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要約

マウスにおける高分子量(155kDa)デキストランの静脈注射を用いて、転移(TMEM)戸口機能および癌細胞イントラバシスの腫瘍微小環境に関連する一過性血管透過性を評価する2つの方法について述べた。この方法には、生きた動物におけるインビタルイメージングと免疫蛍光を用いた固定組織分析が含まれる。

要約

癌関連死亡率の最も一般的な原因は転移であり、原発性腫瘍から二次部位への癌細胞の普及を必要とするプロセスである。近年、原発性乳癌および肺の転移部位における癌細胞の播種は、転移の腫瘍微小環境(TMEM)と呼ばれる出入り口でのみ起こることを確立した。TMEM出入口数は、乳癌患者における転移性疾患の遠隔再発について予後である。TMEM出入口は、これらの細胞の両方が血液に密着しているTIE2およびVEGFの高レベルを発現する前血管異性マクロファージと直接接触してアクチン調節タンパク質メナを過剰発現する癌細胞で構成されています。血管内皮細胞。癌細胞は、TMEM関連マクロファージおよびTMEM関連メナ発現癌細胞の関節活性によって調整された一過性血管透過性のためにTMEM出入口を通ってイントラバサテることができる。本原稿では、TMEM媒介過渡血管透過性の評価のための2つの方法について、インビタルイメージングと固定組織免疫蛍光について述べた。どちらの方法にも長所と短所がありますが、この2つを組み合わせることで、TMEM媒介血管透過性の最も完全な分析と、TMEM機能の微小環境前提条件が提供される可能性があります。乳癌における転移過程、およびおそらく他のタイプの癌は、TMEM出入口を介した癌細胞の普及を伴うので、TMEM出入り口活動の分析のために十分に確立された方法を採用することが不可欠である。ここで説明する2つの方法は、がん細胞を予防する薬剤の前臨床試験において最も重要である、ナイーブまたは薬理学的に処置された動物におけるTMEM出入り口活動の分析に対する包括的なアプローチを提供する。TMEMを通じて普及しています。

概要

がん転移に関する我々の理解の最近の進歩は、上皮間葉転移(EMT)と移動性/侵襲性癌細胞の細胞下集団の誘導は、それ自体では、発散性の普及に十分ではないことを明らかにした。1.確かに、腫瘍新生物は、癌関連内皮の全体を通して転移する癌細胞は、しばしば低膜球カバレッジによって特徴付けられ、そのように、非常に透過性が高いと考えられていた。不安定な2,3,4.腫瘍内の欠陥機能を非常に示唆しているが、発癌中の血管修飾は、腫瘍細胞が容易かつ制御不能な方法で血管に浸透できるという証拠をそれ以上に提供しない。腫瘍細胞が蛍光タグ付きで、血管系が蛍光プローブ(デキストランや量子ドットなど)の静脈注射によって標識されるインビタルイメージング(IVI)研究からの洞察は、腫瘍血管が均一である一方で、そのことを示している。低分子量デクトランス(例えば70kD)、高分子量デキストランス(155kD)および腫瘍細胞に透過可能であり、血管分岐点5に優先的に位置するイントラバセーションの特殊部位でのみ内皮を横切ることができる。6,7.動物モデルとヒト患者由来材料を用いた免疫組織化学(IHC)分析は、これらの部位が血管透過性を調節することに特化した「出入り口」であることを示している。移動/浸潤性癌細胞が循環に入る機会。これらの出入り口は「転移の腫瘍微小環境」または「TMEM」と呼ばれ、その密度は乳癌患者8,9の転移性疾患を発症するリスクの増加と相関する。 10.

各TMEM出入口は、3つの異なるタイプの細胞で構成されています:血管間マクロファージ、アクチン調節タンパク質哺乳動物を過剰発現する腫瘍細胞(Mena)、および内皮細胞は、すべて互いに直接物理的に接触し、1、 5,9,10,11,12,13.TMEMをイントラバゼーションの出入り口として機能させる重要な事象は、血管内皮成長因子(VEGF)が血管皮下マクロファージ14によって基礎血管に局所的に放出される。VEGFは、内皮細胞間の同質接合部を破壊することができる15,16,17,18,19,一過性血管漏出をもたらす現象, また、IVI研究5で説明されているように「破裂」透過性として知られています。TMEMマクロファージは、VEGF媒介TMEM機能およびこれらのマクロファージの発現に必要なチロシンキナーゼ受容体TIE2を発現することが示されている5,20,21,22.癌細胞の播種および転移を調節することに加えて、TIE2+マクロファージは腫瘍血管新生の中心調節因子であることが示されている21,22,23, 24,25,26,27,28,29,30,31.したがって、TIE2+マクロファージは、腫瘍微小環境および転移カスケードの主な調節管の重要な構成要素を表す。

TMEM媒介血管透過性(すなわち「破裂」)をより概念化するためには、内皮細胞接合部の溶解に関連しない他の血管透過性のモードと区別することが非常に重要である。無傷の内皮(接合部と接合部が破壊されないもの)では、(a)ピノサイトシスは、摂取された物質の経血症と結合してもよいし、そうでないかもしれない、という3つの主要なタイプがある。(b) 内皮フェネストレーを介した材料の輸送;(c)内皮タイトジャンクション15,16,17,18,19,32によって調節される前細胞経路を介した物質の輸送,33歳,34.多くの腫瘍で調節が緩やかであるが、前述の血管透過性の様式は、主に正常組織生理学および恒常性の文脈において説明されてきたが、その極端なは、透過性が制限された組織である(例えば、血液脳関門、血液精巣関門、または豊富な透過性(例えば、腎臓糸球体装置の毛細血管をフェネストした)34、35、36、37。

多光子インビタルイメージングと多重免疫蛍光顕微鏡を用いて、TMEM媒介血管透過性(「破裂」)と乳房腫瘍における血管透過性の他のモードを区別することができる。これを達成するために、我々は、マウスで高分子量、蛍光標識プローブの単一の静脈注射を行う。自発的な破裂イベントは、生きたマウスのインビタルイメージングを使用して捕捉することができます。あるいは、プローブの散用は、免疫蛍光顕微鏡を用いて血液血管系(例えばCD31+またはエンドムチン+)およびTMEM出入口との共局在研究によって定量化することができる。ここで説明するプロトコルは、これらの手法の両方について説明しています。

プロトコル

生きた動物を用いるすべての実験は、動物の使用およびケアのガイドラインおよび規則に従って行われなければならない。本研究に記載されている手順は、実験動物のケアと使用に関する国立衛生研究所の規則に従い、アルバート・アインシュタイン医科動物ケア・アンド・ユースカレッジの承認を得て実施されました。委員会(IACUC)。

1. 生きた動物イメージングを用いての「破裂透過性」の評価

  1. 蛍光マクロファージを用いたマウス宿生への同種乳房腫瘍の移植
    1. 移植に適した腫瘍組織の断片を生成します。
      1. 蛍光レポーターを発現するトランスジェニックマウスを用いて、自発的、自己伝達性、遺伝子操作されたマウス乳がんモデルMMTV-PyMTマウスを横断することにより、マウス乳がんモデルにおける蛍光標識腫瘍を生成する38、 39[例えば、増強された緑色蛍光タンパク質(EGFP)、高められたシアン蛍光タンパク質(ECFP)、またはDendra2]。
      2. 蛍光標識腫瘍を有するMMTV-PyMTマウスが2cm以下(生後約10~12週)の大きさに成長することを許可する。
      3. すべての呼吸が停止した後30秒まで5%のイソファルランでチャンバーにそれらを置くことによって、MMTV-PyMTマウスを持つ腫瘍を安楽死させる。
      4. 頸部脱臼を行う。
      5. 局所脱毛クリームを使用して安楽死マウスの腹部から毛髪を取り除きます。
      6. DMEM/F12細胞培養培地を氷の上に置きます。
      7. ヒュームフードに氷の上にマウスとペトリ皿を置きます。
      8. 70%のエチルアルコールでマウスの腹部を消毒します。
      9. 滅菌手袋と外科用具(殺菌されたはさみ、鉗子、刃物)を使用して腫瘍を取り除き、ペトリ皿に入れます。
      10. 腫瘍を小片(約2mm x 2mm x 2mmの大きさ)に切り取り、ペトリ皿の中にある間、壊死部分を捨てます。
    2. 腫瘍片をレシピエント宿主に移植する。
      1. 遺伝子操作された蛍光標識マクロファージを用いたマウスの挙げ(例えば、MacGreen40またはMacBlue 41マウス(Csf1r -GAL4VP16/UAS-ECFP)
      2. 蛍光標識マクロファージを有するFVBマウスが〜4〜6週間の年齢に成長することを許可する)。
      3. FVBマウスを蛍光標識マクロファージで麻酔し、5%のイソファランをキャリアガスとして酸素を用いた。
      4. 麻酔を~3%のイソフランに減らし、乾燥を防ぐためにマウスの目に眼のオチントを適用する。
      5. マウスの4番目の乳腺の上から髪を削除します。
      6. ベタジンで肌をきれいにします。手順の残りの部分を通して生殖不能状態を維持することが重要です。これには、殺菌された器具および試薬の使用が含まれる。
      7. 小さな切開~2〜3mmはちょうど4番目の乳首に劣る。
      8. 乳腺脂肪パッドが露出するまで解剖する。
      9. ペトリ皿から腫瘍片を取り出し、人工細胞外マトリックスにコートします。
      10. 第4乳房脂肪パッドの下に移植腫瘍。
      11. シアノクリレート接着剤を使用して切開部を閉じます。
      12. それは完全に麻酔から回復し、厳しい回復を維持することができるまで、継続的に動物を監視します。また、完全に回復するまで、他の動物の会社に動物を返却しないでください。
      13. 感染を最小限に抑えるために、動物の飲料水ボトル(8オンス)に100mg/mLエンロフロキシン抗生物質の1 mLを追加します。
      14. 触知可能になるまで腫瘍が増殖することを許可する(〜5ミリメートル;〜4週間)。
      15. 実験に応じて、マウスを治療群に割り当て、該当する場合は対応する治療を行う。
  2. イントラビタルイメージングのセットアップ
    1. 顕微鏡の2光子レーザーと検出器をオンにします。
    2. 加熱ボックスの電源を入れ、顕微鏡のx-yステージを予熱します。
    3. カスタムメイドのステージインサート42をx-yステージに配置します。
  3. イメージングウィンドウの準備
    1. イメージング用に設定する前に、カスタムメイドの円形イメージングウィンドウフレーム42をオートクレーブします。
    2. ピペットまたはインスリン注射器を使用して、窓枠にシアノクリレート接着剤の薄い層を配置し、8ミリメートルの円形カバーガラスを配置します。
      注:1)カバーガラスのクリアな開口部に残留物を得ることを避けるために重要です。2)イメージングに使用する前に、カバーガラスを窓枠に少なくとも1時間付着することが重要です。
    3. 少量のアセトンで濡れた実験室の拭き取りを使用して、カバーガラスの明確な開口部に余分なシアノクリレートを慎重に拭きます。
  4. イメージング中の液体および蛍光色素の投与のための尾静脈カテーテルの調製
    1. 30cmのポリエチレンチューブを切り、尾静脈カテーテルを作ります。
    2. 30G針の針部分をLuerテーパから取り外し、針が壊れるまでゆっくりと前後に曲げます。
      注:針は、針の先端ではなく、Luerテーパーの近くに保持する必要があります。これは針の棒の傷害を防ぐために針をつかむためにペンチか鉗子と行うことができる。
    3. ポリエチレンチューブの一端に針の鈍い端を挿入します。
    4. 別の30G針の鋭い端を挿入し、そのLuerテーパをチューブの反対側の端に取り付けたままにします。
    5. 1ccシリンジをリン酸緩衝生理食べ物で満たし、組み立てられたカテーテルのLuerテーパに取り付け、テール静脈カテーテルを洗い流し、システムに気泡がないことを確認します。
    6. 血管標識の場合は、10mg/kg 155 kDa デキストランテトラメチルロダミン(TMR)または量子ドットの100 μLで1ccシリンジを充填します。
  5. イメージング用マウスの調製
    1. 4%-5%のイソムランを使用してヒートランプの下のケージ(~1フィート下)でマウスを麻酔し、100%酸素を100%の酸素と混合し、1分当たり1.5-2 Lの流れに設定します。
    2. 外科作業区域の上のヒートランプをオンにする。このステップは、手術中にマウスのコア生理体温を維持するために重要です。
    3. マウスをヒートランプの下に置き、手術中は麻酔を2%~3%に下げます。
      注: ヒートランプは、過熱を避けるために、マウスから安全な距離(~1 フィート)離れた場所に保管してください。
    4. 眼の目の乾燥や失明を防ぐために、マウスの目に眼のチントを置きます。
    5. つま先ピンチテストを行ってマウスが麻酔されたことをテストします。動物が撤退した場合は、イソファランの投与量を1%増加させ、1-2分で再検査する。
    6. 可能な尾の最も遠位点に尾静脈カテーテルを挿入します。
    7. 尾静脈カテーテルを尾部に貼り付け、尾の周りを包み、針に付着する小さなラボテープを貼り付けて、それが脱落しないようにします。
    8. 十分な水分補給を提供するために、尾静脈カテーテルを通してPBSのh当たり50 μLを注入する。これは、マウスに致命的な可能性があるので、あまりにも多くの流体(1hあたり200 μL以下)またはカテーテルに任意の気泡を注入しないようにすることが重要です。
    9. 脱毛クリームを使用して、4番目と5番目の乳腺の上に腹部の毛を削除します。
    10. ベタジンで肌をきれいにし、肌を乾燥させます。
    11. 性器よりも直ちに優れた縦方向の中線切開を行い、4番目の乳腺の優れた側面のレベルまで切開を運ぶ。
    12. 切開を第4乳房腺の優れた側面に横に運ぶ。この時点で血液供給を損なうことを避けるために重要です。
    13. 精節の脂肪パッドを精毒し、滅菌鉗子とはさみを使って組織フラップを作成します。
      注:皮膚フラップイメージングは、重要な運動アーティファクトや組織脱水の影響を受けやすくなります。これらは、前述の43、44のように、フラップの皮膚側に硬質のゴム片を貼り付け(軟部組織を硬くし、体の残りの部分から分離する)、腫瘍を浅いイメージングに置くことによって回避される。水分補給を維持するための窓。この設定の腫瘍および周囲の組織は非常に準拠しているので、これは安定したイメージ投射のために重要である。
    14. フラップの皮膚側に2cm x 2cmを測定する硬質ゴムの小片(シアノアクリル接着剤で)を貼り付けることによって皮膚フラップを安定させます。腫瘍は、ゴムによって安定化されている領域の中心にあるべきである。
    15. 露出した組織をPBSの滴で水和してください。
    16. カスタムメイドのイメージングウィンドウフレームの外縁にシアノクリレートの小さなフィルムを適用します。
    17. カバーガラスの中央にPBS(~10~20 μL)の小さな液滴を塗布します。
    18. 周囲のフラップティッシュを実験室の拭き取りで乾かします。これは、シアノクリレートが重合し、早期に設定する可能性があり、窓枠上のシアノクリレートがガラス上のPBSと接触しないことを確認することが重要です。
    19. 小さなイメージングウィンドウを組織フラップに貼り付け、透明な開口部の中心に腫瘍を付けます。
    20. ステージから暖房ボックスを取り外します。
    21. 麻酔マウスと尾静脈カテーテルを顕微鏡段階に移します。尾静脈カテーテルが落ちないように注意してください。
    22. 傾向のある位置のステージにマウスを置きます。
    23. 麻酔の維持を確実にするために鼻の上にイソファランの鼻コーンを置きます。
    24. カスタム x-y ステージ プレートのボアにウィンドウを挿入します。
    25. 生理的温度を維持するために、加熱ボックスをステージに戻します。
    26. クリップセンサーを介してパルスオキシメータプローブを背中の足に取り付け、動物のバイタルサインを監視します。
    27. 適切な血流を維持し、マウスの麻酔を避けるために、0.5%-1%にゆっくりとイソファランを減少させます。
  6. イントラビタルイメージング
    注:このセクションで説明するイメージングは、前述の5、39、45のカスタム構築された2レーザーマルチフォトン顕微鏡で行われました。簡単に言えば、フェムト秒レーザーは、880 nmを中心とする90フェムト秒パルスレーザー光を生成するために使用されます。蛍光光は、ダイクロイック(クロマ、Z720DCR)によって励起光から分離した後、4つの同時取得検出器(青=447/60、緑=520/65、赤580/60;中央波長/帯域幅)の3つによって検出されます。顕微鏡スタンドには、25倍、1.05 NA(数値開口)の長い作業距離(2mm)対物レンズが含まれています。我々はカスタム構築された顕微鏡を使用しているが、以下に説明するプロトコルは、同様に市販のマルチフォトン顕微鏡で達成することができることに注意することが重要です。
    1. 25x、1.05 NA顕微鏡の目的と窓のカバーガラスの間に蒸留水を一滴置き、光学接触を行います。
    2. 顕微鏡の眼鏡を使用して、窓の表面の近くに蛍光腫瘍細胞がある領域に焦点を当てます。
    3. 流れる血管とラベル付きマクロファージを見つける。血管のダイナミクスを評価するために流れる血管を持つことが重要です。
    4. 顕微鏡をマルチフォトンモードに切り替えます。
    5. Z シリーズの上限と下限を設定し、約 50 μm を測定します。
      1. フォーカスアジャスターを使用して目的を最も表面的な位置に移動し、Z位置トップボタンをクリックしてソフトウェア内でゼロにマークすることで、Zシリーズの上限を設定します。
      2. 目的を最も深い層(通常は小さな腫瘍の場合は上部から50~70μm)に移動し、Z位置の下ボタンをクリックするZ系列の下限を設定します。
      3. Z ステップサイズを 5 μm に設定します。
    6. [タイムラプスパネル]ボタンをクリックし、集録間の時間間隔を少なくとも10秒に設定し、対物レンズの上の水を補充するのに十分な時間を提供します。これは、長い時間の経過の間に目的にスクイズピペットで手動で行われます。
    7. 尾静脈カテーテルにPBSで注射器を取り出し、155 kDaデキストラン-TMR(テトラメチルロダミン)を含む別の注射器に置き換えます。
    8. 尾静脈カテーテルを介して155 kDaデキストラン-TMRの100 μLを注入する。
    9. 注射後、TMRシリンジをPBSシリンジに交換します。
    10. Z スタックボタンとタイムラプス ボタンをクリックし、レコード ボタンをクリックして Z スタック タイム ラプス イメージングを取得します。
    11. 動物の適切な水分補給を維持するために、30〜45分ごとに50 μLのPBSを注入します。これは流体の過負荷を引き起こす可能性がありますので、一度に200 μL以上を注入することは避けてください。
  7. 安楽死
    1. イソファランを5%に増やし、呼吸が止まる30度まで鼻コーンを持つイソファルランを5%以下に保つ。
    2. ステージからマウスを取り外します。
    3. 頸部脱臼を行う。
  8. 画像処理
    1. すべてのイメージを ImageJ に読み込み、5 次元ハイパースタック (x、y、z、t、およびカラー チャネル) に書式設定します。
    2. スペクトルオーバーラップ(すなわち:GFPおよびCFP)の分離を行い、確立された方法38を用いてハイパースタックからのx-yドリフトの除去を行う。
    3. 明るさとコントラストの調整を使用して、背景信号が表示されるように、血液チャネルの白いレベルを上げます。
    4. 各Zスライスについて、各ムービーに一時的な血管漏れ(「バースト」)がないか慎重に検査します。高速フレーム レート (40 fps) でムービーを実行すると、この識別に役立つ場合があります。
    5. バーストが識別されたら、このチャンネルの明るさを通常のレベルに戻し、ハイパースタックをこの領域と Z スライスにトリミングします。

2. 固定組織分析を用いた血管外デキストランの評価

  1. 腫瘍およびサンプル製剤
    注:このプロトコルの第2部は、乳房癌の奇次移植マウスモデル(すなわちMMTV-PyMT)から乳房腫瘍が採取されたことを前提としている。このモデルは、プロトコルの第1部に記載されているものと同じである可能性がありますが、この時点では蛍光標識腫瘍は必要ありません。
    1. 実験パイプラインの終了後(すなわち薬物治療等)に続いて、マウスを犠牲にする前に10mg/mL 155 kDaデキストランテトラメチルロダミンの100μLのテール無駄注射を行う。
    2. マウスを犠牲にし、乳房腫瘍を収穫します。
    3. 48-72時間の10%ホルマリンで腫瘍を修正し、パラフィン埋め込みに進みます。
    4. マイクロトームを使用して、ホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)組織から2つの5 μm厚のシーケンシャルスライドを切断します。一方のスライドはデキストランの染色に使用され、もう一方はTMEMトリプルIHCの実行に使用されます。
      注:TMEM三重免疫組織化学プロトコルは、他の場所で10について説明されている。
  2. 2つの順次セクションの最初のIF染色とスキャン
    1. 標準の非パラフィン化プロトコルにスライドを送信します。これには、キシレンの2つの後続の浸漬(各10分)が含まれ、続いて連続希釈アルコール溶液中の脱水(100%、95%、70%、およびH2 Oの50%EtOHを各浸漬の2分間)。
    2. クレート(pH 6.0調整)で20分間水没した部分を加熱(沸点に近い)加熱して抗原検索を行います。
    3. サンプルを室温まで15~20分間冷やし、PBS 3xで2分ずつ洗浄します。
    4. ブロッキングバッファーで60〜90分間ブロック(10%FBS;1%BSA;0.0025%魚皮ゼラチン、0.05%PBST、すなわち0.05%のTween-20を持つPBS)。
    5. それぞれエンドムチンとTMRを標的とする一次ラットとウサギ抗体の混合物でサンプルをインキュベートし、PBST 3x、2分で洗浄する。
    6. ラットIgG(Alexa-647に結合)とウサギIgG(Alexa-488に結合)に対する二次ロバ抗体の混合物でサンプルをインキュベートし、PBST 3x 2分でそれぞれ洗浄します。
    7. 定期的なDAPI染色(すなわち、5〜6分間のDAPI溶液への浸漬)を実行し、グリセロールフリーの「ハード」取り付け媒体を使用してスライドを取り付け、スキャンするまで暗い場所に保管します。
    8. 最適な結果を出すには、デジタルスライドスキャナのスライドをスキャンします。
  3. 画像解析
    1. デジタル病理に適したソフトウェアを使用して、ケースごとに10の高電力フィールド(HpF)をキャプチャします。
    2. エンドムシン(赤)チャンネルとTMR(グリーン)チャンネルをTIFFとして別々に保存します。
    3. ImageJ を使用して、TIFF ファイルをアップロードし、8 ビット イメージに変換します。
    4. 8ビット画像を負のコントロールのレベルにしきい値し、2つのバイナリ化画像を生成し、エンドムチンとTMRの「マスク」を示す。
    5. バイナリツールから、[エンドムシン マスクの穴を埋める]を選択します。
    6. 次の5つの領域を生成して保存する:1)閾値デキストラン画像を「デキストランROI」(ROI1)、2)閾値内膜画像を「血管ROI」(ROI2)、3)逆エンドムチン画像を「血管外ROI」(ROI3)、4)交差した「「血管外ROI」および「デキストランROI」画像(ROI1・ROI3)を「血管外デキストランROI」(ROI4)として、5)画像全体を「腫瘍ROI」(ROI5)として用いる。
    7. ROI4領域をROI5領域で分割し、100を掛けて、腫瘍全体で血管外デキストランがカバーするパーセント領域を生成します。
    8. ケースごとに10~20個のHPFのプロセスを繰り返し(組織の利用可能性に応じて)、各ケースの平均血管外デキストラン(%面積)を生成します。

結果

このプロトコルの記事で説明する実験手順を簡単に要約し、図 1A-Cに示します。

TMEM媒介血管透過性(「破裂活性」)を測定し、血管透過性の他のモードからの実験ノイズを低減するために(すなわち、細胞間および細胞間細胞を横断的に、導入で説明したように)、静脈内(すなわち)を行った。155 kDa Dextranのような高分子量プローブの注入は...

ディスカッション

ここでは、TMEM出入り口に存在し、血管タイトおよび接着接合部の破壊に関連する特定のタイプの血管透過性を可視化および定量化するために適用できる2つのプロトコルを概説する。このタイプの血管透過性は、上述の5として、三者TMEM細胞複合体によって一過性および制御される。TMEM関連血管透過性を同定し定量する能力は、転移性癌細胞微小環境の評価、ならびに腫瘍?...

開示事項

著者らは利益相反を明らかにしていない。

謝辞

アルバート・アインシュタイン医科大学の分析イメージング施設(AIF)に対し、イメージング支援を行ってくださったことに感謝します。この研究は、NCI(P30CA013330、CA150344、CA100324、CA216248)、SIG 1S10OD019961-01、グラスリッパーバイオフォトニクスセンターとその統合イメージングプログラム、モンテフィオレのルース・グラント・グラント・グラント・グラントの助成金によって支えられた。腫瘍微小環境の研究のため(CA200561)。

GSKは原稿を共同執筆し、図1Cおよび3Bのイメージングを行い、固定組織分析プロトコルを開発し、すべてのデータを分析および解釈した。JMPは原稿を共同執筆し、図1B、2C及び3Aの手術及びインビタルイメージングを行った。LB & ACは、図 2B の手術とバイタルイメージングを行いました。RJは図2Aの手術およびインビタルイメージングを行った。JSCは原稿を共同執筆し、すべてのデータを分析・解釈した。MHOは原稿を共同執筆し、すべてのデータを分析し、解釈しました。DEは図2Dの手術とインビタルイメージングを行い、原稿を共同執筆し、固定組織解析とインビタルイメージングプロトコルを開発し、すべてのデータを分析および解釈した。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-rabbit IgG (Alexa 488)Life Technologies CorporationA-11034
Anti-rat IgG (Alexa 647)Life Technologies CorporationA-21247
Bovine Serum AlbuminFisher ScientificBP1600-100
CitrateEng Scientific Inc9770
Cover Glass SlipsElectron Microscopy Sciences72296-08
Cyanoacrylate AdhesiveHenkel Adhesive1647358
DAPIPerkin ElmerFP1490
Dextran-Tetramethyl-RhodamineSigma AldrichT1287
DMEM/F12Gibco11320-033
Endomucin (primary antibody)Santa Cruz Biotechnologysc-65495
EnrofloxacinBayer84753076 v-06/2015
Fetal Bovine SerumSigma AldrichF2442
Fish Skin GelatinFisher ScientificG7765
Insulin SyringeBecton Dickinson309659
IsofluoraneHenry ScheinNDC 11695-6776-2
MatrigelCorningCB40234Artificial extracellular matrix
Needle (30 G)Becton Dickinson305128
Phosphate Buffered SalineLife Technologies CorporationPBS
Polyethylene TubingScientific Commodities IncBB31695-PE/1
Pulse OximeterKent ScientificMouseOx
Puralube Vet OintmentDechraNDC 17033-211-38
Quantum DotsLife Technologies CorporationQ21561MP
RubberMcMaster Carr1310N14
TMR (primary antibody)InvitrogenA6397
Tween-20MP BiologicalsTWEEN201
XyleneFisher Scientific184835

参考文献

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