المتمركزة في 880 نانومتر. يتم الكشف عن ضوء الفلورة مع ثلاثة من أجهزة الكشف الأربعة التي تم الحصول عليها في وقت واحد (الأزرق = 447/60، الأخضر = 520/65، والأحمر 580/60؛ الطول الموجي المركزي / عرض النطاق الترددي) بعد الانفصال عن ضوء الإثارة من قبل dichroic (كروما، Z720DCXXR). يحتوي حامل المجهر على عدسة موضوعية تبلغ 25 x و1.05 NA (فتحة رقمية) لمسافات العمل الطويلة (2 مم). من المهم أن نلاحظ أنه، في حين أننا قد استخدمت المجهر بنيت خصيصا، والبروتوكول الموضح أدناه يمكن أن يتحقق على أي مجهر متعدد الفوتون المتاحة تجاريا كذلك.
    1. وضع قطرة من الماء المقطر بين 25X، 1.05 NA هدف المجهر والزجاج غطاء النافذة لجعل الاتصال البصري.
    2. استخدم عدسة المجهر للتركيز على المناطق ذات الخلايا السرطانية الفلورية بالقرب من سطح النافذة.
    3. العثور على الأوعية الدموية المتدفقة والضامة المسماة. من الأهمية بمكان أن تتدفق الأوعية الدموية لتقييم ديناميات الأوعية الدموية.
    4. قم بتبديل المجهر إلى وضع متعدد الفوتونات.
    5. تعيين الحدود العليا والسفلى من سلسلة z، الذي يقيس ما يقرب من 50 ميكرومتر.
      1. تعيين الحد العلوي من z-سلسلة باستخدام ضبط التركيز لنقل الهدف إلى موقع البدء المطلوب، في موقف الأكثر سطحية، ووضع علامة على هذا الموقف كصفر داخل البرنامج عن طريق النقر على زر أعلى الموضع Z.
      2. تعيين الحد الأدنى من z-سلسلة نقل الهدف إلى طبقة أعمق (عادة 50-70 ميكرومتر من أعلى للأورام أصغر) والنقر على زر الموضع Z أسفل.
      3. تعيين حجم الخطوة z إلى 5 ميكرومتر.
    6. انقر على زر لوحة الفاصل الزمني وحدد الفاصل الزمني بين عمليات الاستحواذ إلى 10 ثوان على الأقل لتوفير الوقت الكافي لتجديد المياه فوق العدسة الموضوعية. ويتم ذلك يدويا مع ماصة الضغط على الهدف خلال فترة طويلة من الزمن.
    7. إزالة الحقنة مع PBS في قسطرة الوريد الذيل واستبدالها بحقنة أخرى تحتوي على 155 kDa dextran-TMR (رباعي ميثيل رودامين).
    8. حقن 100 ميكرولتر من 155 kDa dextran-TMR عن طريق قسطرة الوريد الذيل.
    9. بعد الحقن، استبدل حقنة TMR بحقنة PBS.
    10. الحصول على z-كومة التصوير الفاصل الزمني عن طريق النقر على زر Z-المكدس والفاصل الزمني، ثم النقر على زر السجل.
    11. حقن 50 ميكرولتر من PBS كل 30-45 دقيقة للحفاظ على ترطيب كاف للحيواني. تجنب حقن أكثر من 200 ميكرولتر في الوقت المناسب لأن هذا يمكن أن يسبب الحمل الزائد السوائل.
  7. القتل الرحيم
    1. زيادة isoflurane إلى 5٪ والحفاظ على الحيوان تحت 5٪ isoflurane مع مخروط الأنف في مكان حتى 30 s بعد توقف التنفس.
    2. إزالة الماوس من المرحلة.
    3. إجراء خلع عنق الرحم.
  8. معالجة الصور
    1. قم بتحميل جميع الصور في ImageJ وتنسيقها في كومة hyperstack 5 الأبعاد (x، y، z، t، وقناة اللون).
    2. إجراء فصل التداخل الطيفي (أي: GFP وCFP) والقضاء على الانجراف س-ذ من المداخن باستخدام الأساليب المعمول بها38.
    3. استخدم السطوع وتعديل التباين لزيادة المستوى الأبيض لقناة الدم بحيث تصبح إشارة الخلفية مرئية.
    4. لكل شريحة z، فحص بعناية كل فيلم لعلامات تسرب الأوعية الدموية عابرة ("انفجار"). قد يساعد تشغيل الأفلام بمعدلات إطارات سريعة (40 إطارًا في الثانية) في هذا التحديد.
    5. بمجرد تحديد انفجار، إعادة سطوع لهذه القناة إلى مستوى عادي واقتصاص hyperstack إلى هذه المنطقة وz-شريحة.

2. تقييم dextran خارج الأوعية الدموية باستخدام تحليل الأنسجة الثابتة

  1. إعداد الورم والعينة
    ملاحظة: يفترض الجزءالثاني من هذا البروتوكول أنه تم حصاد أورام الثدي من نموذج الماوس زرع تقويم العظام لسرطان الثدي (أي MMTV-PyMT). هذا النموذج يمكن أن يكون نفس النموذج الموصوف في الجزءالأول من البروتوكول، على الرغم من أن الأورام التي تحمل علامة الفلورسنت ليست ضرورية في هذه المرحلة.
    1. بعد إنهاء خط الأنابيب التجريبي (أي علاجات المخدرات، وما إلى ذلك)، إجراء حقن من دون جدوى من الذيل من 10 ملغ / مل 155 كمدا dextran-tetramethyl rhodamine، 1 ساعة قبل التضحية الفئران.
    2. التضحية الفئران وحصاد أورام الثدي.
    3. إصلاح الأورام في شكلي 10٪ لمدة 48-72 ساعة والمضي قدما في البرافين التضمين.
    4. باستخدام ميكروتومي، اقطع اثنين من الشرائح المتسلسلة بسمك 5 ميكرومتر من الأنسجة المضمنة في البارافين (FFPE) المثبتة رسمياً. يتم استخدام شريحة واحدة لتلطيخ dextran، في حين سيتم استخدام الآخر لأداء TMEM الثلاثي IHC، للرجوع إليها.
      ملاحظة: تم وصف بروتوكول الكيمياء المناعية الثلاثية TMEM في مكان آخر 10.
  2. إذا تلطيخ والمسح الضوئي لأول من القسمين المتسلسلين
    1. إرسال الشرائح إلى بروتوكول إزالة البارافين القياسية. وهذا يشمل اثنين من الغمر اللاحقة في الزيلين (10 دقيقة لكل منهما)، تليها الجفاف في حلول الكحول المخففة تسلسليا (100٪، 95٪، 70٪، و 50٪ EtOH في H2O لمدة 2 دقيقة لكل غمر).
    2. إجراء استرجاع مستضد عن طريق التدفئة (على مقربة من نقطة الغليان) المقاطع المغمورة في سيترات (درجة الحموضة 6.0 المعدلة) لمدة 20 دقيقة.
    3. السماح للعينات تبرد إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 15-20 دقيقة ثم يغسل في PBS 3X لمدة 2 دقيقة كل غسل.
    4. كتلة لمدة 60-90 دقيقة في حجب العازلة (10٪ FBS؛ 1٪ BSA؛ 0.0025٪ الجيلاتين جلد السمك؛ 0.05٪ PBST، أي PBS مع 0.05٪ توين-20).
    5. احتضان عينات مع خليط من الأجسام المضادة الفئران والأرانب الأولية التي تستهدف Endomucin وTMR، على التوالي، ومن ثم يغسل في PBST 3X، 2 دقيقة لكل منهما.
    6. احتضان عينات مع خليط من الأجسام المضادة الحمار الثانوية ضد الفئران IgG (مترافقة إلى اليكسا-647) والأرنب IgG (مترافقة إلى اليكسا-488)، ومن ثم يغسل في PBST 3X 2 دقيقة لكل منهما.
    7. قم بإجراء تلطيخ DAPI الروتيني (أي الغمر في محلول DAPI لمدة 5-6 دقائق)، قم بتركيب الشرائح باستخدام وسط تركيب "صلب" خالي من الجلسرين، والمخزن في مكان مظلم حتى المسح الضوئي.
    8. للحصول على أفضل النتائج، امسح الشرائح ضوئيًا على ماسح شرائح رقمي كامل.
  3. تحليل الصور
    1. التقط 10 حقول طاقة عالية (HPFs) لكل حالة، باستخدام أي برنامج مناسب لعلم الأمراض الرقمية.
    2. حفظ قنوات Endomucin (الأحمر) و TMR (الأخضر) بشكل منفصل كـ TIFF.
    3. باستخدام ImageJ، قم بتحميل ملفات TIFF وتحويلها إلى صور 8 بت.
    4. قم بعتبة الصور 8 بت إلى مستوى التحكم السلبي، وتوليد صورتين معبّنة، تظهران "أقنعة" إندومووكين وTMR.
    5. من الأدوات الثنائية، حدد ملء الثقوب على قناع Endomucin.
    6. توليد وحفظ المناطق الخمس التالية ذات الاهتمام: 1) صورة dextran عتبة باسم "Dextran ROI" (ROI1)، 2) صورة endomucin عتبة باسم "عائد الفائدة الأوعية الدموية" (ROI2)، 3) صورة endomucin المقلوبة باسم "عائد الاستثمار خارج الأوعية الدموية" (ROI3)، 4) تتقاطع " عائد الاستثمار خارج الأوعية الدموية" وصورة "عائد الاستثمار Dextran" (ROI1 - ROI3) كـ "عائد استثمار Dextran خارج الأوعية الدموية" (ROI4)، و5) الصورة بأكملها باسم "عائد الاستثمار الورم" (ROI5).
    7. قم بتقسيم منطقة ROI4 على مساحة ROI5 ومضاعفة 100 لإنشاء النسبة المئوية للمنطقة التي يغطيها dextran خارج الأوعية الدموية في الورم بأكمله.
    8. كرر العملية ل10-20 HPFs لكل حالة (اعتمادا على توافر الأنسجة) وتوليد متوسط Dextran خارج الأوعية الدموية (منطقة٪) لكل حالة.

النتائج

وتتلخص الإجراءات التجريبية الموصوفة في هذه المادة من البروتوكول بإيجاز وتوضح في الشكل 1ألف- جيم.

لقياس نفاذية الأوعية الدموية بوساطة TMEM ("نشاط الانفجار") والحد من الضوضاء التجريبية من طرق أخرى لنفاذية الأوعية الدموية (أي عبر الخلايا وشبه الخلوية، ك?...

Discussion

هنا، نقوم بالخطوط العريضة لاثنين من البروتوكولات التي يمكن تطبيقها لتصور وتحديد نوع معين من نفاذية الأوعية الدموية التي هي موجودة في مداخل TMEM ويرتبط مع تعطيل الأوعية الدموية ضيق وتقاطعات adherens. هذا النوع من نفاذية الأوعية الدموية عابرة وتسيطر عليها مركبالخلايا TMEM الثلاثي، ك?...

Disclosures

ولا يكشف أصحاب البلاغ عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

نود أن نشكر مرفق التصوير التحليلي (AIF) في كلية ألبرت أينشتاين للطب على دعم التصوير. وقد تم دعم هذا العمل من خلال منح من NCI (P30CA013330، CA150344، CA 100324 و CA216248)، وSIG 1S10OD019961-01، ومركز Gruss-Lipper Biophotonics وبرنامج التصوير المتكامل الخاص به، ومونتيفيوري روث L. Kirschstein T32 منحة التدريب من الجراحين لدراسة البيئة الدقيقة الورم (CA200561).

شارك GSK في كتابة المخطوطة، وأنجز التصوير للشكل 1C و3B، ووضع بروتوكول تحليل الأنسجة الثابتة، وتحليل وتفسير جميع البيانات؛ شارك JMP في كتابة المخطوطة، وأجرى الجراحة والتصوير داخل الحيوية للشكل 1B و 2C و 3A؛ أجرى LB & AC الجراحة والتصوير داخل الحيوية للشكل 2B; أجرت الملكية الأردنية الجراحة والتصوير داخل الحيوية للرقم 2A. شاركت هيئة الأوراق المالية في كتابة المخطوطة وتحليل جميع البيانات وتفسيرها؛ شاركت المنظمة في كتابة المخطوطة وتحليل جميع البيانات وتفسيرها؛ وأجرى دي الجراحة والتصوير داخل الحيوية للشكل 2D، وشارك في كتابة المخطوطة، ووضع تحليل الأنسجة الثابتة وبروتوكولات التصوير داخل الحيوية، وتحليل وتفسير جميع البيانات.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-rabbit IgG (Alexa 488)Life Technologies CorporationA-11034
Anti-rat IgG (Alexa 647)Life Technologies CorporationA-21247
Bovine Serum AlbuminFisher ScientificBP1600-100
CitrateEng Scientific Inc9770
Cover Glass SlipsElectron Microscopy Sciences72296-08
Cyanoacrylate AdhesiveHenkel Adhesive1647358
DAPIPerkin ElmerFP1490
Dextran-Tetramethyl-RhodamineSigma AldrichT1287
DMEM/F12Gibco11320-033
Endomucin (primary antibody)Santa Cruz Biotechnologysc-65495
EnrofloxacinBayer84753076 v-06/2015
Fetal Bovine SerumSigma AldrichF2442
Fish Skin GelatinFisher ScientificG7765
Insulin SyringeBecton Dickinson309659
IsofluoraneHenry ScheinNDC 11695-6776-2
MatrigelCorningCB40234Artificial extracellular matrix
Needle (30 G)Becton Dickinson305128
Phosphate Buffered SalineLife Technologies CorporationPBS
Polyethylene TubingScientific Commodities IncBB31695-PE/1
Pulse OximeterKent ScientificMouseOx
Puralube Vet OintmentDechraNDC 17033-211-38
Quantum DotsLife Technologies CorporationQ21561MP
RubberMcMaster Carr1310N14
TMR (primary antibody)InvitrogenA6397
Tween-20MP BiologicalsTWEEN201
XyleneFisher Scientific184835

References

  1. Karagiannis, G. S., Goswami, S., Jones, J. G., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. Signatures of breast cancer metastasis at a glance. Journal of Cell Science. 129 (9), 1751-1758 (2016).
  2. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  3. Raza, A., Franklin, M. J., Dudek, A. Z. Pericytes and vessel maturation during tumor angiogenesis and metastasis. American Journal of Hematology. 85 (8), 593-598 (2010).
  4. Pietras, K., Ostman, A. Hallmarks of cancer: interactions with the tumor stroma. Experimental Cell Research. 316 (8), 1324-1331 (2010).
  5. Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA. Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).
  6. Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
  7. Wyckoff, J. B., et al. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Research. 67 (6), 2649-2656 (2007).
  8. Sparano, J. A., et al. A metastasis biomarker (MetaSite Breast Score) is associated with distant recurrence in hormone receptor-positive, HER2-negative early-stage breast cancer. npj Breast Cancer. 3, 42 (2017).
  9. Rohan, T. E., et al. Tumor microenvironment of metastasis and risk of distant metastasis of breast cancer. Journal of the National Cancer Institute. 106 (8), (2014).
  10. Robinson, B. D., et al. Tumor microenvironment of metastasis in human breast carcinoma: a potential prognostic marker linked to hematogenous dissemination. Clinical Cancer Research. 15 (7), 2433-2441 (2009).
  11. Pignatelli, J., et al. Invasive breast carcinoma cells from patients exhibit MenaINV- and macrophage-dependent transendothelial migration. Science Signaling. 7 (353), 112 (2014).
  12. Oktay, M. H., Jones, J. G. TMEM: a novel breast cancer dissemination marker for the assessment of metastatic risk. Biomarkers in Medicine. 9 (2), 81-84 (2015).
  13. Roussos, E. T., et al. Mena invasive (Mena(INV)) and Mena11a isoforms play distinct roles in breast cancer cell cohesion and association with TMEM. Clinical & Experimental Metastasis. 28 (6), 515-527 (2011).
  14. Harney, A. S., et al. The Selective Tie2 Inhibitor Rebastinib Blocks Recruitment and Function of Tie2(Hi) Macrophages in Breast Cancer and Pancreatic Neuroendocrine Tumors. Molecular Cancer Therapeutics. 16 (11), 2486-2501 (2017).
  15. Bates, D. O., Lodwick, D., Williams, B. Vascular endothelial growth factor and microvascular permeability. Microcirculation. 6 (2), 83-96 (1999).
  16. Lee, Y. C. The involvement of VEGF in endothelial permeability: a target for anti-inflammatory therapy. Current Opinion in Investigational Drugs. 6 (11), 1124-1130 (2005).
  17. Roberts, W. G., Palade, G. E. Neovasculature induced by vascular endothelial growth factor is fenestrated. Cancer Research. 57 (4), 765-772 (1997).
  18. Stan, R. V., et al. Immunoisolation and partial characterization of endothelial plasmalemmal vesicles (caveolae). Molecular Biology of the Cell. 8 (4), 595-605 (1997).
  19. Roberts, W. G., Palade, G. E. Increased microvascular permeability and endothelial fenestration induced by vascular endothelial growth factor. Journal of Cell Science. 108, 2369-2379 (1995).
  20. Arwert, E. N., et al. A Unidirectional Transition from Migratory to Perivascular Macrophage Is Required for Tumor Cell Intravasation. Cell Reports. 23 (5), 1239-1248 (2018).
  21. Kadioglu, E., De Palma, M. Cancer Metastasis: Perivascular Macrophages Under Watch. Cancer Discovery. 5 (9), 906-908 (2015).
  22. Hughes, R., et al. Perivascular M2 Macrophages Stimulate Tumor Relapse after Chemotherapy. Cancer Research. 75 (17), 3479-3491 (2015).
  23. Riabov, V., et al. Role of tumor associated macrophages in tumor angiogenesis and lymphangiogenesis. Frontiers in Physiology. 5, 75 (2014).
  24. Squadrito, M. L., De Palma, M. Macrophage regulation of tumor angiogenesis: implications for cancer therapy. Molecular Aspects of Medicine. 32 (2), 123-145 (2011).
  25. Ferrara, N. Role of myeloid cells in vascular endothelial growth factor-independent tumor angiogenesis. Current Opinion in Hematology. 17 (3), 219-224 (2010).
  26. Solinas, G., Germano, G., Mantovani, A., Allavena, P. Tumor-associated macrophages (TAM) as major players of the cancer-related inflammation. Journal of Leukocyte Biology. 86 (5), 1065-1073 (2009).
  27. Venneri, M. A., et al. Identification of proangiogenic TIE2-expressing monocytes (TEMs) in human peripheral blood and cancer. Blood. 109 (12), 5276-5285 (2007).
  28. Lewis, C. E., De Palma, M., Naldini, L. Tie2-expressing monocytes and tumor angiogenesis: regulation by hypoxia and angiopoietin-2. Cancer Research. 67 (18), 8429-8432 (2007).
  29. Mazzieri, R., et al. Targeting the ANG2/TIE2 axis inhibits tumor growth and metastasis by impairing angiogenesis and disabling rebounds of proangiogenic myeloid cells. Cancer Cell. 19 (4), 512-526 (2011).
  30. Lewis, C. E., Ferrara, N. Multiple effects of angiopoietin-2 blockade on tumors. Cancer Cell. 19 (4), 431-433 (2011).
  31. Gabrusiewicz, K., et al. Anti-vascular endothelial growth factor therapy-induced glioma invasion is associated with accumulation of Tie2-expressing monocytes. Oncotarget. 5 (8), 2208-2220 (2014).
  32. Karagiannis, G. S., Condeelis, J. S., Oktay, M. H. Chemotherapy-induced metastasis: mechanisms and translational opportunities. Clinical & Experimental Metastasis. , (2018).
  33. Senger, D. R., et al. Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid. Science. 219 (4587), 983-985 (1983).
  34. Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier. Handbook of Clinical Neurology. 133, 39-59 (2016).
  35. Satchell, S. C., Braet, F. Glomerular endothelial cell fenestrations: an integral component of the glomerular filtration barrier. American Journal of Physiology: Renal Physiology. 296 (5), 947-956 (2009).
  36. Stan, R. V. Endothelial stomatal and fenestral diaphragms in normal vessels and angiogenesis. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 11 (4), 621-643 (2007).
  37. Mruk, D. D., Cheng, C. Y. The Mammalian Blood-Testis Barrier: Its Biology and Regulation. Endocrine Reviews. 36 (5), 564-591 (2015).
  38. Entenberg, D., et al. Imaging Tumor Cell Movement in Vivo. Current Protocols in Cell Biology. 58 (1), 1-19 (2013).
  39. Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
  40. Sasmono, R. T., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
  41. Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. Journal of Leukocyte Biology. 83 (2), 430-433 (2008).
  42. Entenberg, D., et al. Time-lapsed, large-volume, high-resolution intravital imaging for tissue-wide analysis of single cell dynamics. Methods. 128, 65-77 (2017).
  43. Pastoriza, J. M., et al. Black race and distant recurrence after neoadjuvant or adjuvant chemotherapy in breast cancer. Clinical & Experimental Metastasis. , (2018).
  44. Williams, J. K., et al. Validation of a device for the active manipulation of the tumor microenvironment during intravital imaging. Intravital. 5 (2), 1182271 (2016).
  45. Harney, A. S., Wang, Y., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment. Journal of Visualized Experiments. (112), e54042 (2016).
  46. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  47. Roussos, E. T., et al. Mena invasive (MenaINV) promotes multicellular streaming motility and transendothelial migration in a mouse model of breast cancer. Journal of Cell Science. 124, 2120-2131 (2011).
  48. Karagiannis, G. S., et al. Neoadjuvant chemotherapy induces breast cancer metastasis through a TMEM-mediated mechanism. Science Translational Medicine. 9 (397), (2017).
  49. Chang, Y. S., Jalgaonkar, S. P., Middleton, J. D., Hai, T. Stress-inducible gene Atf3 in the noncancer host cells contributes to chemotherapy-exacerbated breast cancer metastasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (34), 7159-7168 (2017).
  50. Jain, R. K. Normalization of tumor vasculature: an emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. 307 (5706), 58-62 (2005).
  51. Winkler, F., et al. Kinetics of vascular normalization by VEGFR2 blockade governs brain tumor response to radiation: role of oxygenation, angiopoietin-1, and matrix metalloproteinases. Cancer Cell. 6 (6), 553-563 (2004).
  52. Goel, S., et al. Normalization of the vasculature for treatment of cancer and other diseases. Physiological Reviews. 91 (3), 1071-1121 (2011).
  53. Jain, R. K. Normalizing tumor microenvironment to treat cancer: bench to bedside to biomarkers. Journal of Clinical Oncology. 31 (17), 2205-2218 (2013).
  54. Carmeliet, P., Jain, R. K. Principles and mechanisms of vessel normalization for cancer and other angiogenic diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (6), 417-427 (2011).
  55. Meijer, E. F., Baish, J. W., Padera, T. P., Fukumura, D. Measuring Vascular Permeability In Vivo. Methods in Molecular Biology. 1458, 71-85 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

148 TMEM dextran

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved