A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
אנו מתארים שתי שיטות להערכת חדירות בכלי הדם ארעי הקשורים עם מיקרוסביבה הגידול של גרורות (tmem) הדלת הפתח ואת התא סרטן in, באמצעות הזרקה ורידית של משקל גבוה-מולקולרי (155 kda) תוספי בעכברים. השיטות כוללות הדמיה של האינטרטל בבעלי חיים חיים וניתוח רקמות קבועות באמצעות מאימונולובורנציה.
הגורם השכיח ביותר של התמותה הקשורות לסרטן היא גרורות, תהליך המחייב הפצת תאים סרטניים מהגידול העיקרי לאתרים משניים. לאחרונה, הקמנו כי הפצת התאים הסרטניים בסרטן השד הראשוני באתרים גרורתי בריאות מתרחשת רק על הפתחים הנקראים מיקרוסביבה הגידול של גרורות (TMEM). מספר הדלת של TMEM הוא תחזיות עבור הישנות רחוקות של מחלה גרורתית בחולי סרטן השד. הפתחים tmem מורכבים תא סרטן אשר מבטא את החלבון אקטין הרגולציה ממנה במגע ישיר עם perivascular, proangiogenic המבטא רמות גבוהות של TIE2 ו-, היכן שני תאים אלה מאוגדים בחוזקה לדם . תא אנדותל תאים סרטניים יכולים לעבור באמצעות הפתחים TMEM עקב חדירות כלי דם ארעי שאורגן על ידי פעילות משותפת של מקרופאג הקשורים TMEM ו-TMEM-לבטא את תא סרטן. בכתב יד זה, אנו מתארים שתי שיטות להערכת היכולת הארעית של הגברת המתווכת בכלי הדם: הדמיה של הדמייה ומערכת חיסונית של רקמה קבועה. למרות שלכל השיטות יש יתרונות וחסרונות, השילוב בין השניים עשוי לספק את הניתוחים המשלימים ביותר של חדירות כלי דם, כמו גם תנאים מוקדמים מיקרו-סביבתיים עבור הפונקציה tmem מאז התהליך גרורתי בסרטן השד, ואולי סוגים אחרים של סרטן, כרוך הפצת תאים סרטניים באמצעות הפתחים TMEM זה חיוני להעסיק שיטות מבוססות היטב ניתוח של פעילות הדלת TMEM. שתי השיטות המתוארות כאן מספקות גישה מקיפה לניתוח של פעילות הדלת של TMEM או בבעלי חיים תמימים או בעלי טיפול תרופתי, שהוא בעל חשיבות עליונה לניסויים פרה-קליניים של סוכנים המונעים תא סרטן הפצה באמצעות TMEM.
ההתפתחויות האחרונות ההבנה שלנו של גרורות סרטן חשפו כי המעבר אפיתל-to-mesenchal (צוות החירום) ואת אינדוקציה של מעבר לסרטן הנדידה/פולשנית של תאים לא, בעצמם, מספיק עבור הפצת המטדוגני 1. אכן, בעבר חשבו כי מתפשט בתאי הסרטן באמצעות מכלול של סרטן משויך אנדותל כמו הגידול neovasculature מאופיין לעתים קרובות על ידי כיסוי כריתת קרום נמוך, וככזה, הוא חדיר מאוד . לא יציב2,3,4 למרות מאוד מרמזת על פונקציות פגומות בתוך הגידול, שינויים כלי דם במהלך סרטן לא לספק ראיות כשלעצמו כי תאים סרטניים יכולים לחדור כלי דם בקלות בצורה בלתי מבוקרת. תובנות מפני הדמיית הדמיה (ivi) לימודים, שבו תאים סרטניים הם fluorescently אופן-מתויג ואת vascuלטורה מתויג באמצעות הזרקה ורידי של בדיקה פלואורסצנט (כגון נקודות תוספי או הקוונטים), להראות כי, בעוד כלי הגידול הם אחיד חדירות משקל מולקולרי נמוך דקטרנס (g. 70 kD), משקל מולקולרי גבוה דקטרנס (155 kD) ותאי הגידול יכולים לחצות את האנדותל רק באתרים מיוחדים של in, הנמצאים במיקום מוגדר בנקודת הסתעפות כלי דם5, מיכל בן 6 , 7. מנתח אימונוהיסטוכימיה (ihc) באמצעות דגמי בעלי חיים וחומר מטופל-האדם הראו כי אתרים אלה הם "פתחים" המתמחים בוויסות חדירות כלי הדם, באופן מקומי ובארעיות, ומספק חלון קצר של הזדמנות עבור תאים נודדים/פולשנית סרטן כדי להיכנס למחזור הדם. דלתות אלה נקראות "מיקרוסביבה הגידול של גרורות" או "tmem", ו, די צפוי, צפיפות שלהם מתואם עם סיכון מוגבר לפתח מחלה גרורתית בחולי סרטן השד8,9, . בסדר, עשר
כל פתח TMEM מורכב משלושה סוגים שונים של תאים: מקרופאג הפריסקולרית, תא הגידול על-ידי הבעת ביטוי היונקים חלבון actin-רגולטוריות מאופשר (מנה), תא אנדותל, כל במגע פיזי ישיר אחד עם השני1, . חמש,תשע,10,11,12,13 האירוע העיקרי לתפקיד TMEM כדלת הכניסה הוא השחרור המותאם לשפות אחרות של גורמי הצמיחה של כלי הדם ("מקרופאג") אל הכלי המשמש כבסיס על ידי הperivascular דם14. הוא יכול לשבש את הצמתים הומוטיפקס בין התאים האנדותל15,16,17,18,19, תופעה שתוצאתה דליפת כלי דם ארעית, גם המכונה חדירות "מתפרצת" כפי שמתואר בלימודי IVI 5. מקרופאגים מסוימים הוכחו לבטא את הקולטן טירולך קינאז TIE2, אשר נדרש עבור הפונקציה של ומתווכת מתווך והביות של מקרופאגים אלה לנישה perivascular5,20,21 , 22. בנוסף ויסות תא סרטן הפצת גרורות, TIE2+ מקרופאגים הוכחו להיות הרגולטורים המרכזיים של אנגיוגנזה הגידול21,22,23, 24,25,26,27,28,29,30,31. ככזה, TIE2+ מקרופאגים מייצגים המרכיבים הקריטיים של מיקרוסביבה הגידול ואת הרגולטור העיקרי של המפל גרורתי.
כדי לשפר טוב יותר את היכולת של חדירות כלי הדם (כלומר "התפוצצות"), חשוב מאוד להבדיל ביניהם ממצבים אחרים של חדירות כלי הדם שאינם משויכים לפירוק הצמתים של תאי התא האנדותל. באנדותל ללא שינוי (אחד שהצמתים הצמודים והחסיד שלו אינם מכווצים), קיימים שלושה סוגים עיקריים של חדירות כלי הדם: (א) פינוציטוזה, אשר עשויים, או לא יכולים, להיות מצמידים לטראנטוטוטיות של החומר הבלוע; (ב) הובלת חומר באמצעות שורש הרכב; ו (ג) הובלה של חומר דרך המסלול הפרתאי, אשר מוסדר על ידי הצמתים הדוקים האנדותל15,16,17,18,19,32 , 33 , 34. למרות שהוא הוטלה בגידולים רבים, המצבים הנ ל של חדירות כלי הדם תוארו בעיקר בהקשר של פיזיולוגיה רקמות נורמלי הומאוסטזיס, הקיצוניויות של אשר הם רקמות עם חדירות מוגבלות ( לדוגמה, מחסום דם-מוח, בדיקת דם מחסום), או חדירות שופע (למשל, מדורג נימים של המנגנון הכליות של הכליה)34,35,36,37.
באמצעות הדמיה מרובת פוטון ומיקרוסקופ מיקרואוטרלוסקופיה, אנו מסוגלים להבחין בין חדירות לכלי דם ("התפוצצות") ומצבים אחרים של חדירות כלי הדם בגידולים בשד. כדי להשיג זאת, אנו מבצעים הזרקה אחת ורידית של משקל מולקולרי גבוה, fluorescently שכותרתו בדיקה בעכברים. אירועי התפוצצות ספונטנית לאחר מכן ניתן ללכוד באמצעות הדמיה intravital בעכברים חיים; או לחילופין, ניתן לכמת את המכשיר באמצעות לימודי לוקליזציה עם דם (לדוגמה, CD31+ או Endomucin+) ולהשתמש בכלי הרכב של מיקרוסקופ מאימונולופלנציה. הפרוטוקולים המוצגים כאן מתארים את שתי הטכניקות הללו, שניתן להשתמש בהן באופן עצמאי או בשיתוף אחד עם השני.
כל הניסויים המשתמשים בבעלי חיים חיים חייבים להתבצע בהתאם לשימוש בבעלי חיים ולהנחיות ולתקנות. ההליכים המתוארים במחקר זה בוצעו בהתאם לתקנות הלאומיות של המכון לבריאות הנוגעות לטיפול ולשימוש בבעלי חיים ניסיוניים ובאישור מכללת אלברט איינשטיין לרפואה ושימוש בבעלי חיים ועדה (IACUC).
1. הערכה של "חדירות מתפרצת" באמצעות דימות חי בעלי חיים
2. הערכה של תוספי extravascular באמצעות ניתוח רקמה קבועה
ההליכים הניסיוניים המתוארים במאמר פרוטוקול זה מסוכמים בקצרה ומומחשים באיור 1א-ג.
כדי למדוד את החדירות לכלי דם ("פעילות מתפרצת") ולהפחית את הרעש הניסיוני ממצבים אחרים של חדירות כלי הדם (כלומר, הפרתאי והפרתאי, כפי שהוסבר במבוא), אנו מתבצעים בעירוי (עירו...
כאן, אנו מתווה שני פרוטוקולים שניתן להחיל כדי להמחיש ולכמת סוג מסוים של חדירות כלי הדם אשר נוכח בדלתות TMEM והוא קשור לשיבוש של צמתים הדוקים ומלא כלי דם. סוג זה של חדירות כלי הדם הוא ארעי ונשלט על ידי מתחם התאים התלת-ממדי של TMEM, כפי שהוסבר מעל5. היכולת לזהות ולכמת הקשורים לחדירות כ?...
המחברים אינם מוסרים ניגודי אינטרסים.
ברצוני להודות למתקן הדימות האנליטי (AIF) במכללת אלברט איינשטיין לרפואה לתמיכה בהדמיה. עבודה זו נתמכת על ידי מענקים של NCI (P30CA013330, CA150344, CA 100324 ו CA216248), את מרכז הביופוטוניקה של מלון גרואס-ליפר ותוכנית ההדמיה המשולבת שלה, ורות ל' קירששטיין T32 הכשרה של המנתחים לחקר מיקרואקולוגיה הגידול (CA200561).
Gsk משותף כתב את כתב היד, ביצע הדמיה עבור איור 1c ו-3b, פיתח פרוטוקול ניתוח רקמות קבוע, וניתח ופירש את כל הנתונים; Jmp שיתוף כתב את כתב היד, וביצע את הניתוח ואת ההדמיה האינטרטל עבור איור 1B, 2c ו-3a; LB & AC ביצע את הניתוח והדמיה הדמיית עבור איור 2b; אר. ג'י ביצע את הניתוח והדמיה ממוחשבת לאיור 2 א; JSC co-כתב את כתב היד וניתח ופירש את כל הנתונים; Mho כתב את כתב היד וניתח ופירש את כל הנתונים; דה ביצע את הניתוח והדמיה של ההדמיה לאיור 2d, כתב את כתב היד, פיתח ניתוח רקמות קבועות ופרוטוקולי דימות, וניתח ופירש את כל הנתונים.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Anti-rabbit IgG (Alexa 488) | Life Technologies Corporation | A-11034 | |
Anti-rat IgG (Alexa 647) | Life Technologies Corporation | A-21247 | |
Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
Citrate | Eng Scientific Inc | 9770 | |
Cover Glass Slips | Electron Microscopy Sciences | 72296-08 | |
Cyanoacrylate Adhesive | Henkel Adhesive | 1647358 | |
DAPI | Perkin Elmer | FP1490 | |
Dextran-Tetramethyl-Rhodamine | Sigma Aldrich | T1287 | |
DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | |
Endomucin (primary antibody) | Santa Cruz Biotechnology | sc-65495 | |
Enrofloxacin | Bayer | 84753076 v-06/2015 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | |
Fish Skin Gelatin | Fisher Scientific | G7765 | |
Insulin Syringe | Becton Dickinson | 309659 | |
Isofluorane | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | |
Matrigel | Corning | CB40234 | Artificial extracellular matrix |
Needle (30 G) | Becton Dickinson | 305128 | |
Phosphate Buffered Saline | Life Technologies Corporation | PBS | |
Polyethylene Tubing | Scientific Commodities Inc | BB31695-PE/1 | |
Pulse Oximeter | Kent Scientific | MouseOx | |
Puralube Vet Ointment | Dechra | NDC 17033-211-38 | |
Quantum Dots | Life Technologies Corporation | Q21561MP | |
Rubber | McMaster Carr | 1310N14 | |
TMR (primary antibody) | Invitrogen | A6397 | |
Tween-20 | MP Biologicals | TWEEN201 | |
Xylene | Fisher Scientific | 184835 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved