JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מתארים שתי שיטות להערכת חדירות בכלי הדם ארעי הקשורים עם מיקרוסביבה הגידול של גרורות (tmem) הדלת הפתח ואת התא סרטן in, באמצעות הזרקה ורידית של משקל גבוה-מולקולרי (155 kda) תוספי בעכברים. השיטות כוללות הדמיה של האינטרטל בבעלי חיים חיים וניתוח רקמות קבועות באמצעות מאימונולובורנציה.

Abstract

הגורם השכיח ביותר של התמותה הקשורות לסרטן היא גרורות, תהליך המחייב הפצת תאים סרטניים מהגידול העיקרי לאתרים משניים. לאחרונה, הקמנו כי הפצת התאים הסרטניים בסרטן השד הראשוני באתרים גרורתי בריאות מתרחשת רק על הפתחים הנקראים מיקרוסביבה הגידול של גרורות (TMEM). מספר הדלת של TMEM הוא תחזיות עבור הישנות רחוקות של מחלה גרורתית בחולי סרטן השד. הפתחים tmem מורכבים תא סרטן אשר מבטא את החלבון אקטין הרגולציה ממנה במגע ישיר עם perivascular, proangiogenic המבטא רמות גבוהות של TIE2 ו-, היכן שני תאים אלה מאוגדים בחוזקה לדם . תא אנדותל תאים סרטניים יכולים לעבור באמצעות הפתחים TMEM עקב חדירות כלי דם ארעי שאורגן על ידי פעילות משותפת של מקרופאג הקשורים TMEM ו-TMEM-לבטא את תא סרטן. בכתב יד זה, אנו מתארים שתי שיטות להערכת היכולת הארעית של הגברת המתווכת בכלי הדם: הדמיה של הדמייה ומערכת חיסונית של רקמה קבועה. למרות שלכל השיטות יש יתרונות וחסרונות, השילוב בין השניים עשוי לספק את הניתוחים המשלימים ביותר של חדירות כלי דם, כמו גם תנאים מוקדמים מיקרו-סביבתיים עבור הפונקציה tmem מאז התהליך גרורתי בסרטן השד, ואולי סוגים אחרים של סרטן, כרוך הפצת תאים סרטניים באמצעות הפתחים TMEM זה חיוני להעסיק שיטות מבוססות היטב ניתוח של פעילות הדלת TMEM. שתי השיטות המתוארות כאן מספקות גישה מקיפה לניתוח של פעילות הדלת של TMEM או בבעלי חיים תמימים או בעלי טיפול תרופתי, שהוא בעל חשיבות עליונה לניסויים פרה-קליניים של סוכנים המונעים תא סרטן הפצה באמצעות TMEM.

Introduction

ההתפתחויות האחרונות ההבנה שלנו של גרורות סרטן חשפו כי המעבר אפיתל-to-mesenchal (צוות החירום) ואת אינדוקציה של מעבר לסרטן הנדידה/פולשנית של תאים לא, בעצמם, מספיק עבור הפצת המטדוגני 1. אכן, בעבר חשבו כי מתפשט בתאי הסרטן באמצעות מכלול של סרטן משויך אנדותל כמו הגידול neovasculature מאופיין לעתים קרובות על ידי כיסוי כריתת קרום נמוך, וככזה, הוא חדיר מאוד . לא יציב2,3,4 למרות מאוד מרמזת על פונקציות פגומות בתוך הגידול, שינויים כלי דם במהלך סרטן לא לספק ראיות כשלעצמו כי תאים סרטניים יכולים לחדור כלי דם בקלות בצורה בלתי מבוקרת. תובנות מפני הדמיית הדמיה (ivi) לימודים, שבו תאים סרטניים הם fluorescently אופן-מתויג ואת vascuלטורה מתויג באמצעות הזרקה ורידי של בדיקה פלואורסצנט (כגון נקודות תוספי או הקוונטים), להראות כי, בעוד כלי הגידול הם אחיד חדירות משקל מולקולרי נמוך דקטרנס (g. 70 kD), משקל מולקולרי גבוה דקטרנס (155 kD) ותאי הגידול יכולים לחצות את האנדותל רק באתרים מיוחדים של in, הנמצאים במיקום מוגדר בנקודת הסתעפות כלי דם5, מיכל בן 6 , 7. מנתח אימונוהיסטוכימיה (ihc) באמצעות דגמי בעלי חיים וחומר מטופל-האדם הראו כי אתרים אלה הם "פתחים" המתמחים בוויסות חדירות כלי הדם, באופן מקומי ובארעיות, ומספק חלון קצר של הזדמנות עבור תאים נודדים/פולשנית סרטן כדי להיכנס למחזור הדם. דלתות אלה נקראות "מיקרוסביבה הגידול של גרורות" או "tmem", ו, די צפוי, צפיפות שלהם מתואם עם סיכון מוגבר לפתח מחלה גרורתית בחולי סרטן השד8,9, . בסדר, עשר

כל פתח TMEM מורכב משלושה סוגים שונים של תאים: מקרופאג הפריסקולרית, תא הגידול על-ידי הבעת ביטוי היונקים חלבון actin-רגולטוריות מאופשר (מנה), תא אנדותל, כל במגע פיזי ישיר אחד עם השני1, . חמש,תשע,10,11,12,13 האירוע העיקרי לתפקיד TMEM כדלת הכניסה הוא השחרור המותאם לשפות אחרות של גורמי הצמיחה של כלי הדם ("מקרופאג") אל הכלי המשמש כבסיס על ידי הperivascular דם14. הוא יכול לשבש את הצמתים הומוטיפקס בין התאים האנדותל15,16,17,18,19, תופעה שתוצאתה דליפת כלי דם ארעית, גם המכונה חדירות "מתפרצת" כפי שמתואר בלימודי IVI 5. מקרופאגים מסוימים הוכחו לבטא את הקולטן טירולך קינאז TIE2, אשר נדרש עבור הפונקציה של ומתווכת מתווך והביות של מקרופאגים אלה לנישה perivascular5,20,21 , 22. בנוסף ויסות תא סרטן הפצת גרורות, TIE2+ מקרופאגים הוכחו להיות הרגולטורים המרכזיים של אנגיוגנזה הגידול21,22,23, 24,25,26,27,28,29,30,31. ככזה, TIE2+ מקרופאגים מייצגים המרכיבים הקריטיים של מיקרוסביבה הגידול ואת הרגולטור העיקרי של המפל גרורתי.

כדי לשפר טוב יותר את היכולת של חדירות כלי הדם (כלומר "התפוצצות"), חשוב מאוד להבדיל ביניהם ממצבים אחרים של חדירות כלי הדם שאינם משויכים לפירוק הצמתים של תאי התא האנדותל. באנדותל ללא שינוי (אחד שהצמתים הצמודים והחסיד שלו אינם מכווצים), קיימים שלושה סוגים עיקריים של חדירות כלי הדם: (א) פינוציטוזה, אשר עשויים, או לא יכולים, להיות מצמידים לטראנטוטוטיות של החומר הבלוע; (ב) הובלת חומר באמצעות שורש הרכב; ו (ג) הובלה של חומר דרך המסלול הפרתאי, אשר מוסדר על ידי הצמתים הדוקים האנדותל15,16,17,18,19,32 , 33 , 34. למרות שהוא הוטלה בגידולים רבים, המצבים הנ ל של חדירות כלי הדם תוארו בעיקר בהקשר של פיזיולוגיה רקמות נורמלי הומאוסטזיס, הקיצוניויות של אשר הם רקמות עם חדירות מוגבלות ( לדוגמה, מחסום דם-מוח, בדיקת דם מחסום), או חדירות שופע (למשל, מדורג נימים של המנגנון הכליות של הכליה)34,35,36,37.

באמצעות הדמיה מרובת פוטון ומיקרוסקופ מיקרואוטרלוסקופיה, אנו מסוגלים להבחין בין חדירות לכלי דם ("התפוצצות") ומצבים אחרים של חדירות כלי הדם בגידולים בשד. כדי להשיג זאת, אנו מבצעים הזרקה אחת ורידית של משקל מולקולרי גבוה, fluorescently שכותרתו בדיקה בעכברים. אירועי התפוצצות ספונטנית לאחר מכן ניתן ללכוד באמצעות הדמיה intravital בעכברים חיים; או לחילופין, ניתן לכמת את המכשיר באמצעות לימודי לוקליזציה עם דם (לדוגמה, CD31+ או Endomucin+) ולהשתמש בכלי הרכב של מיקרוסקופ מאימונולופלנציה. הפרוטוקולים המוצגים כאן מתארים את שתי הטכניקות הללו, שניתן להשתמש בהן באופן עצמאי או בשיתוף אחד עם השני.

Protocol

כל הניסויים המשתמשים בבעלי חיים חיים חייבים להתבצע בהתאם לשימוש בבעלי חיים ולהנחיות ולתקנות. ההליכים המתוארים במחקר זה בוצעו בהתאם לתקנות הלאומיות של המכון לבריאות הנוגעות לטיפול ולשימוש בבעלי חיים ניסיוניים ובאישור מכללת אלברט איינשטיין לרפואה ושימוש בבעלי חיים ועדה (IACUC).

1. הערכה של "חדירות מתפרצת" באמצעות דימות חי בעלי חיים

  1. השתלת גידולים השד syngeneic לתוך מארחי העכבר עם מקרופאגים פלורסנט
    1. ליצור חתיכות של רקמת הגידול מתאים להשתלה.
      1. הפקת גידולים fluorescently התוויות בתוך העכבר מודלים סרטן הפטמות על ידי חציית הספונטנית, autochthonous מהונדסים גנטית העכבר החלב סרטן מודל MMTV-PyMT עכברים עם עכברים טרנסגניים המבטא כתבים פלורסנט38, 39 [לדוגמה, חלבון פלורסנט ירוק משופר (egfp), חלבון פלורסנט משופר בצבע ציאן (ecfp), או Dendra2].
      2. אפשר את עכברי MMTV-PyMT עם התווית fluorescently לגדול לגודל של לא יותר מ 2 ס"מ (כ 10-12 שבועות של גיל).
      3. המתת החסד על ידי הגידול הנושאת את עכברי MMTV-PyMT על ידי הצבת אותם לתוך חדר עם 5% isofלפני 30 שניות לאחר כל הנשימות להפסיק.
      4. . בצע נקע בצוואר הרחם
      5. להסיר שיער מהבטן של העכבר מורדמים באמצעות קרם דפילציה אקטואלי.
      6. מניחים צלחת פטרי עם מדיום תרבות התאים DMEM/F12 על קרח.
      7. הנח את העכבר ואת צלחת פטרי על הקרח לתוך המנוע.
      8. . בבטן העכבר עם 70% אתיל אלכוהול
      9. באמצעות כפפות סטרילי וכלי כירורגי (מספריים מעוקר, מלקחיים, להב) להסיר את הגידולים ולמקם אותם לתוך צלחת פטרי.
      10. חותכים את הגידול לחתיכות קטנות (~ 2 מ"מ x 2 מ"מ x 2mm בגודל), להשליך כל מנות נקרוטיות, בעוד הם בצלחת פטרי.
    2. להשתיל את חתיכות הגידול לתוך מארחים הנמען.
      1. הגדל עכברים עם מקרופאגים מהונדסים גנטית, למשל, MacGreen40 או macgreen 41 עכברים (Csf1r-GAL4VP16/uas-ecfp)
      2. אפשר עכברים FVB עם מקרופאגים בעלי תווית פלואורוסקופים לצמוח לגיל של ~ 4-6 שבועות).
      3. מורדם העכברים FVB עם מקרופאגים המסומנים באמצעות פלואורוסקופים בחדר באמצעות 5% isofהלוטן עם חמצן כמו גז המוביל.
      4. להפחית את ההרדמה כדי ~ 3% isofלאנה ולהחיל משחה אופטלמולוגית לעיניים של העכבר כדי למנוע ייבוש.
      5. להסיר שיער ממעל בלוטת החלב 4 של העכבר.
      6. . נקה את העור עם הבטאדין חשוב לשמור על תנאים סטריליים לאורך שאר התהליך. זה כולל באמצעות מכשירים מעוקר ו ריאגנטים.
      7. לעשות חתך קטן ~ 2-3 מ"מ רק נחותים הפטמה 4 .
      8. מנתחים עד שבמשטח שומן החלב נחשף.
      9. קח פיסת הגידול מתוך צלחת פטרי ומעיל מטריצה מלאכותית.
      10. גידולים להשתלות מתחת לכרית השומן בחלב 4.
      11. סגור את החתך באמצעות דבק ציאנואקרילי.
      12. ברציפות לפקח על החיה עד שהוא מתאושש באופן מלא מן ההרדמה והוא מסוגל לשמור על שכיבה. כמו כן, אל תחזיר את בעל החיים לחברה של בעלי חיים אחרים עד להחלמה מלאה.
      13. כדי למזער זיהומים, להוסיף 1 מ ל של 100 mg/mL enrofloxacin אנטיביוטי לבקבוק מים שתייה של החיה (8 חליל עוז).
      14. אפשר גידולים לצמוח עד מוחשי (~ 5 מ"מ; ~ 4 שבועות).
      15. בהתאם לניסוי, הקצה את העכברים לקבוצות טיפול ובצע את הטיפולים המתאימים, אם ישים.
  2. התקנה להדמיה באמצעות הדמיה
    1. הפעל את שני הפוטונים. והגלאים של המיקרוסקופ
    2. הפעל את תיבת החימום והחם מראש את שלב x-y של המיקרוסקופ.
    3. מניחים את השלב המותאם אישית שנוצר42 לשלב x-y.
  3. הכנת חלון הדמיה
    1. לפני הגדרת עבור דימות, האוטוקלב את ההתאמה האישית מסגרת הדמיה חלון התמונה42.
    2. השתמש בפיפטה או במזרק אינסולין כדי למקם שכבה דקה של דבק ציאנואקריאקרילי למסגרת החלון ומוספית במקום זכוכית מעגלית בעובי 8 מ"מ.
      הערה: 1) חשוב להימנע מקבלת שאריות על הפתח הצלול של הזכוכית המכסה. 2) חשוב לדבוק בזכוכית המכסה למסגרת החלון לפחות 1 h לפני השימוש בהדמיה.
    3. בזהירות לנגב לנקות את כל ציאנואקריאקרילי עודף על הצמצם ברור של זכוכית המכסה באמצעות ניגוב מעבדה מוקטנים עם כמות קטנה של אצטון.
  4. הכנת צנתר וריד הזנב לניהול נוזלים וצבעי פלורסנט במהלך הדמיה
    1. חותכים פיסת 30 ס מ של צינורות פוליאתילן לבניית צנתר וריד הזנב.
    2. לנתק את החלק המחט של המחט 30 גרם מתוך להתחדד שלה על ידי לכופף בעדינות את המחט הלוך ושוב עד שהוא נשבר.
      הערה: יש להחזיק את המחט קרוב להתחדד, ולא לקצה המחט. זה יכול להתבצע עם צבת או מלקחיים כדי לתפוס את המחט על מנת למנוע פציעה מקל מחט.
    3. הכנס את הקצה הקהה של המחט לקצה אחד של אבובים פוליאתילן.
    4. הוסף את הקצה החדה של אחר 30 גרם מחט, שמירה על להתחדד שלה המצורפת, לקצה הנגדי של אבובים.
    5. מילוי 1 cc מזרק עם מלוחים באגירה פוספט, לצרף אותו Luer להתחדד של הצנתר התאספו, ולשטוף את הווריד הזנב ולוודא כי אין בועות אוויר במערכת.
    6. עבור תיוג כלי דם, למלא מזרק 1 cc עם 100 μL של 10 מ"ג/ק"ג 155 kDa dextran-טטרמתילרדאמן (TMR) או נקודות קוונטיות.
  5. הכנת העכבר להדמיה
    1. השתמשו בעכבר בכלוב מתחת (~ 1 רגל למטה) מנורת חום באמצעות 4%-5% מעורבב עם 100% חמצן מוגדר לזרימה של 1.5-2 L לדקה.
    2. הפעל מנורת חום על פני שטח עבודה כירורגי. שלב זה הוא קריטי לשמירה על טמפרטורת הגוף הפיזיולוגית הליבה של העכבר במהלך הניתוח.
    3. הניחו את העכבר מתחת למנורת החום והורידו את ההרדמה ל -2%-3% למשך הניתוח.
      הערה: הקפד לשמור על מנורת החום במרחק בטוח (~ 1 רגל) הרחק מהעכבר כדי למנוע התחממות יתר.
    4. להניח משחה אופטלמולוגית על העיניים של העכבר כדי למנוע ייבוש של העיניים והעיוורון.
    5. מבחן כי העכבר מורדם על ידי ביצוע בדיקת צביטה הבוהן. אם החיה נסוג, להגדיל את המינון של isof, על ידי 1% ולבחון מחדש ב 1-2 דקות.
    6. הכנס את הצנתר וריד הזנב לנקודה. המרוחק ביותר על הזנב האפשרי
    7. מוספית קטטר וריד הזנב אל הזנב עם פיסת נייר קטנה של המעבדה העוטפת סביב הזנב מקלות המחט כדי להבטיח שהוא לא מקבל העיפה.
    8. הכנס 50 μL עבור h של PBS דרך קטטר וריד הזנב כדי לספק לחות נאותה. זה קריטי כדי למנוע הזרקת יותר מדי נוזל (לא יותר מ 200 μL עבור h) או כל בועות לתוך הקטטר כמו זה יכול להיות קטלני לעכבר.
    9. מסירים את השיער על הבטן מעל בלוטות החלב הארבע והחמש באמצעות קרם להסרת שיער.
    10. נקו את העור עם הבטאדין והניחו לעור להתייבש.
    11. לעשות חתך האורך באמצע הדרך החל מיד מעולה על אברי המין ולשאת את החתך עד לרמה של ההיבט העליון של בלוטת החלב 4.
    12. מעבירים את החתך להיבט העליון של בלוטת החלב הרביעית. זה קריטי להימנע מלהתפשר. על אספקת הדם בשלב זה
    13. מנתחים את משטח שומן החלב מצפק יצירת כנף רקמה בעזרת מלקחיים ומספריים סטריליים.
      הערה: דש העור הדמיה היא חשופה לחפצי תנועה משמעותיים התייבשות רקמות. אלה נמנעים, כפי שמתואר בעבר43,44, על ידי דבקת חתיכת נוקשה של גומי מאחורי הצד של העור של הכנף (כדי להתקשות את הרקמה הרך לבודד אותו משאר הגוף) ולאחר מכן הצבת הגידול לתוך הדמיה רדודה חלון כדי לשמר את החות. זה קריטי עבור הדמיה יציבה כמו הגידול והרקמה הסובבת בהגדרה זו הם תואמים מאוד.
    14. ייצוב העור על ידי דבקת (עם דבק ציאנואקרילי) חתיכה קטנה של גומי קשיח מדידה 2 ס"מ x 2 ס מ בצד העור של הכנף. הגידול צריך להיות במרכז האזור שיוצב על ידי הגומי.
    15. לשמור על רקמות חשופות. מהתייבשות בטיפות של הערוץ הPBS
    16. החל סרט קטן של ציאנואקריאקרילי לשפה החיצונית של מסגרת חלון ההדמיה המותאמת אישית.
    17. החל droplet קטן של PBS (~ 10 – 20 μL) למרכז זכוכית המכסה.
    18. מייבשים את רקמת הכנף המקיפה. עם מגבון מעבדה זה קריטי כדי לוודא את הציאנואקריאקרילי על מסגרת החלון לא בא במגע עם ה-PBS על הזכוכית, כי זה יכול לגרום הציאנואקריל פולימריזציה ולהגדיר בטרם עת.
    19. מוספית חלון הדמיה קטנה לכנף הרקמה עם הגידול במרכז הצמצם ברור.
    20. הסר את תיבת החימום מהבמה.
    21. העבר את קטטר העכבר והזנב. לשלב המיקרוסקופ להשתמש בזהירות קיצונית כדי להבטיח את הצנתר וריד הזנב לא ליפול.
    22. מניחים את העכבר על הבמה בתנוחה הנוטה.
    23. מניחים את האצטרובל האף של isof, על החוטם כדי להבטיח תחזוקה של הרדמה.
    24. הכנס את החלון לתוך השעמום על צלחת הבמה x-y המותאמת אישית.
    25. מניחים את תיבת החימום בחזרה על הבמה כדי לשמור על טמפרטורה פיזיולוגית.
    26. לנטר את הסימנים החיוניים של בעל החיים על ידי הצמדת בדיקה הדופק אוקסימטר באמצעות חיישן החיתוך כף היד האחורי.
    27. הפחתה איטית של מניעת הצורך היא 0.5%-1% כדי לשמור על זרימת דם נאותה ולהימנע מלהחליש את העכבר.
  6. הדמיה של היפוטרטל
    הערה: ההדמיה שאנו מתארים בסעיף זה בוצעה על מיקרוסקופ רב לייזר בנוי בשני לייזרים, אשר תוארה בעבר5,39,45. בקצרה, לייזר משני השניים משמש להפקת 90 לייזר לאור בלייזר במרכזו במרכז 880 nm. אור הזריחה מזוהה עם שלושה מתוך ארבע בו הרכישה בו (כחול = 447/60, ירוק = 520/65, ו אדום 580/60; אורך הגל המרכזי/רוחב הפס) לאחר ההפרדה מן האור עירור על ידי דיקרואיק (עוצמת הצבע, Z720DCXXR). מעמד המיקרוסקופ מכיל 25x, 1.05 NA (הצמצם מספריים) זמן רב עבודה מרחק (2 מ"מ) המטרה עדשה. חשוב לציין, כי בעוד השתמשנו מיקרוסקופ בנוי באופן מותאם אישית, הפרוטוקול המתואר להלן ניתן לבצע על כל מיקרוסקופ מסחרי מולטיפוטון גם כן.
    1. מניחים טיפה של מים מזוקקים בין 25x, 1.05 NA מטרת המיקרוסקופ ואת זכוכית העטיפה של החלון כדי ליצור קשר אופטי.
    2. השתמש העין מיקרוסקופ להתמקד באזורים עם תאים סרטניים פלורסנט ליד פני השטח של החלון.
    3. למצוא כלי דם זורמים מקרופאגים המסומנים. חשוב להזרים כלי דם זורמים כדי להעריך את הדינמיקה של הוקובלטורה.
    4. העבר את המיקרוסקופ. למצב רב-פוטון
    5. הגדר את הגבולות העליונים והתחתונים של סדרת z, המודד כ-50 μm.
      1. הגדר את הגבול העליון של סדרת z באמצעות שמאי המוקד כדי להעביר את המטרה אל מיקום ההתחלה הרצוי, במיקום השטחית ביותר, וסימון מיקום זה כאפס בתוך התוכנה על-ידי לחיצה על לחצן Z העליון .
      2. הגדר את הגבול התחתון של סדרת z הזזת המטרה לשכבה העמוקה ביותר (בדרך כלל 50-70 יקרומטר מהחלק העליון עבור גידולים קטנים יותר) ולחיצה על לחצן z מיקום התחתונה.
      3. הגדר את גודל הצעד z ל-5 μm.
    6. לחץ על לחצן הלוח Time-פקיעה וקבע את מרווח הזמן בין רכישות ללפחות 10 s כדי לספק זמן מספיק כדי לחדש את המים מעל העדשה האובייקטיבית. זה נעשה באופן ידני עם פיפטה לחיץ על המטרה בזמן הצניחה הארוכה.
    7. הסר את המזרק עם ה-PBS ב קטטר וריד הזנב ולהחליף אותו עם מזרק אחר המכיל את 155 kDa dextran-TMR (טטרמתיל rhodamine).
    8. הכנס 100 μL של 155 kDa dextran-TMR באמצעות קטטר וריד הזנב.
    9. לאחר ההזרקה, החליפו את מזרק ה-TMR במזרק ה-PBS.
    10. לרכוש הדמיה בזמן מחסנית z על-ידי לחיצה על הלחצנים Z-מחסנית ו-פקיעה זמן, ולאחר מכן לחיצה על לחצן הרשומה.
    11. הכנס 50 μL של PBS כל 30-45 דקות כדי לשמור על הידרציה נאותה של בעל החיים. הימנע מהזרקת יותר מ-200 μL בזמן מאחר שפעולה זו עלולה לגרום לעומס יתר של נוזלים.
  7. מתת חסד
    1. הגדילו את האיזומטר עד 5% ושמרו על החיה מתחת ל -5% מתחת למטר עם חרוט האף במקום עד 30 לאחר הפסקת הנשימות.
    2. להסיר את העכבר מהבמה.
    3. . בצע פריקה בצוואר הרחם
  8. עיבוד תמונה
    1. לטעון את כל התמונות לתוך ImageJ ולעצב אותם לתוך 5 מימדי hyperstack (x, y, z, t, וערוץ צבע).
    2. בצע הפרדה של חפיפה ספקטרלית (כלומר: GFP ו-CFP) וחיסול של x-y סחיפה מן היפרערימות באמצעות שיטות שנקבעו38.
    3. השתמש בהתאמת הבהירות והניגודיות כדי להגדיל את הרמה הלבנה של ערוץ הדם כך שאות הרקע הופך לגלוי.
    4. עבור כל פרוסה z, בזהירות לבדוק כל סרט עבור סימנים של דליפת כלי דם חולף ("פרץ"). הפעלת הסרטים בשערי מסגרת מהירה (40 fps) עשויה לסייע לזיהוי זה.
    5. לאחר שזוהתה פרצה, החזר את הבהירות עבור ערוץ זה לרמה נורמלית וחתוך את ההיפר-מחסנית לאזור זה ו-z-slice.

2. הערכה של תוספי extravascular באמצעות ניתוח רקמה קבועה

  1. הכנה לגידול ולדוגמא
    הערה: החלק השני של פרוטוקול זה מניח כי גידולים בשד נקצרו מודל השתלת אורתוטופית של סרטן השד (כלומר MMTV-PyMT). מודל זה יכול להיות זהה לזה שמתואר בחלקהראשון של הפרוטוקול, למרות התווית המסומנת בצורה מרבית של גידולים אינם נחוצים בשלב זה.
    1. בעקבות הפסקת הצינור הניסיוני (תרופות, וכו '), לבצע הזרקה הזנב לשווא של 100 μL של 10 מ"ג/mL 155 kDa dextran-טטרמתיל, 1 h לפני הקרבת העכברים.
    2. להקריב את העכברים ולקצור את גידולים השד.
    3. לתקן גידולים 10% פורמלין עבור 48-72 h ולהמשיך פרפין-הטבעה.
    4. באמצעות microtome, לחתוך שני 5 μm-עבה שקופיות רציפים מ-formalin קבוע מוטבע פרפין (FFPE) רקמות. שקופית אחת משמשת לצביעת dextran, בעוד שהשני ישמש לביצוע משולש-IHC, לצורך התייחסות.
      הערה: פרוטוקול האנטי-אימונוהיסטוכימיה התלת-ממדי המתואר במקום אחר 10.
  2. אם מכתים וסורק את הראשון מבין שני המקטעים הרציפים
    1. שלח שקופיות לפרוטוקול מסוג דה-פרזציה סטנדרטי. זה כולל שתי ההשתקעות הבאות ב קסילן (10 דקות כל אחד), ואחריו התייבשות פתרונות אלכוהול מדולל באופן סדרתי (100%, 95%, 70%, ו 50% אטוח ב H2O עבור 2 דקות כל טבילה).
    2. בצע אחזור אנטיגן על-ידי חימום (קרוב לנקודת רתיחה) את הסעיפים המחוממים ציטראט (pH 6.0 מנוכי) עבור 20 דקות.
    3. תן את הדגימות קריר לטמפרטורת החדר עבור 15-20 דקות ולאחר מכן לשטוף ב-PBS 3x עבור 2 דקות כל כביסה.
    4. בלוק עבור 60-90 דקות במאגר חסימת (10% FBS; 1% BSA; 0.0025% העור ג'לטין הדגים; 0.05% PBST, כלומר PBS עם 0.05% ברצף-20).
    5. דגירה דגימות עם תערובת של נוגדנים העיקרי עכברוש וארנבת אשר היעד Endomucin ו TMR, בהתאמה, ולאחר מכן לשטוף ב-PBST 3x, 2 דקות כל אחד.
    6. דגירה דגימות עם תערובת של נוגדנים חמור משני נגד החולדה IgG (מצודת ל אלקסה-647) ו IgG ארנב (מצותת ל אלקסה-488), ולאחר מכן לשטוף ב-PBST 3x 2 דקות כל אחד.
    7. בצע כתמים שגרתיים של DAPI (כלומר טבילה בתמיסה DAPI עבור 5-6 דקות), הבהר את השקופיות באמצעות מדיום הרכבה "קשה" של גליצרול, ואחסן במקום אפל עד לסריקת.
    8. לקבלת תוצאות אופטימליות, סרוק את השקופיות בסורק שקופית דיגיטלי שלם.
  3. מחקר תמונה
    1. לכידת 10 שדות צריכת חשמל גבוהה (HPFs) לכל מקרה, באמצעות כל תוכנה המתאימה לפתולוגיה דיגיטלית.
    2. שמור את הערוצים Endomucin (אדום) ו-TMR (ירוק) בנפרד כ-TIFF.
    3. בעזרת ImageJ, העלו את קובצי TIFF והמירו אותם לתמונות של 8 סיביות.
    4. הוסף את התמונות של 8 סיביות לרמה של הפקד השלילי, וצור שתי תמונות בינמיות, המציגה את ה-Endomucin ו-TMR "מסיכות".
    5. מהכלים הבינאריים , בחר באפשרות ' מילוי חורים ' במסיכת endomucin.
    6. ליצור ולשמור את חמשת האזורים הבאים של ריבית: 1) התמונה thresholded תוספי כמו "תוספי roi" (ROI1), 2) התמונה הthresholded endomucin כמו "כלי דם roi" (ROI2), 3) התמונה endomucin הפוכה כמו "Extravascular roi" (ROI3), 4) מצטלב " Extravascular ROI "ו" Dextran ROI "התמונה (ROI1 ∩ ROI3) כמו" Extravascular Dextran ROI "(ROI4), ו 5) את כל התמונה כמו" התשואה הגידול "(ROI5).
    7. לחלק את אזור ROI4 על ידי האזור ROI5 ולהתרבות על ידי 100 כדי ליצור את השטח אחוז כי מכסה הextravascular תוספי בגידול כולו.
    8. חזור על התהליך עבור 10-20 HPFs לאירוע (בהתאם לזמינות הרקמה) וצור ממוצע Extravascular Dextran (% שטח) עבור כל מקרה.

תוצאות

ההליכים הניסיוניים המתוארים במאמר פרוטוקול זה מסוכמים בקצרה ומומחשים באיור 1א-ג.

כדי למדוד את החדירות לכלי דם ("פעילות מתפרצת") ולהפחית את הרעש הניסיוני ממצבים אחרים של חדירות כלי הדם (כלומר, הפרתאי והפרתאי, כפי שהוסבר במבוא), אנו מתבצעים בעירוי (עירו...

Discussion

כאן, אנו מתווה שני פרוטוקולים שניתן להחיל כדי להמחיש ולכמת סוג מסוים של חדירות כלי הדם אשר נוכח בדלתות TMEM והוא קשור לשיבוש של צמתים הדוקים ומלא כלי דם. סוג זה של חדירות כלי הדם הוא ארעי ונשלט על ידי מתחם התאים התלת-ממדי של TMEM, כפי שהוסבר מעל5. היכולת לזהות ולכמת הקשורים לחדירות כ?...

Disclosures

המחברים אינם מוסרים ניגודי אינטרסים.

Acknowledgements

ברצוני להודות למתקן הדימות האנליטי (AIF) במכללת אלברט איינשטיין לרפואה לתמיכה בהדמיה. עבודה זו נתמכת על ידי מענקים של NCI (P30CA013330, CA150344, CA 100324 ו CA216248), את מרכז הביופוטוניקה של מלון גרואס-ליפר ותוכנית ההדמיה המשולבת שלה, ורות ל' קירששטיין T32 הכשרה של המנתחים לחקר מיקרואקולוגיה הגידול (CA200561).

Gsk משותף כתב את כתב היד, ביצע הדמיה עבור איור 1c ו-3b, פיתח פרוטוקול ניתוח רקמות קבוע, וניתח ופירש את כל הנתונים; Jmp שיתוף כתב את כתב היד, וביצע את הניתוח ואת ההדמיה האינטרטל עבור איור 1B, 2c ו-3a; LB & AC ביצע את הניתוח והדמיה הדמיית עבור איור 2b; אר. ג'י ביצע את הניתוח והדמיה ממוחשבת לאיור 2 א; JSC co-כתב את כתב היד וניתח ופירש את כל הנתונים; Mho כתב את כתב היד וניתח ופירש את כל הנתונים; דה ביצע את הניתוח והדמיה של ההדמיה לאיור 2d, כתב את כתב היד, פיתח ניתוח רקמות קבועות ופרוטוקולי דימות, וניתח ופירש את כל הנתונים.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-rabbit IgG (Alexa 488)Life Technologies CorporationA-11034
Anti-rat IgG (Alexa 647)Life Technologies CorporationA-21247
Bovine Serum AlbuminFisher ScientificBP1600-100
CitrateEng Scientific Inc9770
Cover Glass SlipsElectron Microscopy Sciences72296-08
Cyanoacrylate AdhesiveHenkel Adhesive1647358
DAPIPerkin ElmerFP1490
Dextran-Tetramethyl-RhodamineSigma AldrichT1287
DMEM/F12Gibco11320-033
Endomucin (primary antibody)Santa Cruz Biotechnologysc-65495
EnrofloxacinBayer84753076 v-06/2015
Fetal Bovine SerumSigma AldrichF2442
Fish Skin GelatinFisher ScientificG7765
Insulin SyringeBecton Dickinson309659
IsofluoraneHenry ScheinNDC 11695-6776-2
MatrigelCorningCB40234Artificial extracellular matrix
Needle (30 G)Becton Dickinson305128
Phosphate Buffered SalineLife Technologies CorporationPBS
Polyethylene TubingScientific Commodities IncBB31695-PE/1
Pulse OximeterKent ScientificMouseOx
Puralube Vet OintmentDechraNDC 17033-211-38
Quantum DotsLife Technologies CorporationQ21561MP
RubberMcMaster Carr1310N14
TMR (primary antibody)InvitrogenA6397
Tween-20MP BiologicalsTWEEN201
XyleneFisher Scientific184835

References

  1. Karagiannis, G. S., Goswami, S., Jones, J. G., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. Signatures of breast cancer metastasis at a glance. Journal of Cell Science. 129 (9), 1751-1758 (2016).
  2. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  3. Raza, A., Franklin, M. J., Dudek, A. Z. Pericytes and vessel maturation during tumor angiogenesis and metastasis. American Journal of Hematology. 85 (8), 593-598 (2010).
  4. Pietras, K., Ostman, A. Hallmarks of cancer: interactions with the tumor stroma. Experimental Cell Research. 316 (8), 1324-1331 (2010).
  5. Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA. Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).
  6. Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
  7. Wyckoff, J. B., et al. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Research. 67 (6), 2649-2656 (2007).
  8. Sparano, J. A., et al. A metastasis biomarker (MetaSite Breast Score) is associated with distant recurrence in hormone receptor-positive, HER2-negative early-stage breast cancer. npj Breast Cancer. 3, 42 (2017).
  9. Rohan, T. E., et al. Tumor microenvironment of metastasis and risk of distant metastasis of breast cancer. Journal of the National Cancer Institute. 106 (8), (2014).
  10. Robinson, B. D., et al. Tumor microenvironment of metastasis in human breast carcinoma: a potential prognostic marker linked to hematogenous dissemination. Clinical Cancer Research. 15 (7), 2433-2441 (2009).
  11. Pignatelli, J., et al. Invasive breast carcinoma cells from patients exhibit MenaINV- and macrophage-dependent transendothelial migration. Science Signaling. 7 (353), 112 (2014).
  12. Oktay, M. H., Jones, J. G. TMEM: a novel breast cancer dissemination marker for the assessment of metastatic risk. Biomarkers in Medicine. 9 (2), 81-84 (2015).
  13. Roussos, E. T., et al. Mena invasive (Mena(INV)) and Mena11a isoforms play distinct roles in breast cancer cell cohesion and association with TMEM. Clinical & Experimental Metastasis. 28 (6), 515-527 (2011).
  14. Harney, A. S., et al. The Selective Tie2 Inhibitor Rebastinib Blocks Recruitment and Function of Tie2(Hi) Macrophages in Breast Cancer and Pancreatic Neuroendocrine Tumors. Molecular Cancer Therapeutics. 16 (11), 2486-2501 (2017).
  15. Bates, D. O., Lodwick, D., Williams, B. Vascular endothelial growth factor and microvascular permeability. Microcirculation. 6 (2), 83-96 (1999).
  16. Lee, Y. C. The involvement of VEGF in endothelial permeability: a target for anti-inflammatory therapy. Current Opinion in Investigational Drugs. 6 (11), 1124-1130 (2005).
  17. Roberts, W. G., Palade, G. E. Neovasculature induced by vascular endothelial growth factor is fenestrated. Cancer Research. 57 (4), 765-772 (1997).
  18. Stan, R. V., et al. Immunoisolation and partial characterization of endothelial plasmalemmal vesicles (caveolae). Molecular Biology of the Cell. 8 (4), 595-605 (1997).
  19. Roberts, W. G., Palade, G. E. Increased microvascular permeability and endothelial fenestration induced by vascular endothelial growth factor. Journal of Cell Science. 108, 2369-2379 (1995).
  20. Arwert, E. N., et al. A Unidirectional Transition from Migratory to Perivascular Macrophage Is Required for Tumor Cell Intravasation. Cell Reports. 23 (5), 1239-1248 (2018).
  21. Kadioglu, E., De Palma, M. Cancer Metastasis: Perivascular Macrophages Under Watch. Cancer Discovery. 5 (9), 906-908 (2015).
  22. Hughes, R., et al. Perivascular M2 Macrophages Stimulate Tumor Relapse after Chemotherapy. Cancer Research. 75 (17), 3479-3491 (2015).
  23. Riabov, V., et al. Role of tumor associated macrophages in tumor angiogenesis and lymphangiogenesis. Frontiers in Physiology. 5, 75 (2014).
  24. Squadrito, M. L., De Palma, M. Macrophage regulation of tumor angiogenesis: implications for cancer therapy. Molecular Aspects of Medicine. 32 (2), 123-145 (2011).
  25. Ferrara, N. Role of myeloid cells in vascular endothelial growth factor-independent tumor angiogenesis. Current Opinion in Hematology. 17 (3), 219-224 (2010).
  26. Solinas, G., Germano, G., Mantovani, A., Allavena, P. Tumor-associated macrophages (TAM) as major players of the cancer-related inflammation. Journal of Leukocyte Biology. 86 (5), 1065-1073 (2009).
  27. Venneri, M. A., et al. Identification of proangiogenic TIE2-expressing monocytes (TEMs) in human peripheral blood and cancer. Blood. 109 (12), 5276-5285 (2007).
  28. Lewis, C. E., De Palma, M., Naldini, L. Tie2-expressing monocytes and tumor angiogenesis: regulation by hypoxia and angiopoietin-2. Cancer Research. 67 (18), 8429-8432 (2007).
  29. Mazzieri, R., et al. Targeting the ANG2/TIE2 axis inhibits tumor growth and metastasis by impairing angiogenesis and disabling rebounds of proangiogenic myeloid cells. Cancer Cell. 19 (4), 512-526 (2011).
  30. Lewis, C. E., Ferrara, N. Multiple effects of angiopoietin-2 blockade on tumors. Cancer Cell. 19 (4), 431-433 (2011).
  31. Gabrusiewicz, K., et al. Anti-vascular endothelial growth factor therapy-induced glioma invasion is associated with accumulation of Tie2-expressing monocytes. Oncotarget. 5 (8), 2208-2220 (2014).
  32. Karagiannis, G. S., Condeelis, J. S., Oktay, M. H. Chemotherapy-induced metastasis: mechanisms and translational opportunities. Clinical & Experimental Metastasis. , (2018).
  33. Senger, D. R., et al. Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid. Science. 219 (4587), 983-985 (1983).
  34. Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier. Handbook of Clinical Neurology. 133, 39-59 (2016).
  35. Satchell, S. C., Braet, F. Glomerular endothelial cell fenestrations: an integral component of the glomerular filtration barrier. American Journal of Physiology: Renal Physiology. 296 (5), 947-956 (2009).
  36. Stan, R. V. Endothelial stomatal and fenestral diaphragms in normal vessels and angiogenesis. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 11 (4), 621-643 (2007).
  37. Mruk, D. D., Cheng, C. Y. The Mammalian Blood-Testis Barrier: Its Biology and Regulation. Endocrine Reviews. 36 (5), 564-591 (2015).
  38. Entenberg, D., et al. Imaging Tumor Cell Movement in Vivo. Current Protocols in Cell Biology. 58 (1), 1-19 (2013).
  39. Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
  40. Sasmono, R. T., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
  41. Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. Journal of Leukocyte Biology. 83 (2), 430-433 (2008).
  42. Entenberg, D., et al. Time-lapsed, large-volume, high-resolution intravital imaging for tissue-wide analysis of single cell dynamics. Methods. 128, 65-77 (2017).
  43. Pastoriza, J. M., et al. Black race and distant recurrence after neoadjuvant or adjuvant chemotherapy in breast cancer. Clinical & Experimental Metastasis. , (2018).
  44. Williams, J. K., et al. Validation of a device for the active manipulation of the tumor microenvironment during intravital imaging. Intravital. 5 (2), 1182271 (2016).
  45. Harney, A. S., Wang, Y., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment. Journal of Visualized Experiments. (112), e54042 (2016).
  46. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  47. Roussos, E. T., et al. Mena invasive (MenaINV) promotes multicellular streaming motility and transendothelial migration in a mouse model of breast cancer. Journal of Cell Science. 124, 2120-2131 (2011).
  48. Karagiannis, G. S., et al. Neoadjuvant chemotherapy induces breast cancer metastasis through a TMEM-mediated mechanism. Science Translational Medicine. 9 (397), (2017).
  49. Chang, Y. S., Jalgaonkar, S. P., Middleton, J. D., Hai, T. Stress-inducible gene Atf3 in the noncancer host cells contributes to chemotherapy-exacerbated breast cancer metastasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (34), 7159-7168 (2017).
  50. Jain, R. K. Normalization of tumor vasculature: an emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. 307 (5706), 58-62 (2005).
  51. Winkler, F., et al. Kinetics of vascular normalization by VEGFR2 blockade governs brain tumor response to radiation: role of oxygenation, angiopoietin-1, and matrix metalloproteinases. Cancer Cell. 6 (6), 553-563 (2004).
  52. Goel, S., et al. Normalization of the vasculature for treatment of cancer and other diseases. Physiological Reviews. 91 (3), 1071-1121 (2011).
  53. Jain, R. K. Normalizing tumor microenvironment to treat cancer: bench to bedside to biomarkers. Journal of Clinical Oncology. 31 (17), 2205-2218 (2013).
  54. Carmeliet, P., Jain, R. K. Principles and mechanisms of vessel normalization for cancer and other angiogenic diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (6), 417-427 (2011).
  55. Meijer, E. F., Baish, J. W., Padera, T. P., Fukumura, D. Measuring Vascular Permeability In Vivo. Methods in Molecular Biology. 1458, 71-85 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

148

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved